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Généralités sur les méthodes d’étude de la résistance de Mycobacterium tuberculosis
Les méthodes conventionnelles d’étude de la résistance
Les méthodes conventionnelles d’étude de la résistance de Mycobacterium tuberculosis aux antituberculeux reposent sur l’isolement, l’identification et les tests de sensibilité aux antituberculeux. L’isolement se fait généralement selon la méthode de Petroff sur milieux de LoewensteinJensen (LJ) ou de Coletsos (qui est du milieu de LJ additionné de pyruvate de sodium pour favoriser la croissance des mycobactéries à croissance difficile). Il existe d’autres milieux de culture comme les milieux de Dubos ou de Youmans. Dans la pratique le milieu de Loewenstein-Jensen est le plus utilisé. Les colonies de mycobactéries qui y poussent sont identifiées par des tests biochimiques: test à la niacine, recherche de nitrate réductase, recherche de catalase à noc et à 68°C et la croissance sur TCH (hydrazide de l’acide thiophène-2 carboxylique). Une fois la souche identifiée, on utilise la méthode des proportions pour établir son profil de sensibilité aux antituberculeux.
Les méthodes d’étude moléculaire
L’OMS et le partenariat Stop TB ont appelé au développement de techniques plus rapides de diagnostic pour détecter les tuberculoses multi résistantes (MDR) afin d’éviter le retard dans le traitement et ainsi juguler la propagation de toute forme de résistance aux antituberculeux. En effet, l’apparition de la tuberculose multi résistante a stimulé la recherche sur les mécanismes moléculaires à l’origine de la résistance aux antituberculeux. Ceci a conduit à l’élucidation des mécanismes responsables de la résistance à la rifampicine et à l’isoniazide chez Mycobacterium tuberculosis.
Les études ont démontré que plus de 95% des souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes à la rifampicine ont une mutation dans une région de 81 bp du gène rpoB qui code pour la sous unité p de l’ARN polymérase [3]. A l’opposé, les mutations à l’origine de la résistance à l’isoniazide sont situées sur plusieurs régions du génome [4]. La résistance à la rifampicine est un événement rare, qui fait de lui un excellent marqueur pour la détection des tuberculoses multirésistantes puisque environ 90 % des souches résistantes à la rifampicine sont également résistantes à l’isoniazide (Van Der Zanden, communication personnelle). L’inverse n’est pas vrai, la prévalence de la résistance à l’isoniazide est généralement plus élevée que celle de la rifampicine. Les outils diagnostiques des TB-MOR reposent sur la biologie moléculaire, techniques encore trop inaccessibles à grande échelle pour les pays en développement (PED). Il est un intérêt majeur de développer ces méthodes rapides pour une prise en charge efficace des patients (réduire les délais de disponibilité des résultats).
Problématique du sujet
La tuberculose a toujours été un problème majeur de santé publique au Burkina Faso. Avec une incidence attendue de 71 Ne TPM+/l 05 habitants [5], le Burkina Faso est classé parmi les pays à forte prévalence tuberculeuse. Les régimes de traitement des cas de tuberculose ont beaucoup changé. En effet, avant 1985, le régime n’était pas standardisé, il était conduit en fonction de la disponibilité en médicaments. Entre 1987 et 1989, un régime de traitement de courte durée de 8 mois avait été appliqué (2SHEZ/6EH). L’irrégularité des médicaments avait conduit à l’administration de la thiacétazone et de l’éthionamide. Entre 1989 et 1994, un régime de traitement de 6 mois a été appliqué pour le traitement des \nouveaux cas (2RHZE(ou S)/4RH). Durant les 2 premiers mois, les médicaments étaient \administrés sous supervision directe mais durant les 4 derniers mois, l’administration était ambulatoire.
Depuis 1995, le Burkina Faso a mis en place un Programme National de lutte contre la Tuberculose (PNT) qui s’inspire de la stratégie DOTS (Directly Observed Treatment of Short course) ou stratégie de traitement courte durée sous observation directe recommandée par l’OMS [6]. Pour la prise en charge de la tuberculose, des régimes standards de courte durée ont été appliqués [7]. Pour les nouveaux cas, le régime de traitement de première ligne chez l’adulte était de 8 mois de 1995 à 2007, soit 2(RHZE)/6(EH) avec une prise supervisée pendant les 2 premiers mois. Il est de 6 mois depuis 2008, soit 2(RHZE)/4(RH) avec une prise supervisée sur toute la durée du traitement. Pour les malades adultes en retraitement avec le régime de deuxième ligne (échecs, reprises de traitement, rechutes) le régime a été le suivant de 1995 à 2008 : 2S(RHZE)/l(RHZE)/5(RH)3E3. A partir de l’année 2009, cette catégorie de malades est sous le régime modifié suivant: 2S(RHZE)I1(RHZE)/5(RHE). Par ailleurs, l’approvisionnement en médicaments antituberculeux de qualité requise est régulier. Au Burkina Faso, deux études ont été déjà réalisées; Cependant elles ont porté sur des échantillons restreints. La première étude a été menée par le Centre Muraz, sur des crachats de malades hospitalisés au Centre Régional de Lutte Antituberculeuse (CRLAT) de BoboDioulasso entre 1992 et 1994. Elle a pu évaluer la performance du régime de traitement de 6 mois qui était en vigueur entre 1989 et 1994. Cette étude a montré la résistance primaire pour les souches du complexe Mycobacterium tuberculosis suivantes: isoniazide 7,6%; ethambutol 1% ; rifampicine 2,5% ; streptomycine 12,4% [8]. La seconde étude [9], plus récente a été réalisée en 2000, sur un nombre limité de sites (Ouagadougou, Bobo-Dioulasso, Dori et Gorom-Gorom). Les antibiotiques testés étaient ceux utilisés par le PNT (isoniazide, streptomycine, rifampicine, ethambutol). La distribution de cas de résistance dans les 4 régions étudiées était la suivante: 14,7% à Ouagadougou, 29% à Bobo-Dioulasso, 18% à Dori et 16% à Gorom-Gorom. Ces résultats mettent en évidence l’existence de souches de M.tuberculosis résistantes aux antituberculeux utilisés en première ligne par le PNT dans diverses régions du pays montrant l’importance d’entreprendre une enquête nationale de résistance aux antituberculeux au Burkina Faso. Pour avoir de bons résultats un gros travail technique doit être fait. En effet en mycobactériologie, pour avoir des résultats de qualité, on doit maîtriser les étapes de la microscopie, de la préparation des milieux de culture, de la mise en culture des prélèvements, de l’identification et de la mesure de la sensibilité aux antituberculeux des souches de bacilles tuberculeux et avoir un laboratoire de confinement acceptable. Quelque soit la technique de culture des mycobactéries, les contaminations sont inévitables et peuvent être de 4, l% sur les milieux solides de LJ et de 5,5% sur systèmes automatisés [20). Pour bien mener l’étude de résistance au plan national, le Centre Muraz s’est intéressé à mettre en place et à optimiser les techniques conventionnelles de culture, d’identification et de mesure de la sensibilité de M tuberculosis aux antituberculeux.
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Données épidémiologiques
Mode de contamination
Transmission par voie aérienne
La transmission de la tuberculose est essentiellement interhumaine. Lorsque le malade tousse, parle, rit ou éternue, il produit de fines gouttelettes infectantes (contenant des bacilles tuberculeux) appelées gouttelettes de Pf1ügge qui sèchent rapidement. Ces gouttelettes se fixent sur des particules de poussière et les plus fines restent en suspension dans l’air pendant plusieurs heures. Un sujet sain s’infecte en inhalant ces particules. Une fois inhalées les particules de moins de 10 micromètres de diamètre peuvent atteindre les alvéoles du poumon, tandis que les plus grosses se déposent dans les voies aériennes supérieures d’où elles sont emportées par le courant mucociliaire pour être habituellement dégluties. Lorsque les BK pénètrent dans les poumons et atteignent les ganglions par la voie lymphatique, ils s’y multiplient et déclenchent une réponse immunitaire à l’origine de la formation des tubercules, et d’une caséification (nécrose tissulaire riche en bactéries) [6, 10, 11].
Un malade cracheur infecte 30% des sujets qui rentrent en contact avec lui. Parmi les sujets infectés, 5% développeront une tuberculose maladie précoce. Chez les 95% infectés qui ne font pas la maladie, 90% continueront d’inhiber le bacille, et 5% feront une tuberculose postprimaire après une période de latence [12].
Autres modes de transmission
La transmission digestive est très rare, et due le plus souvent à une ingestion d’aliments infectés d’origine animale. La transmission transcutanée est très rare voire quasi inexistante; Elle se fait par des objets souillés à partir de lésions tuberculeuses suintantes (otite tuberculeuse, tuberculose gangliocutanée ou abcès froid fistulisé) [6]. La transmission par voie sexuelle des tuberculoses urogénitales existe mais est d’une très faible importance épidémiologique. En conclusion, la tuberculose se transmet à d’autres personnes très souvent à partir d’un malade souffrant de tuberculose pulmonaire.
Situation de la tuberculose dans le monde
L’OMS estime à 9,27 millions de nouveaux cas de tuberculose dans le monde en 2007, dont 4,1 millions sont des cas pulmonaires contagieux. Parmi ces cas observés, 95% surviennent dans les pays en développement et 5% dans les pays industrialisés. Un tiers (33%) de la population mondiale est infectée par le BK soit 1,9 milliards de personnes [13]. L’incidence de la tuberculose se situe autour de 220 cas pour 100000 habitants en Afrique, 190 pour 100 000 en Asie, 120 pour 100 000 en Amérique Latine contre 30 pour 100 000 en moyenne dans les pays industrialisés. Selon les estimations de l’OMS, il y a eu 1,7 millions de décès par tuberculose en 2006, 98% de ces décès surviennent dans les pays en développement [13]. En 2007, on estimait à 500 000 le nombre de cas de tuberculose à bacilles multirésistants (tuberculose MR), 85% de ces cas proviennent de 27 pays (dont 15 dans la Région européenne). Les pays qui occupent les cinq premiers rangs pour le nombre total de cas de tuberculose MR sont l’Inde (131 000), la Chine (112 000), la Fédération de Russie (43 000), l’Afrique du Sud (16 000) et le Bangladesh (15 000). A la fin de 2008, 55 pays et territoires avaient signalé au moins un cas de tuberculose ultra résistante (tuberculose UR) [15].
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Table des matières
1. INTRODUCTION
1.1 Généralités sur les méthodes d’étude de la résistance de Mycobacterium tuberculosis
1.1.1 Les méthodes conventionnelles d’étude de la résistance
1.1.2 Les méthodes d’étude moléculaire
1.2 Problématique du sujet
II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
11.1 Données épidémiologiques
11.1.1 Mode de contamination
II.1.1.1 Transmission par voie aérienne
II.1.1.2 Autres modes de transmission
II.1.2 Situation de la tuberculose dans le monde
II.1.3 Situation de la tuberculose au Burkina Faso
II.1.4 Impact du VIH sur la tuberculose
II.1.5 Impact de la co-infection TBNIH sur le système de santé
11.2 L’agent pathogène de la tuberculose
11.2.1 Classification
11.2.2 Caractères généraux
11.2.3 Caractères culturaux
II.2.4 Caractères biochimiques
II.2.5 Structure antigénique et conservation
11.3 L’infection par le BK
II.4 Physiopathologie de la tuberculose
11.5 Diagnostic de la tuberculose pulmonaire
11.5.1 Diagnostic clinique
II.5.2 Diagnostic micro biologique
II.5.2.1 Prélèvement des crachats
II.5.2.2 Microscopie optique
II.5.2.3 Microscopie à fluorescence
11.5.2.4 Culture
II.5.3 Diagnostic radiographique
II.5.4 Intra Dermo Réaction à la tuberculine (IDR)
II.5.5 Fibroscopie bronchique
II.6 Diagnostic des tuberculoses extra-pulmonaires
II.7 Mesures de prévention et mode de traitement de la tuberculose
II.7.1 Mesures de prévention
II.7.2 Mode de traitement
II.7.3 Les régimes thérapeutiq ues
II.7.4 Les médicaments antituberculeux
II.7.4.1 Les médicaments antituberculeux de première Iigne
II.7.4.2 Les médicaments antituberculeux de seconde Iigne
III. LES OBJECTIFS DE L’ETUDE
111.1 Objectif général
111.2 Objectifs spécifiques
IV. MATERIEL ET METHODES
IV.I La microscopie optique
IV.l.I Coloration du frottis
IV.I.2 Lecture des frottis
IV.2 Préparation des milieux de culture
IV.2.I Le premier jour (JI)
IV.2.l.I Mise en solution du milieu de base de Loewenstein Jensen
IV.2.l.2 Préparation et stérilisation du matériel nécessaire pour les manipulations de J2
IV.2.l.3 Traitement des œufs
IV.2.2 Le deuxième jour (J2)
IV.2.2.ITraitement des œufs (suite)
IV.2.2.2 Constitution et distribution du milieu de L.J
IV.2.2.3 Préparation du milieu de L.J. enrichi avec du pyruvate de sodium
IV.2.2A Préparation des milieux de culture additionnés d’antibiotiques
IV.2.3 Contrôle des milieux
IV.2.3.I Contrôle macroscopique
IV.2.3.2 Contrôle de stérilité
IV.2.3.3 Contrôle de l’activité des antibiotiques et de la technique
IV.3 La culture selon la méthode à la soude sans neutralisation de Petroff
IVA L’identification: tests biochimiques
IV.4.1 Test à ta Niacine
IV.4.2 Test au Nitrate
IVA.3 Recherche de la production de la catalase à 22°C et 68°C.
IV.4.4 Croissance sur TeH
IV.5 Le test de sensibilité: méthode des proportions
IV.5.1 Préparation de la suspension bacillaire
IV.5.2 Etalonnage
IV.5.3 Préparation des dilutions
IV.5.4 Ensemencement des milieux
IV.5.5 Incubation des cuJtures
v. RESULTATS
V.I Résultats de la microscopie
V.2 Résultats de la culture
V.3 Rés ultats de l’identification
V.4 Résultats des tests de sensibilité aux antituberculeux
VI. DISCUSION
VII. CONCLUSION
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