Généralités sur l’immunité anti-tuberculeuse

GÉNÉRALITÉS SUR L’IMMUNITÉ ANTI-TUBERCULEUSE 

Comme M. tuberculosis est un parasite intracellulaire facultatif, l’organisme infecté se protège principalement par une immunité à médiation cellulaire [SHE Kaufmann, 2002].

IMMUNITÉ À MÉDIATION CELLULAIRE

Après inhalation de gouttelettes infestées par des BK, le premier contact avec le système immunitaire se fait au niveau des macrophages alvéolaires. Les germes de M. tuberculosis sont alors internalisés par les macrophages. Ces derniers peuvent servir de refuge pour les bactéries. La plupart des bactéries internalisées vont en effet échapper à la lyse phagocytaire et utiliser le macrophage comme habitat pour se multiplier. La multiplication du bacille dans la vacuole du macrophage conduit à la destruction de celui-ci et à la libération de nombreux bacilles qui seront à leur tour phagocytés par d’autres monocytes et macrophages (figure 1a). Les BK libres ou phagocytés vont s’extravaser vers le sang périphérique, puis migrer par voie lymphatique vers les ganglions lymphatiques drainants où ils vont interagir avec les différents types de lymphocytes T (CD4+ et CD8+) qui, activés, vont se multiplier localement. L’interaction entre les antigènes présentés par les cellules présentatrices d’antigènes, et les récepteurs des cellules T, vont servir de signal d’activation de celles-ci. Ces lymphocytes sensibilisés vont proliférer et secréter les lymphokines médiatrices comme le TGF-β [Boom et al., 1992]. Celles-ci vont notamment activer les macrophages qui vont produire l’IL-12 orientant les lymphocytes T CD4+ vers une différenciation en lymphocytes T auxiliaires ou T « helper » (Th) de type Th1 (T « helper type 1 »). La réponse Th1 est notamment caractérisée par la sécrétion d’Interféron gamma (IFNγ) et de « Tumor Necrosis Factor alpha » (TNFα) [S Sharma et M Bose, 2001] (figure 1b). L’IFN γ est une lymphokine activant les macrophages. Ces derniers enclenchent alors leur activité bactéricide et la phagocytose des pathogènes internalisés. L’IFN γ facilite aussi la prolifération des cellules T CD 4+ et des cellules T cytolytiques. Ces dernières ont une activité lytique directe sur les cellules infectées [Flynn et al., 1993]. L’IFN γ tient donc une place prépondérante dans l’immunité anti-tuberculeuse et peut, par ailleurs, servir pour le diagnostic de l’infection à M. tuberculosis [Schwander et al., 2000]. Le TNFα a la capacité d’induire la production de chémokines chez les monocytes/macrophages. De plus, il est impliqué dans l’expression de gènes d’oxydants cellulaires qui vont induire la mort ou la nécrose d’une cellule infectée et contribuer à la diminution et à la limitation du parasitisme intracellulaire de M. tuberculosis [Zganiacz et al., 2004]. Le TNFα est également à l’origine de la formation du granulome où l’environnement est très peu favorable à la multiplication des BK à cause du pH acide et de l’anoxie qui y subsiste.

D’autres effecteurs cellulaires interviennent dans l’immunité anti-tuberculeuse par leur activité cytolytique. Ce sont les cellules Tγ/δ , les cellules NK (« natural killer »), et les cellules T CD8+. Le rôle de ces cellules est de réduire la prolifération des mycobactéries intracellulaires en éliminant leur habitat, c’est-à-dire la cellule infectée [Thoma-Uszynski et al., 2000] (figure 1c). Selon la capacité des cellules du système immunitaire à contrôler la croissance des bacilles, la lésion tuberculeuse va s’étendre ou au contraire régresser. Dans environ 10% des cas, un sujet infecté échappera au contrôle immunitaire et développera la tuberculose maladie. Dans 90% des cas, la « tuberculose infection » est asymptomatique. L’organisme contrôlera la prolifération des bactéries et la lésion tuberculeuse va se calcifier. Cependant, certains bacilles ayant un métabolisme extrêmement ralenti pourront survivre. Ces bacilles, dits quiescents ou persistants (figure 1d), pourront se développer à nouveau sous l’influence de différents facteurs (induisant une baisse de l’immunité). Le sujet présentera alors une tuberculose secondaire [Mohan et al., 2001].

L’APOPTOSE

(JC Ameisen, 2000 ; E White, 1996 ; M Holcik, 2001 ; Wanchu et al., 2004 ; Benesch et al., 2003) .

L’apoptose, également qualifiée de « mort cellulaire programmée » ou de « suicide cellulaire », est définie comme étant l’autodestruction génétiquement programmée des cellules. Elle cause la mort de dizaine de milliards de cellules chaque jour chez les organismes. L’apoptose est déclenchée par différents facteurs extracellulaires, intracellulaires, physiques ou chimiques, qui activent l’expression de gènes apoptotiques induisant une série de réactions cellulaires spécifiques en « cascade », entraînant des changements morphologiques de la cellule. L’issue de ces changements cellulaires est la mort de la cellule. Ces modifications cellulaires comprennent la compression cellulaire, la condensation de la chromatine, la fragmentation du noyau cellulaire et la formation des « corps apoptotiques » (issus du bourgeonnement de la membrane cytoplasmique). Les stimuli à l’origine du  phénomène d’apoptose peuvent être des facteurs de mort spécifiques, comme certains ligands spécifiques de mort cellulaire, les molécules Fas-L (ou CD95-L) et le TNF. Ce sont aussi les facteurs environnementaux ou les dommages subis par l’ADN entraînant la mort de la cellule endommagée. L’interaction des signaux de mort cellulaires avec leurs récepteurs cellulaires active certaines enzymes apoptotiques (figure 2a). Ces enzymes sont des caspases ou des interleukines convertases comme la protéine FLICE (Fas-associated DD protein(FADD)-Like Interleukine Convertase Enzyme), qui vont activer à leur tour d’autres enzymes. La cascade de réaction qui s’en suit va aboutir au clivage de protéines de régulation, et donner les changements typiques des cellules apoptotiques. D’autres protéines d’origine mitochondriale comme celles de la famille Bax favorisent aussi les réactions apoptotiques. Enfin, les stimuli peuvent aussi être des facteurs de survie des cellules, impliqués dans le développement normal d’un individu : les protéines inhibitrices des caspases, comme le FLIP (FLICE Inhibitor Protein), ou des protéines d’origine mitochondriale comme ceux de la famille Bcl-2 agissant vers la fin de la chaîne réactionnelle (figure 2b). Le phénomène d’apoptose est particulièrement important dans le maintien de l’intégrité de l’organisme, et est tout aussi essentiel au développement normal. Le dérèglement de l’apoptose peut entraîner des troubles graves, allant de la létalité embryonnaire au cancer. L’apoptose joue aussi un rôle crucial dans la régulation du système immunitaire. En effet, elle intervient déjà dans la sélection et la différenciation des lymphocytes au niveau du thymus. Elle est également omniprésente dans la lutte de l’hôte contre certaines maladies, notamment dans l’élimination des cellules infectées par les pathogènes. Enfin, l’apoptose tient un rôle important dans l’inhibition de l’action des effecteurs cellulaires. La persistance incontrôlée de ces derniers peut en effet entraîner les maladies auto-immunes.

RÔLE DE L’APOPTOSE DANS L’IMMUNITÉ ANTI-TUBERCULEUSE

L’infection à M. tuberculosis, parasite intracellulaire, engendre essentiellement une immunité à médiation cellulaire et l’apoptose tient une place prépondérante dans la résistance de l’hôte infecté face à l’infection bactérienne [Rook et al., 2001].

L’apoptose comme mécanisme de défense de l’hôte

L’apoptose est d’abord un mécanisme de défense de l’hôte contre M. tuberculosis. En effet, le système immunitaire de l’hôte induit l’apoptose des cellules infectées par la bactérie, limitant ainsi la croissance des microorganismes au sein de ces cellules [Gil et al., 2003]. L’apoptose est notamment observée au sein des macrophages alvéolaires humains parasités par le bacille de Koch [Keane et al., 1997], ainsi que dans les cellules mononuclées infectées du sang périphérique en général [Aleman et al., 2002 ]. L’induction de l’apoptose par M. tuberculosis se fait par la libération de médiateurs chimiques apoptotiques par les cellules infectées. Après s’être fixés sur leurs récepteurs cellulaires, ces ligands vont génétiquement activer la mort d’autres cellules infectées. Le TNFα sécrété par certaines cellules mononuclées induit, par l’intermédiaire de son récepteur cellulaire TNFR1, l’expression de certains gènes apoptotiques comme Bcl-w chez les cellules infectées [Spira et al., 2003]. Le contact entre M. tuberculosis et sa cellule hôte active aussi l’expression de gènes pro apoptotiques chez les cellules infectées. Ces gènes codent notamment pour des effecteurs apoptotiques comme les protéines Bax, ou pour des protéines de la famille des caspases, comme la protéine FLICE liée au récepteur Fas [Oddo et al, 1998; Perskvist et al, 2002] (figure 2). Des observations faites chez des patients tuberculeux montrent également que l’interaction bactérie/cellule-hôte inhibe l’expression de gènes anti-apoptotiques (codant pour des protéines de la famille Bcl 2), favorisant ainsi la mort cellulaire [Fayyazi et al., 2000]. Certaines glycoprotéines de la paroi bactérienne, comme le p19, induisent également la mort cellulaire après s’être fixées sur un récepteur spécifique [Lopez et al., 2003]. Ces glycoprotéines induisent la libération d’interleukine (notamment l’IL-12) pouvant activer les macrophages et causer l’apoptose des cellules infectées [Dao et al, 2004]. La mort des cellules parasitées par M. tuberculosis réduit la viabilité des parasites, et permet ainsi d’annihiler leur multiplication [Aleman et al., 1997].

Mécanismes anti-apoptotiques utilisés par M. tuberculosis

Afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte, M. tuberculosis déploie des mécanismes anti-apoptotiques, préservant les cellules infectées de toute mort cellulaire. Ces mécanismes anti-apoptotiques assurent ainsi le parasitisme intracellulaire de la bactérie [Keane et al., 2000]. La bactérie peut en effet activer l’expression de gènes anti-apoptotiques, stoppant la mort cellulaire à différents niveaux. Ces gènes codent notamment pour des protéines inhibitrices de la famille Bcl-2 ou pour des inhibiteurs de caspases, comme la protéine FLIP. Sly et al. (2003) ont mis en évidence ce phénomène chez des macrophages infectés par des souches virulentes de M. tuberculosis, résistants à l’apoptose. Certains composants de la paroi bactérienne comme le lipoarabinomannane inhibent directement les effecteurs apoptotiques comme la protéine Bad par phosphorylation. M. tuberculosis préserve aussi son hôte par la production de cytokines ou de protéines anti apoptotiques voire immunosuppressives. Certaines cellules infectées sécrètent en effet le récepteur circulant du TNFα, le TNFR2. Une fois libéré, ce récepteur neutralise le ligand TNFα et l’empêche de se fixer sur son récepteur cellulaire TNFR1, inhibant ainsi la mort de la cellule-hôte [Balcewiczsablinsk et al., 1998].

Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITES
I. Généralités sur la tuberculose
1. Etiologie
2. Transmission et épidémiologie
3. Prévention
II. Généralités sur l’immunité anti-tuberculeuse
1. Immunité à médiation cellulaire
2. L’apoptose
3. Rôle de l’apoptose dans l’immunité anti-tuberculeuse
a. L’apoptose comme mécanisme de défense de l’hôte
b. Mécanismes anti-apoptotiques utilisés par M. tuberculosis
c. Apoptose des cellules immunitaires
d. Choix des marqueurs immunologiques à étudier
III. Généralités sur la PCR en temps réel
1. Définitions
2. Principe de l’analyse de la fluorescence avec les sondes TaqMan™
3. Applications de la PCR en temps réel
MATERIELS ET METHODES
I. Matériels biologiques
1. Recrutements des sujets de l’étude
2. Prélèvement de sang
II. Réactifs et tampons
1. Réactifs pour l’extraction des ARN
a. Le kit Paxgene™ Blood RNA (PreAnalytix™)
b. La RNase-Free DNase I (Qiagen, réf 79254)
2. Réactifs pour le dosage et le contrôle des ARN extraits
3. Réactifs pour la transcription reverse
a. Le kit Omniscript® Reverse Transcription
b. Amorce oligo(dT)
c. L’inhibiteur de RNase
4. Réactifs de la PCR en temps réel
a. Les amorces et les sondes
b. Le Master mix
c. Les ADN standards
III. Méthodes
1. Extraction des ARN totaux
a. Principe
b. Méthode d’extraction
i. Contrôle de l’activité des RNases : (Selon Sambrook et al., 1989)
ii. Mode opératoire : (selon le manuel d’utilisation du kit Paxgene)
c. Dosage des ARN extraits par spectrophotométrie
i.Principe
ii. Technique
d. Détermination de l’intégrité des ARN extraits par électrophorèse sur gel dénaturant de Formaldéhyde-Agarose (FA)
i.Principe
ii. Technique
2. Quantification des ARNm par la RT-PCR en temps en temps reel
a. Transcription reverse
b. La PCR en temps réel
i. Appareillage : le Rotor-Gene 3000
ii. Principe de la quantification des produits PCR en temps réel
iii. Technique
iv. Analyse de la PCR en temps réel
3. Détermination de l’infection à M. tuberculosis chez les sujets
4. Analyse des données
RESULTATS
CONCLUSION

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