Soutenance mémoire
Les infections par des virus responsables de fièvres hémorragiques sont une cause importante de maladies chez l’homme et posent un problème de santé publique à l’échelle mondiale. Ces virus sont actuellement les plus craints des virus de la faune sauvage transmissible à l’homme et parmi eux figure le virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR). Cette anthropozoonose découverte depuis 1931 au Kenya (10) s’est répandue dans le continent africain et même au-delà de ses frontières. Ces dernières années, elle s’est manifestée au Mali, en Mauritanie et au Sénégal causant de nombreuses pertes humaines et animales (16). Les organismes internationaux tels que l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) s’efforcent de mettre au point des méthodes permettant de déceler plus rapidement les flambées et d’éviter la propagation de telles infections. Pour l’étude de la plupart de ces agents pathogènes, il n’existe pas de réactifs commercialisés, et les réactifs qui existent ne sont pas produits en quantité suffisante. Les anticorps ont pendant longtemps joué un rôle essentiel dans le diagnostic de certaines maladies, mais leur efficacité a toujours été limitée par leur nature polyclonale. La solution des problèmes posés par l’hétérogénéité des anticorps a été apportée par la mise au point de la technologie de production d’anticorps monoclonaux (AcM) par Milstein et Köhler en 1975 (32). Ces AcM trouvent de nombreuses applications dans le domaine de la recherche, de la thérapeutique et du diagnostic de certaines affections. C’est dans cette perspective que nous nous sommes investis à la production d’AcM murins dirigés contre le VFVR comme réactifs permettant d’améliorer le diagnostic.
Production des anticorps monoclonaux
Définition
Les anticorps sont des protéines plasmatiques (immunoglobulines) fabriquées par l’organisme en réaction à l’injection de substances étrangères. Ils participent au rejet de ces substances en se combinant spécifiquement avec elles. Bien que spécifiques, les anticorps sécrétés en réponse à un antigène donné présentent une grande diversité : ils proviennent de lymphocytes différents et sont appelés anticorps polyclonaux. En revanche par clonage cellulaire, on peut obtenir des lignées cellulaires produisant des anticorps monoclonaux, tous identiques c’est à dire de même classe et sous-classe, de même spécificité, de même affinité, dirigés contre les différentes parties de l’antigène injecté (2, 13).
Historique
La méthode de fusion cellulaire a été mise au point par G.Barski en France en 1960, mais la technologie de production des anticorps monoclonaux (AcM) de souris est née en 1975 grâce à Köhler et Milstein apportant ainsi la solution aux problèmes posés par l’hétérogénéité des anticorps dans les immuns sérums traditionnels. Ils ont montré que des cellules de splénocytomes murins peuvent être fusionnées avec des cellules spléniques de souris immunisées contre un antigène donné. Ces hybridomes produisent alors des AcM d’une spécificité prédéterminée (25).
Méthodologie de la production des anticorps monoclonaux (AcM)
Immunisation
Choix de l’immunogène
Généralement plus un antigène est de grande taille plus sa structure est complexe, et plus grande est la distance phylogénétique entre l’animal donneur de l’antigène et l’animal à immuniser, meilleure sera la réponse immunitaire induite (48).
Pureté et forme de l’immunogène
La pureté de l’antigène à utiliser comme immunogène n’est pas décisive pour générer des anticorps monoclonaux contrairement aux anticorps conventionnels. Parmi les antigènes naturels, les cellules entières constituent de bons immunogènes et induisent une bonne réponse immunitaire sans l’utilisation d’adjuvants. L’immunisation de souris pour la production AcM requiert l’injection d’un certain nombre de cellules entre 2 .10⁶ et 5.10⁷ cellules (24). Selon Spitz et ses collaborateurs, moins de 20µg de protéines antigéniques ou 2,5.10⁵ cellules suffisent pour immuniser les souris (56). Les molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da sont généralement faiblement immunogènes. Les aminoacides, les monosaccharides, les glycoprotéines, les glycolipides etc ne peuvent induirent elles même une réponse immunitaire : ce sont des haptènes. Des anticorps antihaptènes ne pourront être générés qu’en immunisant avec l’haptène conjuguée à une molécule porteuse immunogène telle que la BSA (Bovine sera albumine).
Des cellules entières peuvent aussi être utilisées comme molécules porteuses, Ahlstedt et Bjorksten l’ont montré en utilisant une lignée murine de cellules tumorales P 388 AD. 2 (1). Des antigènes faiblement immunogènes peuvent être rendus immunogènes par adsorption sur des particules inertes telles que l’hydroxyde d’aluminium, la bentonite etc ou par agrégation et ainsi l’antigène pourra être injecté sous sa forme agrégée (24). A coté de ces antigènes naturels, il existe des antigènes dits modifiés ou synthétiques qui regroupent les antigènes ou haptènes qui physiologiquement ne sont pas immunogènes mais le deviennent lorsqu’ils sont couplés à des molécules porteuses. Parmi les antigènes synthétiques les oligopeptides ont récemment été les premiers à donner des résultats satisfaisants dans la production d’anticorps .
Choix de l’espèce animale
Le choix de l’espèce et de la souche de l’animal à utiliser comme donneur de rate immune pour la fusion dépend largement des cellules de myélomes disponibles et de l’origine de l’antigène d’immunisation. Les souris sont les plus couramment utilisées pour l’immunisation surtout parce qu’il y a plus de cellules de myélomes murins disponibles. De plus les souris sont plus faciles à élever et à manipuler et en général elles répondent mieux que les rats. Les souris de souche de Balb /c sont utilisées de préférence et depuis tous les myélomes murins utilisables pour des fusions ont été dérivés de cette souche. Pour des raisons encore peu précises, l’efficacité des hybridomes rat x rat est plus faible que celle des hybridomes souris x souris dans la plupart des laboratoires. Cependant, certains chercheurs ont fusionné des splénocytes de rats et des cellules de myélome de souris et ont obtenu des hybridomes qui secrètent des AcM de façon stable dans des cultures de tissus (17).
IL faut utiliser des animaux en bonne santé, non stressés, âgés de 8 à 12 semaines. Des souris âgés de 8 semaines donnent en même temps des IgG totaux et l’anticorps spécifique. Le sexe des souris ne semble pas avoir un impact significatif sur la réponse immunitaire (28, 29).
L’influence des adjuvants sur la réponse immunitaire
Les adjuvants permettent d’augmenter la réponse immunitaire, de diminuer la dose d’antigène requise et de réduire le nombre d’injections. Ils agissent par différents mécanismes : ils activent les macrophages, attirent les lymphocytes vers l’antigène ou améliorent la présentation de l’antigène et la formation du dépôt. Ils agissent en différant la libération de l’antigène du dépôt formé à l’injection en modifiant la phagocytose des antigènes et en modulant la fonction des cellules immunes aux moyens de composants bactériens (Mycobacterium, Bordetella pertusis…) La plupart des adjuvants comme le Lipopolysaccaride (LPS), l’adjuvant complet de Freund (ACF), stimule de façon non spécifique la production d’immunoglobulines et provoque une stimulation polyclonale du système immunitaire ce qui n’est pas le cas lorsque l’antigène est utilisé seul (23). Beaucoup d’adjuvants agissent à la surface des cellules parce qu’ils renferment des composants hydrophiles et lipophiles et parmi eux : les saponines, les liposomes, lysolecithines, les polyalcools, les amines lipophiles, les glycolipides… A côté de ce groupe il existe une autre classe d’adjuvants avec des propriétés physico-chimiques différentes, ce sont des polymères anioniques tels que les polynucléaires, le dextran sulfate… Aucune de ces substances n’est indiquée comme étant celle qui convient spécialement à la production des AcM.
Prises individuellement elles sont de loin moins bonnes que les adjuvants classiques que sont l’adjuvant complet / incomplet de Freund et l’hydroxyde d’aluminium. L’adjuvant incomplet de Freund est constitué d’une simple émulsion eau dans huile. Si l’on inclut dans la phase huileuse Mycobacterium tuberculosis inactivé par la chaleur, on parle d’adjuvant complet de Freund. Ce dernier n’est généralement requis que pour la première innoculation, pour les suivantes on utilise l’adjuvant incomplet (48). Il existe d’autres adjuvants issus de synthèses chimiques ou extraits de plantes, de bactéries tels que le lipopolysaccharide (LPS ) préparé à partir de bactéries gram négatif comme Escherichia coli, Salmonela ou d’autres enterobacteries (4).
Protocoles d’immunisation
Selon Rathjen et ses collaborateurs il y a 6 règles d’or pour l’immunisation
1-Utiliser des animaux en bonne santé, non stressés, âgés de 8 à 12 semaines
2-Immuniser plusieurs animaux
3-Utiliser le peu d’antigène possible
4-Maximiser l’immunogénicité en évitant la tolérance. Faciliter l’accès de l’antigène aux cellules cibles par des injections intraveineuses ou intra péritonéales ou par des injections intramusculaires ou sous cutanés à des points différents
5-Etre patient : attendre que le titre anticorps de la 1ère innoculation baisse à nouveau ( ceci permet de diminuer la proportion d’antigène perdue par liaison avec le sérum anticorps)
6-L’adjuvant complet/incomplet de Freund est le meilleur .
Organes cibles et voies d’inoculation
La cavité péritonéale se trouve être l’endroit idéal pour la 1ère immunisation. Les injections sous cutanées stimulent les lymphocytes des nœuds lymphatiques périphériques plutôt que ceux de la rate. L’utilisation d’adjuvant de Freund en injection dans les pattes peut provoquer une inflammation et un renflement ce qui est atroce pour les animaux. Les injections intradermiques ou intramusculaires peuvent entraîner des ulcérations mortelles. Les injections intraveineuses qui sont difficilement réalisables et pouvant occasionner un choc anaphylactique mortel sont toutefois pratiquées exceptionnellement lors du boost précédant la fusion. L’injection directe d’antigènes solubles ou liés dans la rate permet de réduire les doses d’immunogènes à utiliser (48). En principe les souris peuvent aussi être immunisées par des injections dans les nœuds lymphatiques de l’abdomen et le volume à appliquer n’excède pas 1µl mais la concentration en antigène sera relativement élevée .
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Table des matières
Introduction
Première partie : Généralités sur les AcM et le VFVR
Chapitre I : Production des AcM
1 – Définition des AcM
2 – Historique
3 – Méthodologie de la production
3.1 – Immunisation
3.1.1 – Choix de l’immunogéne
3.1.2 – Pureté et forme de l’immunogéne
3.1.3 – Choix de l’espèce animale
3.1.4 – L’influence des adjuvants sur la réponse immunitaire
3.1.5 – Protocoles d’immunisation
3.1.6 – Organes cibles et voies d’inoculation
3.2 – Fusion
3.3 – Clonage
Chapitre II : Le virus de la FVR
1 – Définition de l’agent pathogéne
2 – Epidémiologie-Transmission et Clinique- Traitement et Prévention
2.1 – Epidémiologie
2.2 – Transmission et Clinique
2.3 – Traitement et Prévention
3 – Diagnostic de laboratoire
3.1 – Les méthodes virologiques
3.2 – Les méthodes sérologiques
3.3 – La méthode histopathologique
3.4 – Les méthodes génétiques
4 – Cibles antigéniques de la réponse immunitaire
Deuxième partie : Travaux personnels
Chapitre I : Objectifs
Chapitre II : Matériel et Méthodes
1 – Matériel
1.1 – Matériel biologique
1.2 – Matériel technique de laboratoire
1.3 – Tampons et réactifs
2 – Méthodes
2.1 – Préparation des Ag
2.1.1 – A partir de cultures cellulaires
2.1.1.1 – Culture de cellules VERO
2.1.1.2 – Infection des cellules VERO
2.1.2 – A partir de cerveaux de SNN
2.2 – Préparation des ascites polyclonaux
2.3 – Immunisation
2.4 – Fusion
2.4.1 – Avant la fusion
2.4.2 – Le jour de la fusion
2.4.2.1 – Préparation des cellules de myélome X63
2.4.2.2 – Préparation des cellules spléniques
2.4.2.3 – Calcul du mélange de fusion
2.4.2.4 – Fusion
2.4.2.5 – Calcul du nombre de plaques de 24 puits à utiliser
2.4.2.6 – Changement du milieu de fusion
2.5 – Sélection des hybridomes
2.6 – Clonage
Chapitre III : Résultats
1 – Titrage Ag de cerveau
2 – Titrage ascites polyclonaux
3 – Immunisation
4 – Fusion et clonage avec la souche MP12
5 – Fusion et clonage avec la souche CL13
Chapitre IV : Discussion
Conclusion
