Généralités sur l’allergie

 Généralités sur l’allergie

Définition

Le terme allergie, des mots grec allos signifiant autre et ergon action, a été défini par Von Piquet en 1906 comme « une altération de la capacité de l’organisme de réagir à une substance étrangère ». L’allergie, ou réaction d’hypersensibilité de type I (immédiate), est une exacerbation de la réponse immunitaire vis-à-vis de substances inoffensives communes que l’on appelle allergènes. Elle intervient chez des individus prédisposés génétiquement à produire ce genre de réponse dans des conditions d’exposition particulières. Ces conditions mettent en jeu l’allergène lui-même, sa structure, sa dose, son mode d’entrée, sa voie d’entrée, sa fréquence d’administration, son moment d’entrée, et l’individu par son statut immunologique au moment de la sensibilisation.

Mécanismes 

Après une première phase de rencontre avec l’allergène, appelée sensibilisation, une réponse immunitaire préférentielle de type Th2 s’engage (Figure 1). La réponse immunitaire Th2 est caractérisée par la production de certaines cytokines polarisant la réponse immune et conduisant, entre autres, à la production d’immunoglobulines d’isotype IgE, spécifiques de l’allergène. Les IgE peuvent ensuite se fixer sur leurs récepteurs de haute affinité (RFcεI) exprimés par différentes cellules spécialisées de la lignée hématopoiétique contenant de nombreux granules intracytoplasmiques. Ces dernières peuvent être des basophiles, cellules circulantes, ou bien des mastocytes, leurs homologues tissulaires. Les allergènes, lors de leurs réintroductions, se fixent sur les IgE spécifiques liées à leur récepteur membranaire. Ceci induit une cascade de signalisation aboutissant à la dégranulation c’est-à-dire la libération des médiateurs immunitaires et de l’inflammation (telle que l’histamine) contenus dans les granules des cellules. Ces médiateurs (amines biogènes et cytokines) ont des effets immédiats, vasodilatateurs et/ou bronchoconstricteurs, et retardés de type inflammatoire (recrutement de cellules sur les lieux de l’inflammation). Ils sont à l’origine des symptômes observés: asthme, rhinoconjonctivite, kératite, prurit, eczéma, ou de son expression la plus aiguë: l’anaphylaxie.

Importance des allergies alimentaires. Cas de l’allergie au lait 

Depuis 20 ans, les allergies alimentaires sont de plus en plus fréquentes et de plus en plus complexes [1, 2]. Bien que leur prévalence soit surestimée par le grand public car elles sont confondues avec des hypersensibilités ne faisant pas intervenir de mécanisme immunologique, elles concernent tout de même environ 5% des enfants et 3% des adultes. Il existe cependant des disparités importantes en fonction des pays, de l’âge et des habitudes de consommation. Les allergènes alimentaires les plus fréquents chez l’enfant et l’adulte sont présentés en Tableau 1. Au-delà de trois ans, l’arachide est le premier allergène. Il est d’autant plus important qu’il est le premier responsable des anaphylaxies sévères déclarées par le réseau d’allergovigilance en France et en Belgique (11,5% en 2007).

Chez l’enfant, le lait de vache est le deuxième aliment responsable d’allergies derrière l’œuf, mais son importance est primordiale car il reste le premier aliment des nourrissons. L’allergie au lait de vache débute souvent avant l’âge de six mois mais disparaît généralement au cours de l’enfance après éviction du lait du régime alimentaire. Les protéines du lait de vache peuvent être séparées en deux fractions par acidification : le lactosérum et le lait caillé ou coagulé. La composition en protéines de ces deux fractions, leurs points isoélectriques et leurs masses moléculaires .

La plupart des protéines du lait font réagir plus de la moitié des patients : ce sont des allergènes dit majeurs. En outre, de nombreux patients sont sensibilisés à plusieurs de ces protéines. Comme nous l’avons vu en introduction générale, la détermination des protéines auxquelles un patient est allergique se fait par test ELISA [3, 4] ou par séparation bidimensionnelle en gel de l’extrait allergénique [5].

Ces techniques sont relativement longues et laborieuses, c’est pourquoi nous nous proposons d’essayer de réaliser la séparation des composants d’un extrait allergénique en microsystème bidimensionnel, en mettant en œuvre deux mécanismes de séparation électrophorétiques : la focalisation isoélectrique et l’électrophorèse de zone en électrolytes peu conducteurs. Notre approche consistant à mettre au point des séparations électrophorétiques au format capillaire avant de les transposer en microsystèmes, nous allons donc tout d’abord nous intéresser aux séparations en électrophorèse capillaire.

Electrophorèse capillaire (EC): généralités 

Phénomènes de migration

Migration électroosmotique
La migration électroosmotique est un phénomène très important en EC. Elle correspond à l’écoulement du liquide contenu dans le capillaire sous l’action d’un champ électrique tangentiel. Cet écoulement est directement lié à la charge de surface du capillaire. Ainsi, ceux en silice vierge classiquement utilisés en EC possèdent une charge de surface négative dès que le pH de l’électrolyte est supérieur à 2 ou 3, car les groupements silanol -SiOH situés à leur surface sont alors ionisés négativement. Pour assurer l’électroneutralité, une partie des cations présents dans l’électrolyte va former une double couche électrique au niveau de la paroi de silice (Figure 2). Plus précisément, une partie des cations compensant les charges fixes du capillaire se place à une distance très faible de la paroi du capillaire et forme une couche appelée couche compacte alors qu’une partie de ces cations se situe à une distance un peu plus grande pour former une couche appelée couche diffuse. Lors de l’application d’un champ électrique aux bornes du capillaire, les cations de la couche compacte ne peuvent migrer et restent immobiles car ils subissent des interactions électrostatiques fortes de la part des groupements silanol de la paroi du capillaire. En revanche, les cations de la couche diffuse, bien qu’attirés par les groupements silanol ionisés, vont migrer vers la cathode et entraîner via des phénomènes de friction l’ensemble des molécules de l’électrolyte. Ceci est le phénomène d’électroosmose, qui consiste en un écoulement général du contenu du capillaire en direction de la cathode, en raison de la charge de surface négative de la silice.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. GENERALITES SUR L’ALLERGIE
1.1.1. Définition
1.1.2. Mécanismes
1.1.3. Importance des allergies alimentaires. Cas de l’allergie au lait
1.2. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE : GENERALITES
1.2.1. Phénomènes de migration
1.2.1.1 Migration électroosmotique
1.2.1.2. Migration électrophorétique
1.2.2. Principaux modes de séparation électrocinétique
1.2.2.1. Electrophorèse de zone (ECZ)
1.2.2.2. Focalisation isoélectrique capillaire (CIEF)
1.2.2.3. Electrophorèse capillaire en gel (ECG)
1.2.2.4. Chromatographie électrocinétique micellaire capillaire (CEMC)
1.2.2.5. Electrochromatographie capillaire (ECC)
1.2.2.6. Isotachophorèse (ITP)
1.2.3. Limitations en électrophorèse capillaire
1.2.3.1. Effet Joule
1.2.3.2. Adsorption des analytes
1.3. FOCALISATION ISOELECTRIQUE CAPILLAIRE (CIEF)
1.3.1. Principe
1.3.1.1. Focalisation
1.3.1.2. Mobilisation
1.3.1.3. Détection
1.3.2. Evaluation des performances d’une séparation en CIEF
1.3.3. Voies de synthèse et structure des ampholytes porteurs
1.3.4 Facteurs influençant la formation du gradient de pH
1.3.4.1. Phénomène de plateau
1.3.4.2. Dérive cathodique
1.3.4.3. Influence de l’écoulement électroosmotique
1.3.4.4. Compression du gradient de pH
1.3.4.5. Modification du gradient de pH
1.3.5. Autres types de gradients de pH
1.4. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE DE ZONE EN SOLUTIONS QUASIISOELECTRIQUES D’AMPHOLYTES (CABCE)
1.4.1 Utilisation de solutions peu conductrices en ECZ
1.4.2. La courbe d’électrotitrage (CET). Fractionnement des ampholytes porteurs.
1.4.3 Electrophorèse de zone en solutions quasi-isoélectriques d’ampholytes (CABCE)
1.5. MICROSYSTEMES POUR LA SEPARATION DE PROTEINES
1.5.1. Matériaux utilisés pour la fabrication de microsystèmes analytiques et traitements de
surface
1.5.2. Dérivation de protéines pour la détection de fluorescence
1.5.3. Séparations monodimensionnelles de protéines
1.5.3.1. Electrophorèse en gel
1.5.3.2. Electrophorèse de zone
1.5.3.3. Focalisation isoélectrique
1.5.4. Séparations bidimensionnelles
1.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 2 : SEPARATION DE PROTEINES PAR FOCALISATION ISOELECTRIQUE CAPILLAIRE ET UTILISATION DE COUPES ETROITES D’AMPHOLYTES PORTEURS POUR AMELIORER LA RESOLUTION
2.1. INTRODUCTION.
2.2. ARTICLE 1: COMPARISON OF DIFFERENT CAPILLARY ISOELECTRIC FOCUSING METHODS –USE OF
“NARROW PH CUTS”OF CARRIER AMPHOLYTES AS ORIGINAL TOOLS TO IMPROVE RESOLUTION
2.3. ARTICLE 2: USE OF QUASI-ISOELECTRIC BUFFERS AS ANOLYTE AND CATHOLYTE TO IMPROVE CIEF
PERFORMANCES
2.4. UTILISATION DE NC COMME ANOLYTE ET CATHOLYTE : EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES
2.4.1. Variation de la nature des NC utilisés comme catholyte
2.4.2. Utilisation d’anolytes et de catholytes de différentes natures en présence d’un capillaire greffé
2.5. CONCLUSION
2.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 3 : SEPARATION DE PROTEINES DU LAIT PAR FOCALISATION ISOELECTRIQUE EN MICROSYSTEMES
3.1. INTRODUCTION ET EXPÉRIENCES PRÉLIMINAIRES
3.2. ARTICLE 3:VERSATILE METHOD FOR EOF MEASUREMENTS IN MICROCHIP CE
3.3. ARTICLE 4: EVALUATION OF MICROCHIP MATERIAL AND SURFACE TREATMENT OPTIONS FOR ISOELECTRIC
FOCUSING OF ALLERGENIC MILK PROTEINS ON MICROCHIPS.
3.4. CONCLUSION
3.5. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 4 : SEPARATION DE PROTEINES PAR ELECTROPHORESE DE ZONE EN SOLUTIONS QUASIISOELECTRIQUES D’AMPHOLYTES, AU FORMAT CAPILLAIRE ET EN MICROSYSTEMES
4.1. INTRODUCTION
4.2. FRACTIONNEMENT DES AMPHOLYTES ET CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES
4.2.1. Fractionnement d’un mélange d’ampholyte de gamme large de pH
4.2.1.1. pH des fractions obtenues
4.2.1.2. Conductivités des fractions obtenues
4.2.1.3. Séparation d’un mélange test de protéines
4.2.2. Fractionnement de mélanges d’ampholytes de gammes de pH étroites
4.2.2.1. pH des fractions obtenues
4.2.2.2. Conductivité des fractions obtenues
4.2.2.3. Mesure des FEO en électrolytes constitués de coupes étroites d’ampholytes
4.3. UTILISATION D’ELECTROLYTES QUASI-ISOELECTRIQUES POUR LA LIMITATION DE L’ADSORPTION DES PROTEINES EN ECZ
4.3.1. Article 5: Use of quasi-isoelectric buffers to limit protein adsorption in CZE
4.3.2. Perspectives
4.4. DERIVATION COVALENTE DE PROTEINES POUR LA DETECTION PAR FLUORESCENCE
4.4.1. Stabilité du FITC
4.4.2. Optimisation des conditions de dérivation
4.4.3. Dérivation d’autres protéines
4.5. SEPARATION EN ELECTROPHORESE DE ZONE EN MICROSYSTEMES
4.5.1. Séparation de composés modèles
4.5.2 Séparation de protéines du lait
4.5.3. Conclusions
4.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CONCLUSION GENERALE

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