Soutenance mémoire
Le Virus Respiratoire Syncytial (HRSV) humain est l’un des agents le plus fréquemment impliqué dans les infections respiratoires basses aigues en pédiatrie. C’est l’un des motifs d’admission majeur aux urgences pédiatriques pendant la saison hivernale dans les pays développés. D’après une méta analyse, 33,1 millions d’épisodes d’infections respiratoires basses aigues dues au HRSV ont eu lieu chez des enfants de moins de 5 ans en 2015 . Les infections liées au HRSV sont également fréquentes chez les personnes âgées et chez les adultes à risques (particulièrement les immunodéprimés).
Il existe deux sous-groupes antigéniques, les HRSV-A et les HRSV-B, parmi lesquels on retrouve une grande diversité de génotypes. Il s’agit d’un virus à ARN, qui subit de fréquentes modifications génétiques. L’élaboration d’un vaccin est actuellement en cours, ainsi que la recherche et le développement d’un traitement antiviral efficace.
L’épidémiologie moléculaire du HRSV est donc indispensable pour avoir des informations sur les génotypes circulants et l’évolution du virus.
Généralités sur le Virus Respiratoire Syncytial
Un peu d’histoire
Le HRSV a été découvert chez un chimpanzé ayant une infection respiratoire en 1955 . Il avait alors été appelé le Coryza du Chimpanzé. Il a été isolé quelques temps plus tard, en 1957, chez 2 enfants ayant une infection respiratoire . On l’a nommé Virus Respiratoire Syncytial du fait de son tropisme pour le système respiratoire et du syncytium caractéristique en culture cellulaire. Il est rapidement devenu l’agent le plus fréquemment isolé dans les infections respiratoires basses aigues des nourrissons et des jeunes enfants grâce à la mise en place de diagnostic rapide par immunofluorescence . Le HRSV est aujourd’hui une des principales causes d’infection respiratoire basse aigue au niveau mondial, nécessitant des millions d’hospitalisation chaque hiver et entrainant de nombreux décès, particulièrement chez les nourrissons de moins de 6 mois .
Virologie
Classification
Le HRSV est classé dans la famille des Pneumoviridae au sein de l’ordre des Mononegavirales . Cette famille a été créée lors de la revue de la classification par l’ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) en 2016. Auparavant le HRSV appartenait à la famille des Paramyxoviridae .
La famille des Pneumoviridae est composée de 2 genres, les Metapneumovirus dont les espèces peuvent infecter des mammifères et des oiseaux et les Orthopneumovirus qui n’infectent que des mammifères. Deux espèces ont un tropisme limité à l’homme, le métapneumovirus humain (hMPV) et les orthopneumovirus humains comprenant les virus respiratoires syncytiaux.
Structure du virus et génome
Les caractéristiques structurales des HRSV sont communes aux Paramyxoviridae et aux Pneumoviridae. Ce sont des virus à ARN non segmenté, simple brin, de polarité négative. La réplication et la transcription ont lieu dans le cytoplasme de leur cellule hôte. Les virions sont enveloppés et leur nucléocapside est hélicoïdale. Le génome du HRSV (de 15 à 20 kb environ) code pour 11 protéines. Le HRSV est un virus pléomorphe, observable en microscopie électronique sous une forme sphérique ou bien filamenteuse. Sa taille varie de 100 à 350 nm de diamètre pour la forme sphérique, les filaments peuvent mesurer jusqu’à 10 µm de long .
L’enveloppe du virus, qui provient de la membrane cytoplasmique de la cellule hôte lors du bourgeonnement, est de nature lipidique . Trois protéines y sont encrées : la protéine G (glycoprotéine d’attachement), la protéine F (protéine de fusion) et la protéine SH (petite protéine hydrophobe). La protéine de matrice M forme une couche structurée située entre l’enveloppe et la nucléocapside.
L’ARN génomique viral, monocaténaire, non segmenté et de polarité négative, est constitué d’environ 15 000 nucléotides . Il contient 10 gènes, débute en 3’ par une région extragénique « leader » et se termine en 5’ par une région « trailer » . Il est encapsidé par la nucléoprotéine N en une structure hélicoïdale qui sert de matrice au complexe de réplication virale . Ce dernier est formé par la protéine L (polymérase virale), ainsi que son cofacteur la protéine P (phosphoprotéine) et des protéines M2-1 et M2-2. L’ensemble des 4 protéines N, L, P, M2-1 constitue la ribonucléocapside.
Protéines virales
Le génome du HRSV code pour 11 protéines virales. Le gène M2 possède deux cadres de lecture, et code donc pour 2 protéines : M2-1 et M2-2. Les 3 protéines d’enveloppe (G, F et SH) sont les plus étudiées car elles sont les cibles potentielles de traitements antiviraux et de vaccins . Les glycoprotéines F et G sont les seuls Ag viraux capables d’induire la synthèse d’Ac neutralisants .
Glycoprotéine d’attachement G
La glycoprotéine G est synthétisée à partir du gène G sous deux formes : une forme transmembranaire, Gm, d’environ 298 acides aminés et une forme soluble Gs, plus courte (environ 65 acides aminés de moins) . La forme Gm est une protéine transmembranaire de type II (la partie C-terminale est extracellulaire), elle est incorporée dans l’enveloppe des virions sous une forme tétratmérique. La portion cytoplasmique N-terminale correspond aux acides aminés 1 à 37, la région transmembranaire s’étend des acides aminés 38 à 68 et la partie Cterminale (acides aminés 68 à 298) est extracellulaire .
La forme Gs est sécrétée à partir des cellules infectées. Sa traduction débute au niveau du deuxième codon AUG (codon 48) de l’ARNm du gène G et la protéine Gs est obtenue par clivage après le résidu 65 . Elle ne possède pas la région cytoplasmique N-terminale, ni le domaine transmembranaire et correspond donc à l’ectodomaine de la protéine G. Son rôle n’est pas encore complètement défini, bien qu’il ait été décrit qu’elle diminuerait l’activité antivirale des macrophages pulmonaires et du complément et agirait comme un leurre auprès des anticorps antiHRSV afin que le virus échappe au système immunitaire de l’hôte infecté .
L’ectodomaine de la protéine G est composé de deux régions hautement glycosylées « mucin-like » (très riches en résidus sérine, thréonine et proline qui sont caractéristiques des mucines) qui entourent une courte région centrale. La séquence des domaines « mucin-like » est très variable, d’où leur nom de « régions hypervariables ». Ainsi, la protéine G est la plus variable des protéines du HRSV, c’est pourquoi elle a été très étudiée et est à l’origine des études d’épidémiologie moléculaire et d’évolution des HRSV. La majorité d’entre elles sont jusqu’à présents basées sur la deuxième région hypervariable.
La région centrale est composée d’une partie hautement conservée : une séquence de 13 acides aminés (164 à 176) qui est strictement conservée, ainsi que 4 résidus cystéine (173, 176, 182 et 186) présents dans toutes les souches de HRSV, qui sont à l’origine de 2 ponts disulfures . Cette conformation tridimensionnelle forme le site de liaison de la protéine G . L’un des principaux récepteurs du HRSV, présent à la surface des ses cellules hôtes, est un glycosaminoglycane (GAG) : l’héparane sulfate . On trouve également dans la région centrale un motif CX3C qui imite une chimiokine, la fractalkine et se lie à son récepteur spécifique CX3CR1, ce qui réduirait la réponse immunitaire cellulaire de l’hôte .
|
Table des matières
1. Introduction
2. Généralités sur le Virus Respiratoire Syncytial
2.1. UN PEU D’HISTOIRE !
2.2. VIROLOGIE
2.2.1. Classification
2.2.2. Structure du virus et génome
2.2.3. Protéines virales
2.2.3.1. Glycoprotéine d’attachement G
2.2.3.2. Protéine de fusion F
2.2.3.3. Petite protéine hydrophobe SH
2.2.3.4. Protéine de matrice M
2.2.3.5. Protéines non-structurales NS1 et NS2
2.2.3.6. Nucléoprotéine N
2.2.3.7. Polymérase L
2.2.3.8. Phosphoprotéine P
2.2.3.9. Facteur de transcription M2-1
2.2.3.10. Protéine régulatrice M2-2
2.2.4. Cycle de réplication viral
2.2.4.1. Attachement et pénétration du virus dans la cellule hôte
2.2.4.2. Transcription, traduction et réplication
2.2.4.3. Assemblage du virus et bourgeonnement
2.2.5. Sous-groupes antigéniques et diversité
2.3. PATHOGENESE
2.4. MANIFESTATIONS CLINIQUES
2.5. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
2.6. EPIDEMIOLOGIE
2.7. TRAITEMENTS/VACCINATION
2.7.1. Thérapies curatives
2.7.1.1. Inhibiteurs de fusion
2.7.1.2. Inhibiteurs de la polymérase
2.7.1.3. Autres
2.7.2. Thérapies préventives
2.7.2.1. Vaccins
2.7.2.2. Anticorps monoclonaux
3. Objectifs de l’étude
4. Matériels et Méthodes
4.1. SELECTION DES ECHANTILLONS
4.2. EXTRACTION
4.3. DETECTION DES HRSV-A
4.3.1. Organisation de prise en charge des échantillons respiratoires au laboratoire
4.3.2. Détermination du sous-groupe antigénique
4.4. AMPLIFICATION DU GENE G COMPLET
4.4.1. Choix des amorces
4.4.2. Amplification
4.4.3. Contrôle de l’amplification
4.5. SEQUENÇAGE
4.5.1. Purification des produits d’amplification
4.5.2. Réaction de marquage
4.5.3. Purification des produits de marquage
4.6. ANALYSE DES SEQUENCES OBTENUES ET PHYLOGENIE
5. Résultats et discussion
5.1. EPIDEMIOLOGIE DES INFECTIONS A HRSV EN NORMANDIE DE 2011 A 2018
5.1.1. Résultats
5.1.2. Discussion
5.2. SELECTION DES ECHANTILLONS ET SEQUENÇAGE
5.2.1. Résultats
5.2.2. Discussion
5.3. ANALYSE DES SEQUENCES OBTENUES ET PHYLOGENIE
5.3.1. Résultats
5.3.2. État des lieux dans la littérature
5.3.3. Discussion
6. Conclusion
Bibliographie
Annexes
