GÉNÉRALITÉS SUR LES KÉRATINES 

GÉNÉRALITÉS SUR LES KÉRATINES 

INTERFÉRON GAMMA :

Les interférons (INF) sont des glycoprotéines de taille moyenne (17-25 kDa) appartenant à la famille des cytokines. Elles sont initialement décrites comme molécules à activité biologique, sécrétées lors d’une infection virale (Isaacs and Lindenmann, 1987). Il s’agit de protéines solubles caractérisées par des propriétés antivirales, anti-tumorales et immunomodulatrices. Les interférons sont regroupés en trois principales familles en fonction de leur spécificité aux récepteurs, de leur homologie de structure, de leurs propriétés physicochimiques ainsi que de leur localisation chromosomique. Les IFN de type 1 (IFN-a, p et co) sont sécrétés par les leucocytes, les cellules épithéliales et les fibroblastes (Kadowaki et ai, 2001). Chez l’homme le type 2 est constitué par l’IFN-y et il est sécrété sous forme clivée par les cellules T activées et les cellules NK. (Schroder et al, 2004) Le type 3 regroupe l’IFN-M, PIFN-A2 et PIFN-X3 qui sont synthétisés par les cellules dendritiques (Sheppard et al, 2003).

Interféron de type 2 :

La famille de type 2 est représentée par l’IFN-y. Il s’agit d’une glycoprotéine de 17 à 25 kDa (Devos et al, 1982; Sareneva et al, 1995). Elle est biologiquement active sous forme d’homodimères et se fixe sur son récepteur tétraédrique composé de deux chaînes d’IFNy-Rl et deux chaînes d’IFNy-R2. Ce complexe active ainsi les tyrosines Janus kinase (JAK) et la dimérisation du facteur de transcription Signal transducers and activators of transcription (STATl) (figure 6) (Baccala et ai, 2005; Farrar and Schreiber, 1993; Schroder et al., 2004). Plusieurs polymorphismes conduisant à différentes maladies incluant l’arthrite rhumatoïde et les maladies dues aux rejets de greffes, sont répertoriés sur le gène de l’IFN-y(Cavet^a/.,2001).

Activation par VIFN-y des voies de signalisation alternatives:

La phosphorylation de STAT-1 au niveau de la serine (résidu 727) contribue à une activation transcriptionnelle maximale et ce indépendamment de la voie médiée par la phosphorylation STAT-1 au niveau de la tyrosine (Wen et ai, 1995; Zhu et al., 1997). Une autre étude a rapporté que le stress, les lipopolysaccharides (LPS) ainsi que certaines cytokines inflammatoires (IL-1 et TNF-(3) induisent la phosphorylation de la serine de STAT-1 et travaillent en synergie avec l’IFN-y pour l’activation des gènes (Kovarik et ai, 1999). Dans un modèle de souris, la substitution de la serine 727 pour une alanine au niveau de STAT-1 cause non seulement des perturbations dans l’expression des gènes mais surtout de la difficulté de l’animal à combattre les infections bactériales (Varinou et al., 2003). Plusieurs études impliquent la voie des Mitogen-activated protein kinases (MAPK) dans la phosphorylation de STAT-1 au niveau de la serine 727 (Wen et al., 1995). L’IFN-y active aussi la voie p38/MAPK. Toutefois le mécanisme employé par cette kinase pour phosphoryler la serine de STAT-1 n’est pas totalement clair (Kovarik et al., 1999; Ramsauer et al., 2002). Différentes études ont démontré que le phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) (Navarro et al., 2003b; Nguyen et al., 2001), la protéine kinase C delta (Débet al., 2003) et la calmoduline kinase dépendante (Nair et al., 2002) sont activés par l’IFN-y pour jouer un rôle dans la phosphorylation de la serine de STAT-1. L’IFN-y induit également une signalisation indépendante de STAT-1. En effet, bien qu’elles restent sensibles aux infections microbiennes, les cellules déficientes en STAT-1 continuent de proliférer et sont protégées de l’apoptose. En l’absence de STAT-1, l’IFN-y stimule l’expression des oncogènes cmyc et c-jun qui aident au maintien de la survie et la croissance des cellules (Ramana et al, 2001 ; Ramana et al, 2000).

HYPOTHESE ET OBJECTIFS:

Hypothèse
Comme indiqué dans les chapitres précédents, l’EBS est causée par des mutations au niveau des gènes codant pour K5 ou Kl4. Cette maladie, par définition est une maladie orpheline et actuellement il n’existe aucune thérapie pour guérir les patients. Pour cela, la recherche se base sur des molécules à effet thérapeutique documenté afin de réduire ou même éliminer les agrégats protéiques causés par le mauvais appariement des kératines. En effet l’étude de Radoja et al., en 2004 a rapporté que dans les cellules HeLa, l’utilisation de l’IFN-y stimulerait la production de Kl5 appartenant à la même famille que la K14 et qui pourrait la remplacer en formant des hétérodimères avec K5 (Radoja et al., 2004). En se basant sur cette étude, notre hypothèse est que l’IFN-y va stimuler la production de Kl5 dans des kératinocytes humains en culture isolés de patients EBS.
Objectif
L’objectif de cette étude est de vérifier l’effet de l’IFN-y sur la production de Kl 5 dans des kératinocytes immortalisés et primaires isolés de patients atteints d’EBS causée par une mutation au niveau de Kl4. En effet Kl5 pourrait remplacer la Kl 4 mutée en s’associant à la K5 pour former des hétérodimères.

Abstract:

Epidermolysis bullosa simplex (EBS) is a rare genetic disease characterized by basal keratinocytes cytolysis, intra-epidermal blister formation and skin fragility. EBS is classified into different subtypes according to the severity: EBS-localized (EBSloc), EBS-generalized (EBS-gen) and EBS-Dowling-Meara (EBS-DM). It is generally inherited in an autosomal dominant manner and caused by mutations in keratin 5 (KRT5) or keratin 14 (KRT14) genes. In addition to K14 (type I) and K5 (type 2), the epidermis basal layer produces also K15, that belongs to type 1 keratin and can be substitute the mutated K14.

Objectives:

According to data found in the literature, our interest focused on interferon gamma’s effect (IFN-y) on cultured keratinocytes from EBS patients with mutations in KTR14 by the analysis of keratin 15 (K15) production level and of the disappearance of aggregates in these cells.

Discussion:

The previous studies have reported the therapeutic effect of IFN-y in several diseases such as chronic hepatitis C (Sobue et al., 2001), dermatitis (Boguniewicz et al., 1990) and psoriasis (Wei et al., 1999). In psoriasis, stimulation of K17 and K16 was observed under the effect of IFN-y in cultured cells isolated from skin biopsies from patients and controls (Wei et al., 1999). The same results were observed in HaCaT cells (Bockelmann et al., 2005). In this study, the results indicated that stimulation of K17 in HaCaT immortalized cells depends on the stimulation by IFNy. By Western blot assays and immunohistochemistry, the production of K17 increases in a dose-dependent manner when the cells are incubated with this cytokine (10, 50, 250 and 1250 U/ml) after 48 hours. At a concentration of 5 U/ml IFN-y, the production of K17 is reduced (Bonnekoh et al, 1995). IFN-y also affects other keratins such as K16 in healthy keratinocytes as it was reported by Barker et al., 1993. In contrast to K14, K5 and K15 which are principally produced in basal layer, K17 is only expressed in the suprabasal layer (Radoja et al., 2004) and therefore the replacement of K14 by K17 in EBS is not possible.

Based on this hypothesis, we focused on the effect of IFN-y on cultured keratinocytes from EBS KTR14 mutant by the analysis of K15 production. Surprisingly, we observed a down-regulation of K15 production after INF-y treatment. INF-y also down-regulates the expression of the KRT15 gene in immortalized and primary keratinocytes but this decrease is not significant in immortalized ones after treatment with INF-y at 24, 48 and 72 hours. The difference in meaning between RNA expression and protein production can be explained by three reasons. First, there are many varied post-transcriptional mechanisms involved in the translation of RNA to proteins that are not well understood, in order to calculate the concentration of proteins from RNA. Second, proteins can differ in their in vivo half-lives. The third reason is related to the background noise, which can give
us a bad image to properly estimate the amount of protein (Greenbaum et al., 2003). To explain this difference in results, three hypotheses have been issued First, this could be due to the immortalization process, which may alter the expression of several genes. To verify this hypothesis, we extracted RNA from primary keratinocytes and measured the KRT15 gene expression by qRT-PCR. We found that INF-y reduced the expression of the KRT15 gene in primary cell lines. Therefore, the effect of immortalization can be rejected. Western blot analysis was not performed as the primary keratinocytes are in a limited number in the biobank which makes them valuable. A second hypothesis is that this difference could be due to the cell lines used in the two studies. In the study of Radoja et al., the cellular model chosen was HeLa cells. In our study, it was immortalized keratinocytes. For their model, K15 was significantly increased after transfection under the effect of 100 ng/ml of INF-y, while the same amount clearly reduced K15 in our model (keratinocytes). Radoja et al. were interested to transcription factors that INF-y regulates, but in our study we were interested in the effect of this molecule on the production of K15, on the level of expression of the KRT15 gene and on the formation of aggregates.

Conclusion:
In conclusion, the results presented here suggested that it isn’t possible to stimulate the expression of keratin K15 by IFN-y in epidermal keratinocytes. We have shown that IFN-y downregulated the production of K15 in the cultured keratinocytes (immortalized and primary keratinocytes). This is explained by the previously mentioned assumptions. We have also shown that IFN-y stimulated the expression of the KRT16 gene and the production of K17? but K17 cannot replace the mutated K14 due to its production in the suprabasal layer.

Table des matières

INTRODUCTION 
CHAPITRE 1 : GÉNÉRALITÉS SUR LES KÉRATINES 
Structure de la peau
L’hypoderme
Le derme
L’épiderme
Les kératines
Structure et fonction des kératines
Les kératines dans les fonctions cellulaires
CHAPITRE 2 : ÉPIDERMOLYSES BULLEUSES HÉRÉDITAIRES 
Définition des épidermolyses huileuses héréditaires
Différents types d’épidermolyses huileuses héréditaires
L’épidermolyse huileuse simplex
L’épidermolyse huileuse dystrophique
L’épidermolyse huileuse jonctionnelle
Définition et épidémiologie de l’épidermolyse huileuse simplex
Différents types d’épidermolyse huileuse simplex
Épidermolyse huileuse localisée (EBS-loc)
Épidermolyse huileuse pigmentation mouchetée (EBS-MP)
Épidermolyse huileuse généralisée (EBS-gen)
Épidermolyse huileuse Dowling-Meara (EBS-DM)
CHAPITRE 3 : INTERFÉRON GAMMA 
Définition
Interféron de type 2
Structure de l’IFN-y
IFN-y et immunité ….;
Mécanisme d’action de l’IFN-y
Activation de la voie de signalisation par l’IFN-y via JAK/STAT-1
Activation par l’IFN-y des voies de signalisation alternatives
IFN-y et thérapies
IFN-y et cancer
IFN-y et tuberculose
IFN-y et dermatite atopique
IFN-y et psoriasis
HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS
Hypothèse
Objectif
CHAPITRE 4: Interferon gamma impact on keratin aggregates in keratinocytes
isolated from Epidermolysis Bullosa Simplex patients caused by keratin
mutations
Abstract
Objectives
Results .
Conclusion
Introduction
Material and methods
Individuals
Keratinocytes culture and immortalization
Interferon gamma treatment
Evaluation of the toxicity of IFN-y
qRT-PCRs
Western blotting
Keratinocyte lines heat-shock and pre-treatment with IFN-y
Statistical analysis
Results >
The effect of IFN-y on the aggregates and toxicity
IFN-y decreases the expression level of the KRT15 gene in immortalized and in
primary keratinocytes
IFN-y increases the expression level of the KRT16 gene in immortalized and in
primary keratinocytes
IFN-y treatment of immortalized keratinocytes induces a decrease in K15 level
in a dose dependent manner
Discussion 
Conclusion
Acknowledgments:
References
CHAPITRE 5: DISCUSSION GÉNÉRALE 
Interprétation générale
Modèle cellulaire
Immortalisation des keratinocytes
Préactivation des keratinocytes
Thérapie génique
Utilisation de molécules thérapeutiqe
La voie de signalisation Keapl/Nrf2/ARE
Réduction d’agrégats de kératines
CONCLUSION

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