Soutenance mémoire
La fièvre Chikungunya (CHIK) est une maladie virale transmise principalement par des moustiques du genre Aedes (Robinson., 1955 ; Jupp et MacIntosh., 1988). Récemment, cette maladie a connu une recrudescence dans le monde avec des épidémies notamment à l’île de La Réunion en 2005 avec 266 000 personnes infectées, en Inde avec 1 400 000 cas rapportés en 2006 (Pialoux et al., 2007), en République Démocratique du Congo (Pastorino et al., 2004), au Cameroun (Kuniholm et al., 2006), au Gabon et au Sénégal (Sall., données publiées). Le virus CHIK circule en Afrique subsaharienne, en Asie et dans l’Océan indien. Il existe trois génotypes du virus CHIK: « ouest africain », « afrique centrale, de l’est et du sud » (ECSA), et « asiatique » (Powers et al., 2000 ; Schuffenecker et al., 2006).
La maladie se manifeste par de la fièvre, des céphalées et surtout par des atteintes articulaires ou arthralgies qui peuvent persister des mois voire des années (Jupp et MacIntosh., 1988) d’où le caractère invalidant de la maladie qui peut dans certains cas devenir un réel problème de santé publique avec des répercussions socio-économiques importantes lorsqu’elle conduit à des absences ou hospitalisations massives ou quand elle a des incidences sur le secteur touristique.
La circulation active du virus CHIK au Sénégal et le contexte de recrudescence mondiale de cette infection notamment dans l’Océan indien, en Afrique centrale et en Asie (Inde, Indonésie…) impliquent qu’une stratégie de prévention et de contrôle efficace soit mise en place. Par conséquent, il est essentiel de disposer d’une approche et de méthodes de diagnostic performantes pour une identification précoce des foyers épidémiques. Dans un tel contexte, les méthodes moléculaires de diagnostic (i.e. RT-PCR classique, nichée ou en temps réel) peuvent jouer un rôle déterminant pour plusieurs raisons : i) elles permettent d’identifier les patients virémiques qui sont ceux qui transmettent l’infection ; ii) elles sont plus rapides et plus sensibles que l’isolement viral et donnent des informations assez similaires ; iii) elles sont complémentaires des méthodes sérologiques qui sont le plus souvent utilisées et permettent de les renforcer.
GENERALITES SUR LE VIRUS ET LA FIEVRE CHIK
Le mot « Chikungunya » est un terme issu d’un dialecte local swahili employé pour la première fois par les peuples de la province Sud du Tanganyika (Tanzanie) suite à une épidémie qui les a affectés en 1952-1953. Il signifie « courbé en avant » en raison de la posture adoptée par les malades (Jupp et MacIntosh., 1988). Il s’agit d’une maladie due au virus CHIK isolé pour la première fois en 1953 au décours d’une épidémie de fièvre qui sévissait sur le plateau du Makonde dans la province de Newala au Tanganyika, l’actuelle Tanzanie (Robinson., 1955 ; Jupp et MacIntosh., 1988). Elle se manifeste par de la fièvre, des céphalées mais principalement par des atteintes articulaires ou arthralgies. Le virus est principalement transmis par des moustiques du genre Aedes (Jupp et MacIntosh., 1988). Il circule en Afrique, en Asie et dans l’Océan indien. Avant 1952, il semble que des épidémies décrites dans la littérature aient pu être causé par le virus CHIK. Ainsi, Carey a émis l’hypothèse que certaines épidémies attribuées au virus de la dengue comme celles du Caire et Batavia-Jakarta en 1779, de Zanzibar en 1823 et 1870, de l’Inde en 1824-1825 et 1871-1872, de Hong Kong, de la Birmanie (actuel Myanmar) ou Madras en 1901 1902, étaient en fait des épidémies de CHIK (Carey et al., 1969).
LE VIRUS CHIKUNGUNYA
Classification
Le virus CHIK est un arbovirus de la famille des Togaviridae et du genre Alphavirus qui compte 28 membres dont certains provoquent des infections chez l’homme. Il s’agit des virus Chikungunya (CHIK), O’Nyong Nyong (ONN), Ross River (RR), Barmah Forest (BF), Sindbis (SIN) et Mayaro (MAY). Les alphavirus forment 7 complexes antigéniques, le virus CHIK appartenant au complexe Semliki Forest (Jupp et MacIntosh., 1988 ; Strauss et Strauss., 1994).
Structure et Organisation
Le virus CHIK est enveloppé de 60-70 nm de diamètre dont le génome est un ARN simple brin à polarité positive. Il est sensible à la dessiccation et aux températures voisines de + 58°C (Zhang et al., 2002). Le virion est une particule sphérique composée de trois parties : l’enveloppe, la nucléocapside et le génome viral .
L’enveloppe
Il s’agit d’une enveloppe lipoprotéique de forme sphérique, d’une épaisseur d’environ 4,8 nm et dérivée de la membrane cellulaire de la cellule hôte. Dans cette enveloppe, on note deux sous unités glycoprotéiques principales E1 et E2, une sous- unité E3 accessoire et la 6K. E1 et E2 sont toutes les deux glycosylées (Strauss et Strauss., 1994). E1est responsable de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de la cellule hôte (Mukhopadhyay et al., 2006). E2 est impliquée dans les mécanismes de fixation et de bourgeonnement du virus (Mukhopadhyay et al., 2006). E3 est associée au virus dans certains cas (Strauss et Strauss., 1994). La 6K est impliquée dans l’assemblage des particules virales (Strauss et Strauss., 1994).
La nucléocapside
Elle est constituée de 240 monomères de la protéine de capside d’un poids de 30 Kda, formant un complexe de forme icosaédrique enveloppant l’ARN viral (Strauss et Strauss., 1994).
Le génome viral
Le génome du virus CHIK est un un ARN simple brin d’environ 11 805 nucléotides avec une coiffe méthylée à l’extrémité 5’ et une queue polyadénylée à l’extrémité 3’. Il est organisé en une région codante, subdivisée en deux parties codant respectivement pour les protéines non structurales (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) et structurales (C, E3, E2, 6K, E1) (Khan et al., 2002) et flanquée d’une région 5’ et 3’ non codante .
Cycle cellulaire
Le virus se fixe d’abord sur des récepteurs membranaires de la cellule hôte avant d’être internalisé par endocytose pour se retrouver dans le cytoplasme à l’intérieur d’une vacuole appelée endosome. Après fusion de l’enveloppe virale avec celle de l’endosome, la nucléocapside libérée s’associe aux ribosomes pour se décapsider et libérer l’ARN génomique dans le cytoplasme cellulaire. L’ARN génomique va servir de matrice pour la synthèse de l’ARN complémentaire (ARNC brin négatif) qui à son tour va être utilisée pour la synthèse d’ARN génomique (brin positif) et d’ARN subgénomique (brin positif) ou ARN 26S. Les ARN génomique et subgénomique nouvellement synthétisées vont permettre la synthèse des protéines non structurales et structurales (Lanzrein et al., 1994) respectivement. Aussi ; l’ARN génomique sera encapsidé pour former de nouveaux virions.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
I. GENERALITES SUR LE VIRUS ET LA FIEVRE CHIKUNGUNYA
I. 1 LE VIRUS CHIKUNGUNYA
I.1.1 Classification
I.1.2 Structure et Organisation
I.1.2.1 L’enveloppe
I.1.2.2 La nucléocapside
I.1.2.3 Le génome viral
I.1.3 Cycle cellulaire
I.2 LA FIEVRE CHIKUNGUNYA
I.2.1 Manifestations cliniques
I.2.2 Diagnostic, prévention, traitement
I.2.2.1 Diagnostic
I.2.2.1.1 L’isolement
I.2.2.1.2 Le diagnostic sérologique
I.2.2.1.3 Le diagnostic moléculaire
I.2.2.2 Prévention
I.2.2.3 Traitement
I.2.3 Epidémiologie
I.2.3.1 Distribution géographique
I.2.3.2 Les épidémies
I.2.3.3 Cycle de transmission
II. LE VIRUS CHIKUNGUNYA AU SENEGAL
DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES D’ETUDE
I. MATERIEL BIOLOGIQUE
I. 1. Les souches virales
I. 2. Les cellules
II. METHODES D’ETUDE
II. 1 Plan d’étude
II. 2 Préparation de stock viral
II. 2. 1. Préparation de milieu de culture pour cellules AP 61
II. 2.1.1 Exemple pratique
II. 2. 2 Culture cellulaire : type AP 61
II. 2.2.1 Objectif
II. 2.2.2 Mode opératoire
II. 2. 3 Infection des cultures cellulaires
II. 2.3.1 Mise en suspension des virus
II. 2.3.2 Infection
II. 2. 4 Immunofluorescence indirecte (IFI)
II. 2.4.1 Principe
II. 2.4.2 Mode opératoire
II. 3 Extraction d’ARN à partir des surnageants viraux
II. 3.1 Principe
II. 3.2 Mode opératoire
II. 4 Choix des méthodes de RT-PCR
II. 5 Transcription inverse (RT) et Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
II. 5. 1 Transcription inverse (RT)
II. 5.1.1 Principe
II. 5.1.2 Mode opératoire
II. 5. 2 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
II. 5.2.1 Principe
II. 5.2.2 Mode opératoire
II.2.6 Evaluation de la méthode RT-PCR
II.2.6.1 Titrage des stocks viraux
II. 2.6.1.1 But
II. 2.6.1.2 Mode opératoire
II.2.6.2 Détermination de la spécificité
II.2.6.3 Détermination du seuil de détection
II.2.6.4 Détermination de la répétabilité
II.2.6.5 Mise au point de nouvelles amorces
II.2.7 Etude de la variabilité moléculaire
II.2.7.1 Séquençage
II. 2.7.1.1 But
II. 2.7.1.2 Purification des produits PCR
II. 2.7.1.3 Analyse des séquences
II.2.7. 2 Analyse phylogénétique
TROISIEME PARTIE: RESULTATS ET DISCUSSION
I. RESULTATS
I.1 Titrage des stocks viraux
I.2 Diagnostic par RT-PCR
I.3 Evaluation de la RT-PCR
I.3.1 Détermination de la spécificité
I.3.2 Mise au point de nouvelles amorces
I.3.3 Evaluation des amorces Chik 428S 17 et Chik 729C 17
I.3.3.1 Diagnostic RT-PCR
I.3.3.2 Spécificité des amorces Chik 428S 17/Chik 729C 17
I.3.3.3 Seuil de détection des amorces Chik 428S 17/Chik 729C 17
I.4 Variabilité moléculaire
I.4.1 Analyse des séquences
I.4.2 Analyse phylogénétique
II. DISCUSSION
II.1. Diagnostic moléculaire
II.2 Variabilité moléculaire
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
