GENERALITES SUR LE STRESS OXYDATIF ET LES ANTIOXYDANTS

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Définition des radicaux libres

L’oxygène est un élément essentiel pour les organismes multicellulaires parce qu’il permet de produire de l’énergie en oxydant la matière organique. Mais nos cellules convertissent une partie de cet oxygène en métabolites toxiques, nommés radicaux libres (Meziti, 2007). Selon la définition proposée par Goudable et al. (1997), un radical libre est une espèce chimique, molécule, morceau de molécule ou simple atome, capable d’avoir une existence indépendante (« libre») en contenant un ou plusieurs électrons célibataires (électron non apparié sur une orbitale).
Cela lui confère une grande réactivité donc une demi-vie très courte. En effet, ce radical libre aura toujours tendance à remplir son orbitale en captant un électron pour devenir plus stable : il va donc se réduire en oxydant un autre composé.

Les sources de radicaux libres

Origine endogène

Les radicaux libres sont produits par divers mécanismes physiologiques, la plupart des radicaux libres se forment au cours du métabolisme de l’oxygène (réduction de l’oxygène moléculaire en eau) dans les mitochondries. Le passage d’une molécule d’oxygène à deux molécules d’eau nécessite l’action de quatre électrons selon l’équation suivante : O2 + 4 e- + 4 H+ 2 H2O
Cependant, et jusqu’à 5 % des cas, on peut assister à une réduction incomplète de l’oxygène en eau. Cette réduction incomplète aboutit à la production de l’oxygène singulet (1O2) mais surtout de l’anion superoxyde (O2.-). La dismutation de O2.-va donner naissance au peroxyde d’hydrogéne (H2O2) puis indirectement au radical hydroxyl (OH.) (Valko et al., 2006).
 Radical superoxyde
Dans l’organisme une partie de l’oxygène moléculaire peut capter de manière univalente et séquentielle un électron conduisant alors à la formation du chef de file des espèces oxygénées réactives : l’anion superoxyde O2 + e- O2.- (Koechlin-Ramonatxo, 2006).
 Peroxyde d’hydrogène
Le Peroxyde d’hydrogène H2O2 n’est pas un radical libre mais peut être formé secondairement à la dismutation de O2.- par la superoxyde-dismutase ou produit par réduction bivalente de l’oxygène grâce à un grand nombre de déshydrogénases, notamment l’acyl CoA déshydrogénase, la NADH déshydrogénase, la xanthine oxydase, l’uricase, la monoamine-oxydase…etc (Jadot, 1994).
O2.-+ 2H+ H2O2 + O2
O2+ 2 e- + 2H+ H2O2
Le peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) est également un agent oxydant très réactif; c’est pour cela qu’on l’utilise souvent comme désinfectant et comme agent de blanchiment. S’il n’est pas rapidement détruit, il peut se décomposer et produire des radicaux hydroxyles qui s’attaquent aux macromolécules de la cellule (Karp, 2010).
 Radical hydroxyle
Il peut être produit à la suite de diverses réactions.
Nous en citerons deux à titre d’exemple :
– la réaction d’Haber-Weiss :
O2.- + H2O2 OH. + OH− + O2
– la réaction de Fenton :
Fe2++ H2O2 Fe3+ + OH− + OH. (Pelletier et al., 2004).
Le radical hydroxyle possède une très grande réactivité dans les milieux biologiques, pouvant se « combiner » avec de nombreuses molécules avec une constante de vitesse de l’ordre de 109 à 1010 M-1.s-1.
Il est capable de réagir avec presque tous les composants cellulaires par échange d’électron, addition sur les doubles liaisons ou arrachement d’un atome d’hydrogène, c’est un oxydant très puissant, constituant certainement le radical libre le plus toxique en biologie et serait à l’origine de la production des radicaux libres « secondaires », suite à sa réaction avec différents composés cellulaires (Lacolley, 2007).

Origine exogène

L’environnement et le mode de vie sont également responsables de la création et de l’accumulation de radicaux libres dans l’organisme. Ces facteurs environnementaux incluant des agents cancérogènes non-génotoxiques peuvent directement, ou indirectement, être impliqués dans la génération de radicaux libres (xénobiotiques, activation des leucocytes…).
Les rayonnements UV induisent la synthèse de O2.-, OH.,1O2 et d’H2O2 l’intermédiaire d’agents photo sensibilisants (Sumaya Martinez, 2004).
L’oxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2) présents dans notre mode de vie (tabagisme, radiations ionisantes, champs électriques, polluants industriels..), une alimentation riche en graisses saturées et en sucre, les consommation d’alcool sont autant d’éléments favorisant la genèse de radicaux libres (Mena et al., 2009).

Rôles des radicaux libres

Le paradoxe des radicaux libres en biologie est qu’ils constituent des espèces extrêmement dangereuses, susceptibles d’engendrer un nombre considérable de maladies, tout en étant des espèces indispensables à la vie.
Ils remplissent en effet de très nombreuses fonctions utiles qui à part la phagocytose, ont été découvertes récemment.
Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, à la transduction de signaux cellulaires, à la défense immunitaire contre les agents pathogènes, à la destruction par apoptose des cellules tumorales, à la régulation de la dilatation capillaire, au fonctionnement de certains neurones et notamment ceux de la mémoire, à la fécondation de l’ovule, à la régulation des gènes (Favier, 2003), à la production énergétique, au règlement de la croissance des cellules et à la signalisation intracellulaire (Ardestani et al., 2007).

Pathologies impliquant des métabolites réactifs d’oxygène:

Pendant longtemps, la formation des radicaux libres et le développement du stress oxydatif dans la vie des organismes ont été considéré comme des événements exclusivement destructeurs, menant à divers effets physiopathologiques. En effet, de nombreuses études ont montré que le développement de plusieurs maladies est associé à la surproduction de radicaux libres (Amzall, 2010).
La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l’âge, car le vieillissement diminue les défenses anti-oxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux. En faisant apparaître des molécules biologiques anormales et en sur-exprimant certains gènes, le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies: cancers, cataracte, sclérose latérale amyotrophique, syndrome de détresse respiratoire aigu, œdème pulmonaire, vieillissement accéléré… (Atti, 2014).
Le stress oxydant est aussi un des facteurs potentialisant l’apparition de maladies plurifactorielles tels que le diabète, la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires (Favier, 2003).

Les antioxydants:

Définition:

En conditions normales, le métabolisme aérobique chez les mammifères génère des substances réactives de l’oxygène, lesquelles sont susceptibles de créer d’importants préjudices à l’organisme. Le stress oxydatif est impliqué dans un large spectre de maladies qui ont un impact énorme sur la santé des populations. Il est souvent initié et propagé par une surproduction d’O2.- et de H2O2 et par leur conversion en de puissants oxydants qui sont très dommageables pour les cellules. Cependant, en guise de protection, les cellules possèdent des mécanismes de défense endogènes enzymatiques et non-enzymatiques qui, de manière générale, suffisent à renverser le stress oxydant résultant du métabolisme aérobique et que l’on appelle antioxydants. Les antioxydants ont comme principal rôle de neutraliser et de dégrader les radicaux libres toxiques pour les tissus. Les antioxydants sont définis par Halliwell (1999) comme « toute substance qui, en faible concentration par rapport au substrat susceptible d’être oxydé, prévient ou ralentit l’oxydation de ce substrat ». Les antioxydants sont donc des molécules qui peuvent prévenir la formation des ERO, ou qui peuvent réagir avec ces derniers pour les neutraliser.
En guise de protection, l’organisme possède des mécanismes de défense endogènes enzymatiques et non-enzymatiques ainsi que des systèmes de protection exogènes.

Antioxydants endogènes

Antioxydants enzymatiques

 La superoxyde dismutase (SOD)
Elle catalyse la dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène et en oxygène moléculaire 2O2.-+2H+ SOD H2O2+O2
Elles constituent une première ligne de défense très efficace en empêchant l’accumulation cellulaire de superoxyde.
 La catalase
Essentiellement présente dans les peroxysomes et dans les érythrocytes, la catalase est capable de transformer le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire mais leur rôle est très important surtout en présence d’ions ferreux (Lindau – Sehpard et Shaffer, 1993). 2H2O2 CAT O2+2H2O
 La glutathion peroxydase (GPX)
Les glutathions peroxydases sont localisées dans le cytosol et dans les mitochondries. Le rôle de la glutathion peroxydase (GPx) est de réduire d’une part le peroxyde d’hydrogène en molécule d’eau, et d’autre part les hydroperoxydes organiques (ROOH) en alcools (Atti, 2014).
Cette enzyme lutte contre les radicaux libres qui, s’ils sont en trop grand nombre, vont attaquer et détruire l’ADN (Lah, 2014).

Antioxydants non enzymatiques

Ces types d’antioxydants possèdent un avantage considérable par rapport aux antioxydants enzymatiques. Du fait de leur petite taille, ils peuvent en effet pénétrer facilement au cœur des cellules et se localiser à proximité des cibles biologiques. Ils regroupent un grand nombre de substances hydrophiles ou lipophiles et ils sont produits par l’organisme au cours de processus biosynthétiques.
 La transferrine ou sidérophiline et la lactoferrine
Elles exercent leurs effets protecteurs en complexant le fer, l’empêchant ainsi de catalyser la formation du OH• (Diop, 2013).
 La céruloplasmine
Elle agit en transportant le cuivre et en neutralisant l’anion superoxyde. Elle catalyse également l’oxydation du fer ferreux en fer ferrique sans libération de radicaux libres oxygénés intermédiaires (Niang, 2014).
 L’albumine
Elle se combine au cuivre et empêche la formation du radical hydroxyle (OH.). C’est également un piégeur de l’acide hypochloreux (HClO), un oxydant produit par la myéloperoxydase au cours de la phagocytose (Niang, 2014).
 L’haptoglobine et l’hémopexine
Elles auraient des propriétés antioxydantes par fixation de l’hémoglobine et de l’hème qui sont porteuses de fer qu’elles peuvent libérer et donc initier des réactions telle que la lipoperoxydation (Guèye, 2010).
 La bilirubine
C’est le produit final du métabolisme de l’hème. La bilirubine peut inhiber efficacement la peroxydation lipidique via un mécanisme qui s’apparenterait à celui de l’alpha-tocophérol.
Elle est capable de piéger les radicaux peroxyles, l’oxygène singulet. Elle protège ainsi l’albumine et les acides gras liés à l’albumine des attaques radicalaires (Diop, 2013).
 L’acide urique
Il inhibe la lipoperoxydation en fixant le fer et le cuivre. C’est également un piégeur du radical peroxyde et de l’acide hypochloreux (Niang, 2013). A des concentrations physiologiques, il présente une activité antioxydante soutenue vis-à-vis des radicaux hydrosolubles.

Antioxydants exogènes

Acide ascorbique (vitamine C)

La vitamine C ou acide ascorbique (figure 10) est une vitamine hydrosoluble, sensible à la chaleur, aux ultraviolets et à l’oxygène. Après ingestion, elle passe rapidement dans le sang puis diffuse de façon variable dans tous les tissus. Un apport quotidien minimal d’origine alimentaire est donc nécessaire, celui-ci provient essentiellement des fruits et légumes frais.
L’acide L-ascorbique est considéré comme le plus important antioxydant dans les fluides extracellulaires. C’est un piégeur très efficace des ions superoxydes O2.-, du peroxyde d’hydrogène H2O2, des radicaux hydroxyles HO•, et de l’oxygène singlet 1O2. La vitamine C protège ainsi les biomembranes et les lipoprotéines (Atti, 2014).

La vitamine E (ou α-tocophérol)

L’α-tocophérol illustrée par la figure 11 est le principal antioxydant contenu dans les LDL. La vitamine E interrompt la chaîne de propagation radicalaire dans les membranes en limitant la peroxydation des acides gras polyinsaturés (Diattara, 2014).
La vitamine E regroupe de nombreux composants, les α, β, γ et δ tocophérols et tocotriénols (Ohrvall et al., 1996).
En protégeant ainsi les cellules contre les dommages associés aux radicaux libres, la vitamine E prolonge la vie cellulaire tout en ralentissant le processus de vieillissement. L’α-tocophérol a été largement étudiée comme complément alimentaire potentiellement préventive dans les maladies cardiovasculaires.
Il joue un rôle dans l’atténuation du stress oxydatif, dans les symptômes des maladies neuro dégénératives, et en particulier dans la maladie d’Alzheimer (Annaházi et al., 2007). La vitamine E joue un rôle important dans l’agrégation de la β- amyloïde (Aβ), d’ailleurs, les données cliniques ont prouvé que les patients d’Alzheimer obtiennent des avantages remarquables au traitement par la vitamine E.

Les Caroténoïdes

Les caroténoïdes sont des pigments fabriqués par les végétaux. Les plus importants sont le bêta-carotène, l’alpha-carotène, la lutéine, la zéaxanthine et le lycopène. Ce sont eux qui donnent aux fruits et légumes des couleurs orange, rouge, jaune…. Leur fonction essentielle est de protéger les plantes. La plupart des caroténoïdes ont une propriété antioxydante (Causse, 2005).
Comme ils le font pour les plantes, ils ont des effets bénéfiques sur notre santé. Ce sont d’excellents piégeurs d’espèces radicalaires particulièrement vis-à-vis de la lipoperoxydation des phospholipides membranaires grâce à leurs structures (Packer et al., 1981).

Les oligoéléments

Le cuivre, le zinc, le manganèse, le sélénium et le fer sont des métaux essentiels dans la défense contre le stress oxydant. Ces oligoéléments jouent le rôle de cofacteur pour maintenir l’activité catalytique des enzymes antioxydantes
Ainsi, la SOD mitochondriale a besoin de manganèse, la SOD cytosolique de cuivre et de zinc, la catalase de fer et la GPx de sélénium.
Le sélénium
Le sélénium est un micronutriment et un oligo-élément. Il a des propriétés anti inflammatoires et anti-oxydantes. Il est indispensable au maintien de l’intégrité des membranes cellulaires. En outre, le sélénium est un constituant de la glutathion peroxydase qui est une puissante enzyme anti-oxydante semblable à la vitamine E. Ceci est à l’origine de son pouvoir protecteur contre le cancer (Bousso, 2010). Une carence en sélénium peut entraîner un stress oxydatif.
Le zinc (Zn)
Le rôle antioxydant du zinc passe par différents mécanismes :
– protection contre la diminution de concentration de la vitamine E,
– stabilisation de la structure membranaire,
– limitation de la production endogène de radicaux libres,
– participation à la structure et à la fonction de l’enzyme extracellulaire à activité
antioxydante qui est la superoxyde dismutase,
-participation au maintien de la concentration tissulaire en métallothionine, molécule potentiellement capable de piéger les radicaux libres.
Le cuivre
Le cuivre est un oligo-élément qui participe au maintien des systèmes de défenses antioxydantes dans l’organisme (Bousso, 2010).

Les polyphénols

Les polyphénols suscitent depuis une dizaine d’année un intérêt croissant de la part des nutritionnistes, des industriels de l’agro-alimentaire et des consommateurs. Une des raisons principales est la reconnaissance de leurs propriétés antioxydantes et ainsi leur implication probable dans la prévention des diverses pathologies associées au stress oxydant. Un très grand nombre de données expérimentales plaide aujourd’hui en faveur de leur implication dans la prévention des maladies dégénératives telles que les cancers, les maladies cardio-vasculaires, l’ostéoporose ou les maladies inflammatoires (Rock, 2003). Les plus représentés sont les anthocyanes, les flavonoïdes et les tanins (Boizot et Charpentier, 2006).

Les antioxydants synthétiques

Dans l’industrie alimentaire, les antioxydants synthétiques tels que le butylhydroxyanisole (BHA), le butylhydroxytoluène (BHT), le gallate propylée (PG) et le tétrabutylhydroquinone (TBHQ) sont largement utilisés parce qu’ils sont efficaces et moins chers que les antioxydants naturels. Cependant, leur sécurité est très discutée, il a été montré que ces antioxydants de synthèse pouvaient être toxiques. En effet, le BHA convertirait certains produits ingérés en substances toxiques ou carcinogènes en augmentant la sécrétion des enzymes microsomales du foie et des organes extra hépatiques (Barlow, 1990). Le BHT présenterait des effets carcinogènes chez le rat (Ito et al., 1985). Pour une utilisation pratique, les antioxydants doivent remplir les conditions suivantes : ils ne doivent pas être toxiques, ils doivent être hautement actifs à de faibles concentrations (0,01-0,02%) (Bauer et al., 2010).

LES DIFFERENTES METHODES D’ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE

Les méthodes d’évaluation du caractère antioxydant peuvent être qualitatives ou quantitatives. Les méthodes qualitatives utilisées pour rechercher l’activité antioxydante de composés font intervenir en général la coloration ou la décoloration (Li et al., 1999). Ce sont principalement des méthodes dites “d’inhibition” dans lesquelles une espèce chimique capable de générer des radicaux libres est utilisée avec une substance capable de détecter ces espèces. L’échantillon dont on souhaite mesurer le pouvoir antioxydant est capable d’inhiber la génération des radicaux.
D’après Blois (1958), il existe différentes méthodes pour déterminer le potentiel antioxydant des produits alimentaires, actifs, ingrédients, etc. Deux types d’analyses que nous avons utilisés dans nos travaux peuvent être retenus : le test au DPPH (2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl) et le test FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power).
Les antioxydants peuvent réduire les radicaux par deux mécanismes : par transfert d’électron ou par transfert d’atome d’hydrogène. La méthode DPPH joue sur le transfert d’un atome d’hydrogène alors que la méthode FRAP joue sur le transfert d’électron singulet.

La méthode au DPPH•

La méthode est basée sur la dégradation du radical DPPH.. Un antioxydant aura la capacité de donner un hydrogène au radical synthétique DPPH.de coloration violette pour le stabiliser en DPPHH de coloration jaune-verte.
La mesure de la décroissance de la coloration violette au bout de 30 minutes permet de déterminer la CI50 (Concentration inhibitrice à 50%), la CE50 (Concentration efficace en antioxydant nécessaire pour faire réduire de 50% la quantité initiale de DPPH). Des comparaisons de CE50 peuvent être réalisées et le résultat est dépendant de la concentration en DPPH initiale.
Principe :
Le radical 2,2-diphényl-1-piccryl-hydrazyl (DPPH.) fut l’un des premiers radicaux utilisés pour étudier la relation structure/activité antioxydante des composés phénoliques (Blois, 1958). La stabilité du radical DPPH. (2,2-diphényl-
1-Picryl-Hydrazyl) résulte de la délocalisation importante de l’électron célibataire sur la totalité de la molécule empêchant ainsi la dimérisation de se produire comme c’est souvent le cas pour les autres radicaux. D’autre part, cette délocalisation est à l’origine de la coloration violette en solution éthanolique ou méthanolique caractérisée par une bande d’absorption dans le visible à 517 nm. L’addition du
radical DPPH. à une solution éthanolique (ou méthanolique) contenant un composé potentiellement antioxydant et pouvant céder un atome d’hydrogène, entraîne une diminution ou une disparition de la coloration violette caractéristique de l’apparition de la forme réduite du DPPH. Cette décoloration peut être suivie par spectrophotométrie en mesurant la diminution de l’absorbance à 517 nm (Wade, 2013).

La méthode FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power)

La méthode est basée sur la réaction de réduction de l’ion ferrique (Fe3+) dans le complexe ferrocyanure de potassium en ion ferreux (Fe2+). La réaction est révélée par le virement de la couleur jaune du fer ferrique en couleur bleu vert du fer ferreux. L’intensité de cette coloration est mesurée par spectrophotométrie à 700 nm (Attou, 2011).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : BIBLIOGRAPHIE
I.PRESENTATION DE Syzygium aromaticum (L.) Merr. et L.M. Perry(Myrtaceae)
I.1. Systématique
I.2.Synonymies
I.3. Différentes appellations
I.4. Répartition géographique
I.5. Description botanique
I.6. La culture du giroflier
I.7. Composition chimique
I.8. propriétés pharmacologiques
I.8.1. Activité antifongique
I.8.2. Activité antivirale
I.8.3. Activité anticancéreuse
I.8.4. Activité antioxydante
I.8.5. Activité hypocholestérolémiante
I.8.6. Activité antibactérienne et anesthésique en dentisterie
I.8.7. Activité acaricide
I.8.8. Stimulant général
I.9. Toxicité des huiles essentielles du giroflier
I.9.1.Toxicité aigüe :
I.9.2.Toxicité chronique :
I.10. Spécialités contenant des clous de girofle
I.11.Domaine d’utilisation
I.11.1.En odontologie
I.11.3. En industrie alimentaire
II. GENERALITES SUR LE STRESS OXYDATIF ET LES ANTIOXYDANTS
II.1. Le stress oxydatif
II.1.1.Définition des radicaux libres
II.1.2. Les sources de radicaux libres
II.1.2.1. Origine endogène
II.1.2.2. Origine exogène
II.1.3. Rôles des radicaux libres
II.1.4. Pathologies impliquant des métabolites réactifs d’oxygène:
II.2. Les antioxydants:
II.2.1. Définition:
II.2.2. Antioxydants endogènes
II.2.2.1. Antioxydants enzymatiques
II.2.2.2. Antioxydants non enzymatiques
II.2.3.Antioxydants exogènes
II.2.3.1. Acide ascorbique (vitamine C)
II.2.3.2. La vitamine E (ou α-tocophérol)
II.2.3.3. Les Caroténoïdes
II.2.3.4. Les oligoéléments
II.2.3.5. Les polyphénols
II.2.4. Les antioxydants synthétiques
III. LES DIFFERENTES METHODES D’ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE
III.1. La méthode au DPPH
III.2. La méthode FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power)
DEUXIEME PARTIE :
I. MATERIEL ET METHODES
I.1 Matériel et réactifs
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2.Matériel de laboratoire et réactifs utilisés
I.2.Méthodes d’études
I.2.1.Obtention des différents extraits
I.2.2.Screening chimique
I.2.2.1. Recherche des hétérosides flavoniques
I.2.2.2. Recherche des Alcaloïdes
I.2.2.3. Recherche des tanins
I.2.2.4.Recherche des Hétérosides Anthracéniques
I.2.2.5. Recherche des saponosides
I.2.2.6. Recherche des Hétérosides Cardiotoniques
I.2.3.ACTIVITE ANTIOXYDANTE
I.2.3.1.Méthode au DPPH
I.2.3.2. Méthode FRAP
I.2.4. Expression des résultats
I.2.4.1. Méthode au DPPH
I.2.4.2. Méthode FRAP
I.2.4.3.Analyses statistiques
II. RESULTATS ET DISCUSSION
II.1 Résultats
II.1.1 Extraction
II.1.2. Screening chimique
II.1.3.Activité antioxydante
II.1.3.1.Méthode au DPPH
II.1.3.1.2. Concentrations inhibitrice à 50% (CI50), Concentration efficace à 50% (CE50) et Pouvoir anti radicalaire (PA)
II.1.3.2. Méthode FRAP
II.2. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES
ANNEXES

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