Soutenance mémoire
GENERALITES SUR LES CELLULES DENDRITIQUES
Le système immunitaire est l’ensemble des cellules, des tissus et des organes dont le rôle est de défendre l’organisme contre des agents pathogènes, des substances étrangères ou anormales, notamment celles qui font partie des microorganismes (bactéries, virus, etc.) et celles qui se trouvent à la surface des cellules cancéreuses. Ces substances susceptibles d’induire une réponse immunitaire sont appelées: antigènes. Le système immunitaire joue un rôle fondamental. Extrêmement complexe, le système immunitaire permet de réagir de façon appropriée à l’infinité d’antigènes différents et potentiellement pathogènes qui pénètrent dans l’organisme. Les mécanismes physiologiques complexes mis en œuvre dans le système immunitaire ne sont pas encore complètement élucidés, mais ils sont chaque jour mieux compris. Le fonctionnement du système immunitaire fait intervenir plusieurs types de cellules qui sont les cellules du système immunitaire. Il regroupe plusieurs types de cellules (Lymphocytes, Neutrophiles, Cellules Dendritiques, Macrophages…). L’interaction entre ces différents types cellulaires confère au système immunitaire son rôle de protecteur de l’organisme. Les lymphocytes sont les cellules centrales du système immunitaire, responsables de l’immunité acquise et des attributs immunologiques de diversité, spécificité, mémoire et reconnaissance du soi et du non soi. Les autres types cellulaires du système immunitaire jouent des rôles importants en englobant et détruisant les micro-organismes, en présentant les antigènes ou en secrétant des cytokines pour orienter la réponse immune (Goldsby et al., 2001, Banchereau & Steinman, 1998).
Cellules dendritiques
La cellule dendritique (DC) tire son nom du fait qu’elle est couverte d’un écheveau de longues extensions membranaires qui ressemblent aux dendrites des cellules nerveuses. Les cellules dendritiques sont difficiles à isoler du fait que les procédés conventionnels d’isolement des cellules tendent à endommager leurs longues extensions. Identifiées pour la première fois comme cellules de Langerhans en 1868, la caractérisation de DC n’a commencé que dans les années 1970s (Banchereau & Steinman, 1998). Les DC sont des cellules quantitativement peu abondantes dans le sang où elles représentent moins de 1% des cellules mononuclées circulantes.
Origine
Toutes les DC ont pour origine des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de moelle osseuse (Banchereau & Steinman, 1998, Goldsby et al., 2001, Martinon-Ego & Berthier, 2000, Steinman, 1991 ). Schématiquement, on peut imaginer cinq stades de différenciation de DC à partir de la CSH. Le premier stade représente le stade progéniteur, possédant des capacités de prolifération importante, puis vient le stade de précurseurs peu ou non proliférants présents dans le sang et les tissus périphériques. On trouve ensuite dans le sang des DC immatures qui complètent leur différenciation dans les tissus où elles deviennent des DC matures. Ce processus de différenciation se termine par l’apoptose de DC (Banchereau & Steinman, 1998, Martinon-Ego & Berthier, 2000). Un autre modèle propose qu’une cellule au stade de monocyte tardif se différencie dans les tissus pour générer soit un macrophage, soit une cellule dendritique. Certaines observations suggèrent que les macrophages matures et les cellules dendritiques pourraient être interconvertibles; cependant, ceci n’a pas été confirmé (Goldsby et al., 2001). Comme toutes les cellules sanguines, les DC sont produites à partir des progéniteurs médullaires CD34+ (Banchereau & Steinman, 1998). Ces CD34+ ont une capacité de prolifération importante se terminant par leur aptitude à former des colonies de cellules hématopoïétiques quand ils sont cultivés en gel semi-solide. Cette technique de clonage des progéniteurs médullaires a permis de déterminer que chez l’homme les DC dérivent de deux types de progéniteurs CD34+ en présence de GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulator Factor) et TNF-α (Tumor Necrosis Factor α). Un de ces progéniteurs est commun avec les granulocytes et les monocytes (CFU-GM) pour Colony Forming Unit-Granulocyte/Monocyte. Il donne naissance à des colonies de 1000 à 2000 cellules contenant des granulocytes, des monocytes et des DC. L’autre progéniteur est spécifique de DC (Colony Forming Unit-DC) et clone sous forme de colonies de petite taille (100 à 200 cellules) contenant uniquement des DC (Martinon-Ego & Berthier, 2000).
Sous populations de DC
Les DC peuvent être subdivisées en deux sous populations: les DC myéloïdes empruntant la voie myéloïde et les DC plasmacytoïdes d’origine lymphoïde (Del Hoyo et al., 2002). Il est difficile d’identifier les DC sur des critères de présence de marqueurs de surface spécifiques comme on le fait pour les lymphocytes T ou B, les cellules NK ou les monocytes. Lorsqu’on cherche à purifier les DC sur ce critère de marqueurs membranaires on procède par élimination en cherchant les cellules mononuclées du sang qui ne possèdent pas les marqueurs spécifiques de lymphocytes T (CD3), B (CD19), NK (CD56), granulocytes (CD16) et monocytes (CD14). Parmi les cellules restantes, les DC sont HLA DR+ CD1a+ et expriment d’autres marqueurs qui permettent de différencier les différentes sous populations (Martinon-Ego & Berthier, 2000, Ito et al., 1999, Jullien et al., 1999, Banchereau & Steinman, 1998, Steinman, 1991).
DC myéloïdes
Les DC myéloïdes, apparentées aux macrophages et aux granulocytes, sont les mieux caractérisés, tant chez l’homme que chez la souris. Les cellules de Langerhans (de l’épiderme), les DC interstitielles de tissus périphériques (comme le derme) et les DC obtenues à partir de monocytes appartiennent à cette sous population (Martinon-Ego & Berthier, 2000). Les DC myéloïdes circulent dans le sang représentant une population cellulaire HLA DR+ CD11c+ . Les monocytes sanguins, précurseurs de macrophages tissulaires, peuvent aussi dans certaines conditions être des précurseurs de DC myéloïdes (Randolph et al., 1999). Les fonctions de DC myéloïdes sont tout à fait distinctes selon leur stade de maturation. Cela est bien reflété par leur aspect morphologique radicalement différent et l’expression à leur surface de molécules distinctes (Banchereau & Steinman, 1998). On peut étudier les DC myéloïdes dans leur différents états d’activation in vitro en les générant à partir des progéniteurs médullaires CD34 + ou les monocytes avec le cocktail cytokinique adapté, comprenant en général du GM-CSF et de l’IL-4 (Banchereau & Steinman, 1998, Randolph et al., 1999).
DC plasmacytoïdes
Les DC plasmacytoïdes (lymphoïdes) dérivent d’un précurseur commun aux cellules B, T et NK. Elles sont présentes dans le thymus et dans les organes lymphoïdes secondaires. Chez la souris, elles ont été clairement identifiées car elles expriment les marqueurs caractéristiques : CD8α et DEC-205. Chez l’homme, les DC à la morphologie inhabituelle de type plasmacytoïdes trouvées dans les amygdales et appelées parfois « Cellules T plasmacytoïdes » appartiendraient à la lignée lymphoïde (Martinon-Ego & Berthier, 2000). Les précurseurs de DC plasmacytoïdes circulent dans le sang sous forme d’un contingent cellulaire HLA DR+ CD11c- , CD123+ et CD26L+ . On peut les maintenir en culture et les faire maturer en présence de l’Il-3 et de CD40L (Grouard et al., 1997). On connaît assez peu la fonction de DC plasmacytoïdes, mais on pense qu’elles ont un rôle important dans la défense antivirale car elles induisent une forte réponse Th1 et sont les principales productrices d’interféron-α lors des infections virales (Cella et al., 1999a).
Un autre type de DC, les DC folliculaires, semble avoir une origine et une fonction différentes de DC présentatrices de l’antigène. Elles n’expriment pas les molécules de classe II du CMH et, par conséquent, ne fonctionnent pas comme des APC pour l’activation des Th. Ces DC ont été dénommées ainsi en raison de leur localisation exclusive dans les structures organisées des ganglions, appelées follicules lymphoïdes, qui sont riches en cellules B. Bien qu’elles n’expriment pas de molécules de classe II du CMH, les DC folliculaires expriment des taux élevés de récepteurs membranaires des anticorps et du complément. On pense que la liaison des complexes antigène – anticorps par ces récepteurs facilite l’activation des cellules B dans les ganglions. La présence des complexes antigène – anticorps sur la membrane des DC folliculaires jouerait un rôle dans le développement des cellules B mémoires dans le follicule (Goldsby et al., 2001).
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Table des matières
INTRODUCTION
I. GÉNÉRALITÉS
I.1. GENERALITES SUR LE PALUDISME
I.1.1. DEFINITION
I.1.2. TRANSMISSION
I.1.3. CYCLE DU PARASITE
I.1.4. ÉPIDEMIOLOGIE
I.1.5. CLINIQUE
I.1.6. PHYSIOPATHOLOGIE
I.1.7. IMMUNITE ANTI-PALUSTRE
I.1.7.1. Principaux antigènes de Plasmodium
I.1.7.2. Immunité non spécifique
I.1.7.3. Immunité adaptative
I.1.8. STRATEGIE VACCINALE
I.2. GENERALITES SUR LES CELLULES DENDRITIQUES
I.2.1. CELLULES DENDRITIQUES
I.2.1.1. Origine
I.2.1.2. Sous populations de DC
I.2.1.3. Développement de DC
I.2.1.4. Apoptose de DC
I.2.2. PROPRIETES FONCTIONNELLES CARACTERISTIQUES DES DC
I.2.2.1. Recrutement des DC sur le site d’infection
I.2.2.2. Capture d’antigènes
I.2.2.3. Migration des DC
I.2.2.4. Apprêtement et présentation des antigènes
I.2.3. INTERACTION DES DC AVEC LES LYMPHOCYTES T
I.2.4. INTERACTION DES DC AVEC LES LYMPHOCYTES B
I.2.5. INTERACTION DE DC AVEC LES CELLULES NK
I.2.6. ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNE SPECIFIQUE
I.2.6.1. Rôle des DC dans l’induction de la tolérance
I.2.6.2. Rôle des DC dans les maladies parasitaires
I.2.7. VACCINATION AVEC LES DC
OBJECTIFS
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. MATERIEL
II.1.1. MATERIEL BIOLOGIQUE
II.1.2. MATERIEL TECHNIQUE
II.2. METHODES
II.2.1. CULTURE IN VITRO DE PLASMODIUM FALCIPARUM
II.2.2. EXTRACTION D’HEMOZOÏNE
II.2.3. EXTRACTION DES PROTEINES PARASITAIRES ET PROTEINES MEMBRANES DES GLOBULES ROUGES PARASITES
II.2.4. DOSAGE PROTEIQUE
II.2.5. DOSAGE D’ENDOTOXINE
II.2.6. PURIFICATION DES MONOCYTES A PARTIR DU SANG TOTAL
II.2.6.1. Purification des PBMCs
II.2.6.2. Comptage des PBMCs
II.2.6.3. Purification des monocytes à partir des PBMCs
II.2.6.4. Mise en culture des monocytes
II.2.6.5. Stimulation des DC
II.2.7. PHENOTYPAGE DES DC PAR CYTOMETRIE EN FLUX
II.2.8. EXTRACTION D’ARN TOTAL
II.2.9. REALISATION DE RTPCR
II.2.9.1. Choix des sondes et primers
II.2.9.2. Quantification relative
II.2.9.3. Méthode d’analyse des résultats
II.2.9.4. Validation de la méthode d’analyse
II.2.10. ANALYSE STATISTIQUE
III. RÉSULTATS
III.1. PRODUCTION DE DC IN VITRO
III.1.1. Purification des monocytes à partir de sang total
III.1.2. Capacité de différenciation en DC
III.2. EFFET DES PROTEINES DE P. FALCIPARUM SUR LA MATURATION DES DC
III.2.1. Effet de l’hémozoïne
III.2.2. Effet des protéines parasitaires
III.2.3. Effet des protéines membranaires des globules rouges parasités
III.2.4. Effet de la protéine MSP1
III.2.5. Comparaison des différentes protéines
III.3. EFFET DES PROTEINES DE P. FALCIPARUM SUR LA VIABILITE DES DC
III.4. PRODUCTION DES CYTOKINES PAR LES DC ACTIVEES IN VITRO PAR L’HEMOZOÏNE
III.4.1. Choix du gène de référence
III.4.2. Expression des gènes cibles
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
