Généralités sur les méthodes de diagnostic de la tuberculose

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Fréquence et répartition géographique

Selon le rapport de l‟OMS en 2013, 9 millions de cas de tuberculose ont été enregistrés avec 1,5 million de décès. Cependant, la maladie connait un recule chaque année avec ainsi 37 millions de vies qui ont été sauvées entre 2000 et 2013[39].
Au Sénégal, la TB reste encore un problème de santé prioritaire. Des efforts ont permis d‟améliorer le taux de détection de 13 points entre 1990 et 2011. Selon le rapport Global TB de l‟OMS en 2012, l‟incidence estimée est de 136 cas toutes formes pour 100 000 habitants avec un taux de détection de 69%. Les cas attendus de coïnfection sont estimés à 1700 soit 14 cas pour 100 000 habitants.

Agent pathogène

La TB humaine est due au M. tuberculosis. C‟est un bacille aérobie strict, immobile, droit ou légèrement incurvé, acapsulé, asporulé, de 2 à 5μm de longueur sur 0,3 à 0,5μm de largeur, aux extrémités arrondies . Sa paroi se présente en petits amas ou sous forme isolée (figure 1). Le squelette de sa paroi est composé de peptidoglycanes reliés de façon covalente à un hétéroside l‟aribinogalactane (AG) lui-même estérifié par des acides mycoliques (acides gras particuliers), ils forment des cires. La paroi joue un rôle essentiel dans la virulence et la pathogénicité des mycobactéries. En effet, certains composants constituent des antigènes majeurs (exemple : HBHA) reconnus par différents récepteurs à la surface des cellules immunitaires et induisant ainsi une variété de réponses immunes.

Pathogenèse de la tuberculose

Après inhalation, le BK pénètre dans le parenchyme pulmonaire. Il est phagocyté par les macrophages [11]. La multiplication du BK intra vacuolaire conduit à la destruction du macrophage et à la libération de nombreux bacilles, qui seront phagocytés à leur tour par d‟autres macrophages et éventuellement par d‟autres cellules inflammatoires du voisinage, les monocytes et les polynucléaires. Ainsi se constitue un foyer infectieux local ayant au début des caractères non spécifiques [21].
Les BK libres ou phagocytés par les macrophages sont transportés vers les ganglions lymphatiques. Ces derniers sont riches en lymphocytes T spécifiques c’est-à-dire porteurs d‟un récepteur interagissant avec les antigènes du BK. Les différents types de lymphocytes sont impliqués (T CD4+ et T CD8+). Les lymphocytes activés se multiplient localement puis migrent dans la totalité de l‟organisme.
Dans 90% des cas, le BK est contrôlé par le système immunitaire des personnes infectées. Lorsque la tuberculose maladie ne se développe pas, on parle de porteur sain ou de tuberculose latente. Durant cette phase de latence, la multiplication bactérienne est contrôlée et les bactéries sont confinées dans les granulomes (figure 2). C‟est une structure dynamique, où les cellules immunitaires sont constamment renouvelées [48].Les macrophages alvéolaires des voies respiratoires, après internalisation des mycobactéries inhalées, sont stimulés et envahissent l‟épithélium pulmonaire. Seules 10% des tuberculeux latent feront une tuberculose active au cours de leur vie. Ceci pouvant être dû à un affaiblissement du système immunitaire. Les personnes qui développent une tuberculose active sont contagieuses et présentent des symptômes.

Généralités sur la réponse immunitaire anti tuberculeuse

Réponse immunitaire innée

L‟immunité cellulaire acquise protège d‟une façon efficace contre la TB disséminée mais ne prévient ni l‟infection pulmonaire initiale ni la réinfection exogène des poumons. Ce rôle de protection contre l‟infection est joué par les cellules de l‟immunité innée qui influencent également la réponse acquise de l‟hôte. Les phagocytes recrutés au niveau du site d‟infection tels que cellules dendritiques et les macrophages alvéolaires (figure 2) ont un rôle primordial dans la destruction du pathogène et la stimulation de la réponse cellulaire acquise suite à une présentation antigénique efficace aux cellules T [42]. M. tuberculosis est internalisé au sein des phagosomes des macrophages (figure 3) à travers plusieurs récepteurs tels que les récepteurs au mannose, les « scavenger receptor » et les récepteurs au complément.
La fusion du phagosome avec les lysosomes crée une nouvelle vacuole chargée d’hydrolases et protéases dirigées contre la bactérie avec un pH acide et des radicaux oxygénés (ROS) et azotés (RNI).
Récemment, une attention particulière a été portée sur le rôle des ‟Toll-like Receptors” (TLRs) dans la liaison du bacille aux macrophages. La signalisation dépendante des récepteurs Toll est déclenchée suite à l‟association des antigènes mycobactériens avec ces récepteurs localisés à la surface de la cellule et des phagosomes (TLR-MyD88). Brightbill et al avaient démontré que l‟activation des TLR par les lipoprotéines du M. tuberculosis, permet la production d‟IL-12 par les cellules Th 1 [4]. Cette IL-12 est un activateur des macrophages entraînant la production d‟oxyde nitreux et de peroxyde d‟hydrogène qui augmentent l‟acidification du phagolysosome. Ces substances ont une activité bactéricide. Cependant, le bacille peut échapper à ce phénomène par la production de molécules pouvant inhiber la fusion phagolysosomale.
En plus du macrophage plusieurs autres types cellulaires jouent un rôle important dans l‟infection par M. tuberculosis.
Les neutrophiles, premières cellules qui arrivent au niveau du site infectieux pour phagocyter les bactéries, ont une action bactéricide basée sur la production de défensines.
Les cellules dendritiques (DCs) qui entrent en contact avec M. tuberculosis acquièrent leur maturation et deviennent de puissantes cellules présentatrices d‟antigènes (CPA). Elles migrent vers les nodules lymphatiques où elles vont stimuler les cellules T naïves permettant leur maturation en Th1 grâce à la sécrétion des cytokines telles que : IL-12, IL-18 et IL-23 [50].Contrairement aux macrophages, les DCs activées par l‟IFN-γ, sont capables de contrôler la réplication des mycobactéries sans les éradiquer.
D‟autres types cellulaires peuvent intervenir comme les « Naturel Killers » (NKs) qui sont capables d‟activer les cellules phagocytaires au niveau du site d‟infection. Ces phagocytes augmentent, d‟une manière non spécifique, leur activité mycobactéricide suite à leur infection par M. tuberculosis. Les NKs peuvent lyser directement les pathogènes ou encore les monocytes et les macrophages infectés. D’autres études ont montré que les cellules épithéliales sont aussi capables de sécréter des polypeptides anti-mycobactériens comme les défensines et des agents bactéricides puissants tels que le monoxyde d‟azote (NO, Nitric Oxyde) [44].Elles peuvent aussi induire une réponse inflammatoire non spécifique par la synthèse de l‟IL-8. Les mastocytes peuvent aussi sécréter des médiateurs tels que l‟histamine et la β-hexosamidase et des cytokines proinflammatoires telles que l‟IL-6 et le TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha) [23].Ces médiateurs et cytokines sont impliqués à la fois dans l‟induction d‟une réponse inflammatoire, l‟activation des neutrophiles et le maintien de l‟intégrité du granulome [24].

Réponse immunitaire adaptative

Réponse humorale

La réponse immune vis-à-vis du BK est principalement cellulaire. La contribution de la réponse humorale est peu efficace. Cette dernière est très hétérogène et dépend du stade de la maladie [1].Un titre élevé en anticorps, principalement des IgG, a pu être observé chez les malades tuberculeux à un stade avancé de la maladie.
Cette réponse humorale est très marginale au cours de l‟infection tuberculeuse car les mycobactéries sont des bactéries intracellulaires d‟où la réponse anticorps systémique n‟est pas protectrice.

Réponse cellulaire

L‟immunité dirigée contre le BK repose essentiellement sur l‟immunité à médiation cellulaire et principalement sur les lymphocytes T CD4+ de type Th-1 et sur les macrophages [40].
Lors de l‟infection tuberculeuse, les bacilles sont phagocytés par les macrophages puis présentés aux lymphocytes T CD4+ et T CD8+. Ces lymphocytes ainsi activés sont les supports de l‟immunité spécifique antituberculeuse [41].

Le rôle des macrophages et cellules dendritiques

Les monocytes/macrophages (figures 3 et 4), semblent jouer un rôle clef dans l‟initiation et l‟orientation de la réponse adaptative dirigée contre le M. tuberculosis, grâce à leur capacité à présenter l‟antigène, leur activité co-stimulatrice et leur production de cytokines et chimiokines (figure 4).
Les fragments antigéniques de la mycobactérie, dégradés et présentés à travers les molécules du Complexe Majeur d‟histocompatibilité (CMH) classe II, aux cellules T CD4+, permettent une reconnaissance spécifique des cellules infectées. Les cellules NK et T secrètent l’IFN-γ, nécessaire à augmenter l’effet bactéricide des macrophages et à produire d’avantage de cytokines du type Th1.
Les macrophages contribuent également à la réponse immunitaire en sécrétant du TNF-α qui joue un rôle central dans la formation de la lésion granulomateuse. Bien que ce rôle n‟ait pas été prouvé chez l‟homme, des études ont montré que les animaux ne produisant pas cette cytokine meurent dans un tableau de tuberculose sévère [15]. En général, le macrophage internalise et contrôle le développement du bacille. Le fait de contenir l‟infection au niveau du macrophage fait intervenir plusieurs cellules de l‟immunité adaptative dont les cellules suivantes : T CD4+, T CD8+, T γδ, T CD1+ [27]. Ces cellules interviennent en sécrétant des cytokines principalement l‟IFN-γ. Les cellules T CD4 activées peuvent directement secréter de la lymphotoxine 3 (LT3) qui a une action cytolytique directe sur les macrophages infectés.

Le rôle des interleukines (IL)

 La principale cytokine de la réponse immunitaire innée jouant un rôle central dans le contrôle de l‟infection à M. tuberculosis est l‟IFN-. Certaines protéines du M. tuberculosis induisent une forte production de cette IL. Parmi ces protéines nous pouvons citer l‟HBHA , l‟ESAT-6 et le CFP-10

La protéine de surface HBHA

L‟interaction de M. tuberculosis avec les cellules épithéliales peut être inhibée par des sucres sulfatés tels que l‟héparine ou le dextran sulfaté [34]. Par ailleurs, ces sucres sulfatés n‟inhibent pas l‟interaction de la bactérie avec les macrophages, indiquant ainsi qu‟il existe un mécanisme moléculaire propre et spécifique à l‟interaction de M. tuberculosis avec les cellules autres que les macrophages. Les expériences d‟inhibition par les sucres sulfatés suggèrent aussi que les mycobactéries expriment à leur surface des adhésines capables de se lier aux sucres sulfatés. Le BK produit une protéine d‟un poids moléculaire d‟environ 28 kDa capable de fixer l‟héparine. La protéine purifiée est capable d‟agglutiner les globules rouges de lapin et cette activité d‟hémagglutination peut également être inhibée par la présence de sucres sulfatés. La HBHA est une protéine méthylée et la méthylation s‟avère essentielle pour ses propriétés immuno-protectrices. Une forte réponse immunitaire contre la HBHA a en effet pu être mise en évidence chez les personnes présentant une infection latente par M. tuberculosis [33].
Cette réponse est à la fois humorale et cellulaire. Une différence importante a pu être décelée entre les sujets présentant une infection latente et les patients souffrant d‟une tuberculose active. Chez les patients tuberculeux, la réponse humorale est forte, alors que la réponse cellulaire, caractérisée par la production d‟IFN-γ suite à une stimulation in vitro de leurs leucocytes périphériques est très faible. En revanche, la réponse cellulaire chez les sujets infectés mais en bonne santé est très importante [19].
La HBHA constitue donc potentiellement un antigène capable de distinguer l‟infection latente de la TB active. Pour d‟autres antigènes tels que l‟ESAT-6, la réponse cellulaire est aussi forte, voire plus forte, chez les patients tuberculeux que chez les sujets infectés non malades. La HBHA présente donc les caractéristiques d‟un bon antigène de diagnostic de l‟infection latente. Une caractérisation plus approfondie de la réponse immunitaire contre la HBHA au cours de l‟infection latente a montré que l‟IFN-γ en réponse à l‟antigène spécifique est produit à la fois par les lymphocytes T CD4+ et par les lymphocytes T CD8+ [33].

Les protéines sécrétées ESAT6 et CFP10

ESAT-6 (Early Secreted Antigenic Target-6) et CFP-10 (10-kDa Culture Filtrate Protein) sont des peptides codés par des gènes (figure 6) de la Région de Différentiation 1 (RD1). Ces antigènes sont présents chez M. tuberculosis et M. bovis mais absents chez le BCG.
Ces antigènes sont fortement reconnu par les lymphocytes T et provoque une production massive d‟IFN- γ [49].

L’intradermoréaction à la tuberculine (IDRt)

L‟IDRt a représentée pendant environ un siècle le seul test de diagnostic de l‟infection tuberculeuse. C‟est un test cutané explorant l‟hypersensibilité de type IV en réponse à la tuberculine.
Le PPD est constitué d’un mélange d’antigènes de M. tuberculosis, M. bovis ou BCG et de plusieurs mycobactéries atypiques. Il met donc en évidence la mémoire immunitaire à médiation cellulaire dirigée contre M. tuberculosis [17].
Son introduction dans l’organisme permet après présentation des peptides aux lymphocytes T mémoires, une sécrétion de cytokines inflammatoires. Ces molécules sont responsables de l’induration et de l’érythème qui apparaissent au point d’injection.
En effet, c‟est une réponse immunitaire secondaire. La réponse immunitaire primaire est initiée dans les organes lymphoïdes secondaires. Elle débute par la reconnaissance d‟antigènes associés aux molécules du CMH à la surface des cellules dendritiques par les LT naïfs spécifiques de cet antigène. En réponse à la reconnaissance de l‟antigène et grâce aux signaux de co-stimulation, les lymphocytes sont activés et prolifèrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Les cellules activées secrètent des cytokines pro-inflammatoires et expriment à leurs surfaces des ≪homing receptors≫ qui leur permettent de rejoindre le site de l’infection et d‟éliminer les antigènes étrangers. Après leurs éliminations, la majeure partie des lymphocytes T est éliminée. Seul un petit nombre de lymphocytes T spécifiques survit. Ils auront une très longue durée de vie, ce sont les LT mémoires.
Deux populations de LT mémoires peuvent être distinguées: Les CM (Central Memory T cell) expriment CD62L et CCR7 et résident dans les organes lymphoïdes. Elles sont capables de proliférer massivement très longtemps après la primo-infection et en l‟absence d‟antigène résiduel en cas de réintroduction de l‟antigène [46].
Les EM (Effector memory T cell) n‟expriment ni le CD62L ni CCR7 et sont présents dans les organes lymphoïdes secondaires et dans les tissus non lymphoïdes [45]. La population lymphocytaire à l‟origine de la réponse immunitaire secondaire dans le cadre de l‟IDRt n‟a pas été identifiée avec certitude. Des combinaisons de molécules d‟adhésion à la surface des EM ont permis de distinguer des sous populations d‟EM. Dans le cadre de l‟IDRt, le test est réalisé sur une période longue (>48H), donc Il stimulerait à la fois les EM et les CM (figure 7). D‟un point de vue histologique, la migration cellulaire est bi phasique. Dans un premier temps, les cellules qui migrent vers le point d‟injection sont majoritairement des PNNs. Il se développe une inflammation locale avec production de cytokines pro inflammatoires (IFNγ, TNFα, lymphotoxine). Ces facteurs stimulent localement l‟expression de molécules d‟adhésion (E-selectin, ICAM1, VCAM1) au niveau de l‟endothélium et une augmentation de la perméabilité vasculaire. Les molécules d‟adhésion permettent dans un deuxième temps, l‟afflux de monocytes, macrophages et lymphocytes depuis la circulation sanguine [52].

Procédures de l’étude

Huit millilitres de sang ont été recueillis sur tube hépariné pour la séparation cellulaire. Les cellules mononuclées du sang périphérique ou PBMC (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”) ont été isolées par gradient de centrifugation à 1000 g pendant 10 mn en utilisant le Ficoll-Hystopaque® (Pharmacia). Un million (106) de cellules ont été resuspendues dans 500μl de milieu de culture cellulaire et incubées pendant 24h avec de 5 μg/ml d‟IL-7 dans chacun des trois tubes : 2μg/ml pour la stimulation par HBHA, 5ug/ml de SEB comme contrôle positif et un tube médium. Les tubes sont ensuite centrifugés afin de collecter le surnageant pour la détection in vitro de la production d‟IFN-γ dans la tuberculose latente. Le reste des surnageants a été conservé à -70°C pour étudier d‟autres biomarqueurs liés à la TB, comme le TNF-α ou l‟IP-10.
Des prélèvements de 1 ml dans chacun des 3 tubes du kit du QFT-IT ainsi que l‟IDRt ont été réalisés pour chaque volontaire pour la détermination d‟une probable infection tuberculeuse.

IGRA basé sur la stimulation par l’HBHA

Principe

Son principe repose sur la détection des cellules T effectrices qui sécrètent IFN-γ en réponse à la stimulation par les antigènes spécifiques du M. tuberculosis par la technique ELISA. En effet, des PBMC sont déposées dans des puits de microtitrage (Maxisorp®) tapissés d‟une membrane de nitrocellulose sensibilisée au préalable par un anticorps anti-IFNγ (anticorps de capture) (figure 10). L‟antigène spécifique du M. tuberculosis (HBHA) et un mitogène servant de contrôle positif (SEB) sont incubés avec les PBMC pour permettre la stimulation des cellules T activées. L‟IFNγ secrété est capturé par l‟anticorps fixé à la membrane ; les cellules et les autres produits indésirables sont éliminés par lavage.
Un second anticorps, conjugué à la phosphatase alcaline et dirigé contre un épitope différent de la molécule d‟IFNγ est ajouté. Ce dernier se lie à l‟IFN-γ pris en sandwich à la surface du puits. Tout conjugué non lié est éliminé par lavage. Un substrat soluble est ensuite ajouté dans chaque puits ; ce substrat est clivé par l‟enzyme pour former un produit coloré insoluble dont l‟intensité est proportionnelle à la concentration d‟IFN-γ dans l‟échantillon.

Table des matières

Première partie: Généralités sur la Tuberculose
I. Définition
II. Epidémiologie
II.1. Fréquence et répartition géographique
II.2. Agents pathogènes
II.3.Pathogenèse de la tuberculose
III. Généralités sur la réponse immunitaire anti tuberculeuse
III.1. Réponse immunitaire innée
III.2. Réponse immunitaire adaptative
III.2.1.Réponse humorale
III.2.2.La réponse cellulaire
III.2.2.1.Le rôle des macrophages et cellules dendritiques
III.2.2.2.Le rôle des lymphocytes T CD4+
III.2.2.3.Le rôle des lymphocytes T CD8+
III.2.2.4.Le rôle des interleukines (IL)
III.2.2.4.1. Protéine de surface HBHA
III.2.2.4.2. Protéines secrétées ESAT6 et CFP10
IV. Généralités sur les méthodes de diagnostic de la tuberculose
IV.1. Diagnostic de l‟infection tuberculeuse latente
IV.1.1.L‟intradermoréaction à la tuberculine (IDRt)
IV.1.1.1. Principe Technique de l‟IDR de Mantoux
IV.1.1.2. Lecture et interprétation des résultats
IV.1.2. les Tests „„Interferon Gamma Release Assays‟‟ IGRA
IV.2. Diagnostic de la tuberculose active
IV.2.1. Examens cliniques
IV.2.2. Examens radiologiques
IV.2.3. Diagnostic bactériologique
IV.2.4. Les nouvelles méthodes de diagnostic
IV.2.5. Méthodes de mesure de l’interféron gamma secrété après activation lymphocytaire
Deuxième partie : Méthodologie, Résultats et Discussion
I. Méthodologie
I.1. Cadre de l‟étude
I.2. Population de l‟étude
I.3. Matériel et méthodes
I.3.1.Matériel
I.3.2. Réactifs
I.3.3. Protocole de l‟étude
I.3.4. IGRA basé sur la stimulation par l‟HBHA
I.3.4.1. Principe
I.3.4.2. Protocole technique
I.3.5. QUANTIFERON- TB GOLD IN TUBE
I.3.6. Analyse des données
II. RÉSULTATS
II.1. Caractéristiques démographiques et immunologiques de la population d‟étude
II.2. Production de l‟IFN-γ après stimulation par le test HBHA
II.3. Comparaison de la production d‟IFN-γ après stimulation par l‟HBHA dans les différents groupes
II.4. Comparaison de la sécrétion d‟IFN-γ en réponse à l‟HBHA chez les sujets IDRt positive/QFT négatif
II.5. Comparaison de la sécrétion cytokinique IFN-γ en réponse à l‟HBHA chez les étudiants (6ème et 7ème) de la FMPO et ceux de la FST (master)
III. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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