Soutenance mémoire
Généralités sur les Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH)
Circonstances de découverte des VIH
Il n’existe pas « un » mais « des » VIH, qui possèdent tous une organisation génomique et une structure communes. En 1981, le CDC (Center for Disease Control and Prevention), correspondant à l’agence fédérale des Etats-Unis pour le contrôle et la prévention des maladies, a diffusé une alerte sur une épidémie en cours depuis la fin des années 1970 à New York, San Francisco et Los Angeles, survenant chez des jeunes patients, homosexuels ou usagers de drogues intraveineuses, anormalement immunodéprimés [1] . Cette épidémie était caractérisée par des cas de sarcomes de Kaposi, de pneumonies à Pneumocystis jirovecii et d’autres infections opportunistes et a d’abord été appelée syndrome gay puis Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA). Au début des années 1980, des cas similaires surviennent aussi en France, chez des patients hémophiles, et l’hypothèse d’une origine virale a rapidement été privilégiée. Le premier VIH a été isolé en 1983 à l’Institut Pasteur, à Paris, et avait été baptisé LAV (pour Lymphadenopathy Associated Virus) et HTLV-III (pour Human T Lymphotropic Virus) [2, 3] . La dénomination de VIH est adoptée en 1986 par la communauté scientifique. L’existence et la circulation d’autres variants, génétiquement et/ou antigéniquement différents, ont été mises en évidence par la suite, nécessitant l’établissement d’une classification en types et en groupes. La découverte, la même année, d’un autre VIH présentant une forte divergence génétique, par rapport à la première souche isolée, a ainsi conduit à la différenciation en VIH de type 1 (VIH-1) et de type 2 (VIH-2) [4] . La mise en évidence d’autres virus présentant des divergences génétiques moins marquées, mais notables, a conduit à la définition de quatre groupes de variants VIH-1. Le premier correspondait à celui lié à la première souche découverte en 1983, devenu majoritaire, et a été désigné VIH-1 de groupe M (VIH-1/M) pour « Major ». Les trois autres groupes, tous identifiés chez des personnes d’origine camerounaise, ont été classés en groupe O (VIH-1/O) pour « Outlier » en 1994 [5, 6], en groupe N (VIH-1/N) pour « Non M, non O » en 1998 [6] et enfin, plus récemment, en groupe P (VIH-1/P) en 2009 [7], afin de suivre la nomenclature existante.
Caractéristiques virologiques
Les VIH ont tous en commun d’être des virus enveloppés, mesurant entre 90 et 120 nanomètres de diamètre. Leur génome est constitué de deux molécules d’ARN monocaténaire structuralement identiques et de polarité positive. Ils appartiennent à la famille des Retroviridae, à la sous-famille des Orthoretrovirinae et au genre lentivirus. Cette grande famille des Retroviridae est caractérisée par la présence d’une enzyme spécifique, la transcriptase inverse (TI), permettant la transcription inverse ou rétrotranscription de son génome viral d’ARN monocaténaire en ADN bicaténaire, et par l’intégration de ce dernier dans l’ADN chromosomique de la cellule-hôte .
Particule virale
La structure de la particule virale de VIH est étroitement liée au cycle de réplication du virus. Chacune de ses étapes est, en effet, gouvernée par une ou plusieurs protéines virales, qui permettent son bon et complet déroulement. Chaque particule virale contient deux brins d’ARN de structure génomique identique mais de séquence génétique différente. Le virus est donc hétéro diploïde. De plus, elle comporte trois éléments structuraux : l’enveloppe, la matrice et la capside .
L’enveloppe correspond à une bicouche de phospholipides, issue de membranes cellulaires, associés à deux glycoprotéines virales : la gp120 et la gp41. Ces glycoprotéines d’enveloppe (Env) sont initialement traduites en une glycoprotéine précurseur, la gp160, qui est ensuite traitée et clivée au cours de son transport, via la voie sécrétoire, pour donner la gp120 et la gp41. La gp41, ancrée dans la membrane, est liée de manière non covalente à la sous-unité de surface gp120, qui possède 5 régions hypervariables (de V1 à V5). Les glycoprotéines d’enveloppe ont un rôle essentiel dans l’attachement du virus au récepteur CD4 de la cellule et dans la fusion avec la membrane cellulaire.
La matrice, formée par la polymérisation de la protéine p17, tapisse la face interne del’enveloppe, entoure la capside. Entre la matrice et la capside se situe la Protéase (PR) p15, enzyme virale participant à la maturation des virions néoformés. La capside, en forme de cône tronqué, provient de l’assemblage de la protéine p24. La capside protège la nucléocapside, formée de l’association des deux brins d’ARN avec des nucléoprotéines p7. A l’intérieur de la capside, la TI (p66/p51), enzyme clé intervenant en début de cycle de réplication, est associée à l’Intégrase (IN) p31, enzyme permettant l’intégration de l’ADN proviral au génome de la cellule-hôte.
Organisation du génome
D’une longueur de 9200 paires de bases (pb) environ, le génome ARN du VIH possède trois cadres de lectures ouverts, chevauchants (FIGURE 2). Après transcription inverse de l’ARN viral en un ADN double brin et intégration à l’ADN de la cellule-hôte, le génome proviral obtenu est flanqué de chaque côté, en 5’ et en 3’, par des séquences terminales longues répétées identiques nommées LTRs (pour Long Terminal Repeat) et mesure environ 9700 pb. Les 5’ et 3’LTRs du VIH-1 ont une longueur d’environ 650 pb et sont chacun composés des trois mêmes régions : U3 (unique en 3’ de l’ARN), R (répétée aux deux extrémités de l’ARN) et U5 (unique en 5’ de l’ARN) (FIGURE 2). Ces séquences participent à l’intégration de l’ADN proviral, à la réplication et à l’expression du génome viral [8] . La séquence promotrice, responsable de la transcription de l’ARN viral, est celle localisée dans la région LTR à l’extrémité 5’ du génome. Etant donné le contexte de séquence, les signaux de terminaison de la transcription et de polyadénylation, quant à eux, se forment exclusivement dans la région LTR à l’extrémité 3’.
Le génome viral comporte trois principaux gènes, gag, pol, et env, codant respectivement pour les protéines de structure interne (Matrice, Capside et Nucléocapside), les enzymes de réplication virale (PR, TI et IN) et les deux glycoprotéines d’enveloppe (gp120 et g41). Le génome viral comporte également des gènes de régulation, tat et rev, qui codent pour des protéines ayant un rôle essentiel dans le cycle viral et le pouvoir pathogène du virus, et enfin quatre gènes accessoires, vif, vpr, vpu (VIH-1) ou vpx (VIH-2) et nef (FIGURE 2). Les protéines accessoires Vif, Vpr, Vpu/Vpx et Nef, qui résultent de l’expression de ces quatre gènes, possèdent diverses fonctions, telles que l’augmentation de l’infectiosité virale, la perturbation des voies cellulaires, l’échappement à la détection immunitaire innée et la neutralisation de l’activité antivirale des facteurs de restriction cellulaires de l’hôte. En 2016, l’existence d’un dixième gène nommé asp (Anti-Sense Protein) a été mise en évidence dans le génome du VIH-1. Ce gène est chevauchant avec celui de l’enveloppe et code pour la protéine anti-sens. Conservé tout au long de l’évolution, il semble spécifique des virus humains pandémiques (VIH-1/M), mais sa fonction demeure inconnue .
Cycle de réplication virale
Déroulement de la réplication virale
Les cellules exprimant à leur surface des récepteurs CD4, tels que les lymphocytes T CD4+, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules de la microglie cérébrale, sont les cibles potentielles d’une infection à VIH. Le cycle de réplication de ce virus au sein de sa cellule-hôte se déroule en plusieurs étapes (FIGURE 3). Tout d’abord, les glycoprotéines gp120 de la surface virale reconnaissent le récepteur CD4 exprimé à la surface de la cellule cible et s’y attachent. Ce phénomène entraine un changement conformationnel de la gp120, dont la région variable V3 peut alors se fixer au corécepteur membranaire (CCR5 et/ou CXCR4), présent à proximité du récepteur CD4. De plus, la gp41, libérée par ce changement de conformation de la gp120, se fixe à son tour à la membrane cellulaire et se replie, ce qui permet la fusion entre l’enveloppe virale et la membrane de la cellule-hôte. La capside pénètre ensuite dans le cytoplasme et s’y désagrège pour libérer les deux brins d’ARN et les enzymes virales associées.
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Table des matières
INTRODUCTION
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
I- GÉNÉRALITÉS SUR LES VIRUS DE L’IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE (VIH)
I-1. Circonstances de découverte des VIH
I-2. Caractéristiques virologiques
I-3. Particule virale
I-4. Organisation du génome
I-5. Cycle de réplication virale
I.5.1. Déroulement de la réplication virale
I.5.2. Facteurs de restriction cellulaires et contournement VIH
II- ORIGINES, ADAPTATION ET DIVERSITÉ GÉNÉTIQUE DES VIH
II-1. Origines simiennes
II-2. Adaptation à l’Homme
II-3. Diversité génétique
II.3.1. Facteurs à l’origine de la diversité génétique
II-3.2. Recombinaison au sein des VIH
III- CLASSIFICATION DES VIH
III-1. Les VIH-1
III.1.1. Le groupe M (Major)
III.1.2. Les groupes non-M (N, O et P)
III-2. Les VIH-2
IV- RECOMBINAISON INTER-GROUPES ENTRE LES VIH-1/M ET VIH-1/O
III-1. Pré-requis : la double infection VIH-1/M+O
III-2. Circonstances de découverte des formes recombinantes VIH-1/MO
III-3. Caractéristiques moléculaires des formes recombinantes VIH-1/MO
III-3.1. Analyse phylogénétique et détermination du nombre d’URF_MO
III-3.2. Analyse des points de cassure des 19 URF_MO
III-4. Impacts potentiels de la recombinaison inter-groupes MO
RATIONNEL DU TRAVAIL EXPERIMENTAL
PARTIE 1. ETUDE DU POTENTIEL
REPLICATIF IN VITRO DE VIRUS RECOMBINANTS INTER-GROUPES M ET O
CONTEXTE ET OBJECTIFS DU TRAVAIL EXPÉRIMENTAL
A. GÉNÉRATION DE VIRUS RECOMBINANTS INTER-GROUPES M ET O
I- MÉTHODES
I-1. Génération de clones moléculaires infectieux chimériques
I-1.1. Modalités de génération des clones moléculaires infectieux chimériques
I-1.2. Génération des CMIC par synthèse
I-2. Production de virus recombinants à partir de clones moléculaires infectieux chimériques
I-2.1. Transfection
I-2.2. Co-culture
I-2.3. Contrôle de la production et de la réplication virales
II- RÉSULTATS
II-1. Génération de clones moléculaires infectieux chimériques
II-1.1. Modalités de génération des clones moléculaires infectieux chimériques
II-1.2. Génération des CMIC pVIH-1/OM et pVIH-1/MO
II-2. Production de virus recombinants à partir des clones moléculaires infectieux chimériques
I-2.1. pVIH-1/OM
I-2.2. pVIH-1/MO
I-2.3. Bilan de la production de virus recombinants
III- DISCUSSION
B. ETUDE DE LA CINÉTIQUE DE RÉPLICATION DES VIRUS PARENTAUX ET RECOMBINANT
I- MÉTHODES
I-1. Production d’un stock de virus parentaux et recombinant
I-2. Etude de la cinétique de réplication des virus parentaux et recombinant
II- RÉSULTATS
II-1. Production du stock de virus parentaux et recombinant
II-2. Cinétique de réplication des virus parentaux et recombinant
II-2.1. Profil des cinétiques de réplication des virus parentaux et recombinant
II-2.2. Comparaison des cinétiques de réplication
III- DISCUSSION
PARTIE 2. ETUDE DE L’EMERGENCE IN VITRO ET IN VIVO DES FORMES RECOMBINANTES INTER-GROUPES M ET O
A. ETUDE IN VITRO DE LA RECOMBINAISON AU SEIN DES RÉGIONS LTR
CONTEXTE ET OBJECTIFS DU TRAVAIL EXPÉRIMENTAL
I- MÉTHODES
I-1. Etude de l’émergence d’un point de cassure dans les LTRs
I-1.1. Recherche d’un point de cassure dans les LTRs
I-1.2. Etude de la cinétique d’émergence des points de cassure
I-2. Détermination des motifs de recombinaison
I-2.1. Populations ARN et ADN
I-2.2. SGA et séquençage
I-2.3. Recherche de la prédominance d’un profil préférentiel
I-3. Comparaison aux données in vivo
II- RÉSULTATS
II-1. Etude de l’émergence d’un point de cassure dans les LTRs
II-1.1. Recherche d’un point de cassure dans les LTRs
II-1.2. Etude de la cinétique d’émergence des points de cassure in vitro
II-2. Détermination des motifs de recombinaison
II-2.1. SGA et séquençage
II-2.3. Recherche de la prédominance d’un profil préférentiel
II-3. Comparaison aux données in vivo
III- DISCUSSION
B. IDENTIFICATION D’UNE CO-INFECTION VIH-1/M+O DU FAIT DE L’ÉMERGENCE IN VIVO D’UN RECOMBINANT VIH-1/MO VALORISATION
CONTEXTE ET OBJECTIFS DU TRAVAIL EXPÉRIMENTAL
I- MÉTHODES
I-1. Analyses sur le prélèvement de novembre 2013
I-1.1. Recherche de variants par sérotypage
I-1.2. Confirmation moléculaire de double infection avec recombinant
I-1.3. Quantification des différentes populations virales
I-2. Analyses sur les prélèvements séquentiels et collecte des données immunovirologiques et thérapeutiques
I-2.1 Echantillons et analyses
I-2.2 Collecte des données immuno-virologiques et thérapeutiques
II- RÉSULTATS
II-1. Analyses sur le prélèvement de novembre 2013
II-1.1. Recherche de variants par sérotypage
II-1.2. Confirmation moléculaire de double infection avec recombinant
II-1.3. Quantification des différentes populations virales
II-2. Analyses sur les prélèvements séquentiels et évolutions immuno-virologique et thérapeutique
II-2.1 Echantillons et analyses
II-2.2 Evolutions immuno-virologique et thérapeutique durant toute la durée de suivi
III- DISCUSSION
CONCLUSION – PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
