Generalites sur lsteroides et terpenoides, le paludisme, les antioxydants et la microbiologie

GENERALITES SUR LES STEROIDES ET TERPENOIDES, LE PALUDISME, LES ANTIOXYDANTS ET LA MICROBIOLOGIE 

LES STEROIDE

Les stéroïdes sont des triterpènes tétracycliques qui ont perdu au moins trois radicaux méthyles. Ils ont un squelette  » perhydrocyclopentano-phénanthrène « , avec une chaîne latérale fixée en C17 .

LES TERPENOIDES

Les terpènes englobent tous les composés issus de la condensation de la molécule d’isoprène (C5H8) ou méthyl-2-buta-1,3-diène .

Selon le nombre de ces entités isopréniques, les terpènes sont classés en monoterpènes à 10 carbones, sesquiterpènes à 15 carbones, diterpènes à 20 carbones, triterpènes à 30 carbones etc. La figure 7 présente la classification de quelques structures terpéniques. Les monoterpènes et les sesquiterpènes les plus volatils sont les seuls terpènes qui peuvent être rencontrés dans les HE. Ils constituent entre autre les principes odoriférants des végétaux. Les HE peuvent renfermer quelques dizaines à plus d’une centaine de constituants. Les terpènes peuvent porter des fonctions oxygénées telles que l’aldéhyde (Citronellal), l’alcool (le géraniol), l’éther (1,8-cinéole), l’ester (acétate de linalyle), la cétone (Menthone).

LE PALUDISME

Description

Le paludisme (du latin palus, paludis, marais), appelé aussi malaria (de l’italien mal’aria, mauvais air), est une parasitose due à un protozoaire transmis par la piqûre d’un moustique du genre Anophèles. Cette maladie surtout importante pour les populations vivant en zone d’endémie (zone intertropicale), l’est aussi pour les voyageurs. Elle est la cause d’environ deux millions de décès chaque année dans le monde. Les cinq espèces connues responsables de la maladie sont : le Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et Plasmodium knowlesi. P. falciparum est celui qui est le plus largement répandu à travers le monde. Il développe des résistances aux antipaludiques et est le responsable des formes cliniques potentiellement mortelles.

La phase sanguine du cycle rend possible d’autres modes de contamination : transmission congénitale, transfusionnelle, par greffe d’organe ou transmission accidentelle chez des personnels de santé manipulant du sang contaminé. En pratique, ces transmissions sont exceptionnelles et n’influence pas l’épidémiologie.

Les antipaludéens 

Les antipaludéens peuvent être classés selon la localisation de leur action dans le cycle de vie des plasmodiums, qui passent par les stades successifs suivants : sporozoïte (forme injectée par le moustique), mérozoïte (forme libérée par le foie), schizonte (forme de multiplication dans les globules rouges) et gamétocyte (future cellule reproductrice). On distingue sur cette base deux grands types d’antipaludéens : les schizontocides, qui agissent sur les schizontes, et les gamétocytocides, actifs sur les gamétocytes. Les premiers permettent de lutter contre les symptômes du paludisme, les seconds de contrer la transmission du parasite. Les molécules qui s’attaquent aux mérozoïtes sont pour l’instant très peu utilisées en raison de leur forte toxicité pour le foie.

ACTIVITES ANTIOXYDANTES 

Définitions et propriétés

Les antioxydants sont des agents naturels ou chimiques qui réduisent ou neutralisent l’oxydation. En d’autres termes, on désigne par antioxydant toute substance qui retarde ou prévient de manière significative l’oxydation du substrat. Les antioxydants vont ainsi réduire les radicaux libres qui sont dangereux pour l’organisme en raison de leur pouvoir oxydant très élevé. En plus, les antioxydants sont des agents redox qui réagissent (effet Scavenger) avec les oxydants et soit stoppent, soit ralentissent les processus d’oxydation. Les antioxydants les plus connus sont le β-carotène (provitamine A), l’acide ascorbique (vitamine C), le tocophérol (vitamine E) ainsi que les composés phénoliques. En effet, la plupart des antioxydants de synthèse ou d’origine naturelle possèdent des groupes hydroxyphénoliques dans leurs structures et les propriétés antioxydantes sont attribuées en partie, à la capacité de ces composés naturels à piéger les radicaux libres tels que les radicaux hydroxyles (OH•) et superoxydes (O2•).

Radicaux libres

Les radicaux libres sont des atomes ou des molécules portant un électron non apparié. Cette propriété rend ces éléments très réactifs du fait de la tendance de cet électron à se réapparier, déstabilisant ainsi d’autres molécules. Les molécules ainsi transformées deviennent à leur tour d’autres radicaux libres et initient ainsi une réaction en chaîne.

CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE 

Matériels et méthodes

Des feuilles et des tiges de Beilschmiedia microphylla ont été collectées à Itremo, District d’Ambatofinandrahana, dans la région de Moron’ I Mania, Faritany de FIANARANTSOA à 1341m d’altitude et dont les coordonnées GPS sont 20° 35′ 31″ Sud 46° 38′ 06″ Est. La récolte des feuilles à été effectuées en 3 étapes en mois d’Octobre 2012 (période sèche), Novembre 2012 (période sèche) et en mois d’Avril 2013 (période pluvieuse). La période de floraison se situe pendant la saison de pluie, entre Décembre et Mars. La méthode d’analyse classique de FONG et al. [33] a été mise à profit pour le criblage phytochimique c’est à dire la détermination des grandes familles chimiques pouvant être présentes dans les feuilles et tiges de Beilschmiedia microphylla.

Les matériels utilisés ont été :
– balance METTLER TYPE AM100, de portée max=100g ;
– balance METTLER TYPE AM 300 de portée max=300g ;
– bain thermostaté MEMMERT à température réglable de 20°C à 110°C ;
– tubes à essai en verre borosilicaté ;
– verreries de laboratoire.

ETUDE DE L’HUILE ESSENTIELLE DES FEUILLES DE Beilschimiedia microphylla

Obtention et cinétique de l’extraction de l’Huile Essentielle 

L’obtention de l’huile essentielle à partir des feuilles fraîches a été réalisée à l’aide d’un essencier de CLEVENGER type huile légère (figure 9). La méthode utilisée a été l’hydrodistillation. A cet effet, un échantillon de matériel végétal est introduit dans un ballon de 2l contenant 1l d’eau. Quelques grains de pierre ponce ont été ajoutés. L’ensemble a été porté à ébullition. La première goutte de condensat marque le début de l’opération. On note le volume cumulé d’HE en fonction du temps, ce qui permet d’établir la courbe de la cinétique d’extraction. On arrête la distillation quand le volume cumulé est pratiquement constant.

Analyse de l’Huile Essentielle

La CPG et CPG-SM ont été les méthodes utilisées pour l’analyse de l’huile essentielle des feuilles. Les deux techniques permettent de déterminer la composition qualitative et quantitative de l’huile. Dans le présent travail, l’identité des constituants majoritaires a été fixée en premier lieu par la méthode des Indice de Kovats. Il s’agit d’un indice qui caractérise un composé élué en chromatographie en phase gazeuse. Il est calculé sur la base des temps de rétention obtenus à partir du chromatogramme du HE/paraffines.

Conditions opératoires :
→ Préparation de l’échantillon, 2µl de l’huile essentielle pure a été dissoute dans 100µl d’hexane. 0,2µl de cette solution a été injectée. On obtient le chromatogramme A de l’HE pure.
→ Préparation du mélange d’alcanes de référence, 1µl de chaque alcane est dissout dans 100µl d’hexane.
→ Pour la coinjéction, dans une même seringue, on introduit 0,2µl du mélange d’alcanes (C6 à C20) et 0,2µl de la solution d’HE à 2%. Après injection, on obtient le chromatogramme B du mélange HE et d’alcanes.

Les IK des quatre composés majoritaires de l’huile essentielle ont été calculés et comparés aux valeurs données par la littérature. L’appareillage utilisé est un Chromatographe en Phase Gazeuse de type PerkinElmer Clarus 580 dont les conditions d’analyse sont :

Colonne capillaire : OV 101(30m, 0,32mm, 0,32µm)
Gaz vecteur : Hélium
Elévation de température : 2°C/mn
Température de l’injecteur : 230°C
Mode d’injection : Split 1/20
Température du détecteur FID : 250°C

Les hypothèses de structures établies à partir des IK pour des produits majoritaires dans l’huile essentielle, ont été vérifiées par CPG-SM.

Table des matières

INTRODUCTION
PARTIE I : TRAVAUX ANTERIEURS SUR LA PLANTE
I.1.Données botaniques
I.1.1.Classification phylogénétique
I.1.2.La famille LAURACEAE
I.1.3.Le genre Beilschmiedia
I.1.4.Description de l’espèce mirophylla
I.2.Travaux antérieurs sur le genre Beilschmiedia
PARTIE II : GENERALITES SUR LSTEROIDES ET TERPENOIDES, LE PALUDISME, LES ANTIOXYDANTS ET LA MICROBIOLOGIE
II.1.Les stéroïdes
II.2.Les terpénoïdes
II.3.Le paludisme
II.3.1. Description
II.3.2. Les antipaludéens
II.4. Activités antioxydantes
II.4.1. Définitions et propriétés
II.4.2. Radicaux libres
II.5. Activité antibactérienne
PARTIE III : TRAVAUX PERSONNELS
Chapitre 1 : Criblages phytochimiques
III.1. Criblage phytochimique
III.1.1. Matériels et méthodes
III.1.2. Résultats et discussions
Chapitre 2 : Etudes de l’huile essentielle
III.2. Etude de l’huile essentielle des feuilles de Beilschimiedia microphylla
III.2.1.Obtention et cinétique d’extraction de l’Huile Essentielle
III.2.2 Analyse de l’Huile Essentielle
III.2.3. Résultats et discussion
III.2.3.1. Etude cinétique de l’HE
III.2.3.2. Analyse par CPG
III.2.3.3. Analyse par CPG-SM
II.2.3.4. Interprétation des spectres de masse des quatre composes majoritaires
β-caryophyllène
Limonène
β-myrcène
(E)-β-ocimène
Chapitre 3 : Etudes de l’extrait des feuilles
III.3. Etude de l’extrait des feuilles de Beilschmiedia microphylla (HE2847F112)
III.3.1. Isolement et analyse structurale du produit HE2847F112-II
III.3.1.1. Obtention de l’extrait étudié HE2847F112-II
III.3.1.2. Analyse structurale de HE2847F112
Spectre RMN 1H
Spectre RMN 13C (Broad Band Decoupling)
Procédure de l’analyse spectrale
III.3.2. Résultats et discussions
III.3.2.1.Résultats de l’obtention de HE2847F112-II
III.3.2.2. Analyse structurale
Identification des spectres
Interprétation des spectres
Identification du solvant
Elucidation structurale de HE2847F112-II
Chapitre 4 : Travaux biologiques
III.4. Etudes biologiques
III.4.1. Matériels
III.4.1.1. Les germes utilisés
III.4.1.2. Milieux de cultures
III.4.1.3. Extraits à tester
III.4.2. Méthodes
III.4.2.1. Tests antiplasmodiaux
III.4.2.1.1. Culture des parasites
III.4.2.1.2. Evaluation de l’activité antiplasmodiale
III.4.2.2. Tests antioxydants
III.4.2.2.1. Evaluation préliminaire par la méthode bioautography
Principe de la méthode bioautography
Mode opératoire
III.4.2.2.2. Evaluation de l’activité antioxydant par la méthode de DPPH
Principe de la méthode de DPPH
Mode opératoire
III.4.2.2.3. Evaluation de l’activité antioxydant par la méthode d’ORAC
La méthode d’ORAC
Mode opératoire
III.4.2.3. Evaluation des activités antimicrobiennes
III.4.2.3.1. L’antibiogramme
III.4.2.3.2. Méthode de disque
III.4.2.4.La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et la Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
III.4.2.4.1. Détermination de la CMI et de la CMB
III.4.2.4.2. Evaluation des activités anti-moisissures
III.4.3. Résultats de l’étude Biologique et Microbiologique
III.4.3.1.Résultats des analyses antiplasmodiales de Beilschmiedia microphylla
III.4.3.2.Evaluation des activités antioxydantes de Beilschmiedia microphylla
III.4.3.2.1. Evaluation préliminaire (test par CCM)
III.4.3.2.2. Activité antioxydante par la méthode de DPPH
III.4.3.2.3. Activité antioxydant par la méthode d’ORAC
III.4.3.3. Evaluation des activités antimicrobiennes
III.4.3.3.1. Evaluation de l’activité antibactérienne des extraits HE2847F et HE2847F2
III.4.3.3.2. Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et Concentration
Minimale Bactéricide (CMB) des extraits HE2847F et HE2847F2 sur les bactéries
CMI des extraits HE2847F et HE2847F2 sur les bactéries (concentration des extraits entre 3,42 à 3500µg/ml)
Détermination des CMB des extraits HE2847F et HE2847F2
III.4.3.4.Evaluations de l’activité antifongique des extraits HE2847F et HE2847F2
III.4.3.4.1. Effets des extraits sur les levures
III.4.3.4.2. Effets de l’extrait brut sur la croissance des champignons filamenteux
CONCLUSION GENERALE

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