Generalites sur la sensibilite

Pour une majorité de bactéries responsables de pathologies infectieuses ou de surinfections, il est hasardeux, voir impossible aujourd’hui, de connaître à priori les antibiotiques auxquels une espèce sera systématiquement sensible. L’utilisation rationnelle des antibiotiques en clinique humaine passe donc par la réalisation in vitro de techniques particulières d’étude de la souche bactérienne incriminée face aux différentes molécules antibiotiques. Cependant le nombre important de paramètres entrant dans la réalisation de ces techniques impose des vérifications périodiques. Pour cela, le bactériologiste dispose de souches de référence délivrées par des organismes spécialisés.

Il existe ainsi plusieurs facteurs qui peuvent affecter les résultats des tests de sensibilité et les méthodes standardisées sont probablement plus reproductibles que les méthodes non standardisées. L’assurance qualité est le processus global par lequel la qualité peut être garantie. Une grande partie de ce processus est constituée par le contrôle interne de la qualité qui, passant par le test des souches de référence, est couramment utilisé pour surveiller la reproductibilité et l’exactitude des tests. Cependant, il existe des aspects supplémentaires qui contribuent à l’assurance qualité, incluant surtout la participation à des systèmes d’évaluation externe de la qualité dans laquelle des résultats discordants peuvent être détectés.

GENERALITES SUR LA SENSIBILITE 

NOTION DE SENSIBILITE 

En bactériologie médicale, les antibiotiques sont des composés chimiques, élaborés par un micro-organisme ou produits par synthèse et dont l’activité spécifique se manifeste à dose faible sur les microorganismes. Ces micro-organismes sont dits sensibles [4, 39, 42]. Une bactérie est dite sensible à un antibiotique si elle fait partie de son spectre d’activité, c’est à dire l’éventail d’espèces bactériennes susceptibles d’être inhibées par des concentrations de cet antibiotique (surtout in vivo après utilisation d’une posologie standard). La sensibilité d’une bactérie est connue après détermination de sa concentration minimale inhibitrice (CMI). Celle-ci est obtenue par la mise en œuvre de certaines techniques classiques [3, 4, 5, 41]. Le corollaire du spectre d’activité est la résistance naturelle des bactéries aux antibiotiques. La résistance naturelle est un caractère d’espèce, elle touche toutes les souches d’une espèce bactérienne donnée. Mais dans la réalité, la situation est beaucoup plus complexe car les bactéries peuvent acquérir une résistance aux antibiotiques par modification de leur capital génétique [4, 41, 43].

METHODES D’ETUDE DE LA SENSIBILITE 

L’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques est toujours d’actualité et une nécessité quotidienne pour tout prescripteur d’antibiotiques, qui est obligé d’y recourir en permanence. Elle comporte en priorité une évaluation de l’effet bactériostatique des antibiotiques par la détermination de la CMI.

Par définition, la CMI est la plus faible concentration d’antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d’une bactérie donnée, appréciable à l’œil nu, après une période d’incubation donnée. L’antibiogramme est la technique classique la plus simple de sa mise en évidence. Plusieurs méthodes concourent à sa réalisation :

– Méthodes de dilution (sur milieu liquide et sur milieu solide),
– Méthode de diffusion ou antibiogramme standard,
– E-test (Epsillometer-test).

Méthodes de dilution 

Sur milieu liquide 

Macrodilution

❖ Principe
La méthode de dilution sur milieu liquide ou macrodilution consiste à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d’antibiotique selon une progression géométrique de raison 2.
❖ Lecture
La lecture se fait au bout du temps d’incubation. La CMI est indiquée par le tube qui contient la plus faible concentration d’antibiotique et où aucune croissance bactérienne n’est visible.

La CMI de la souche de référence est lue en premier lieu pour attester la validité des résultats.

Microdilution

Dans la perspective de mise au point de techniques directement applicables en routine, le laboratoire initie une nouvelle méthode manuelle de l’antibiogramme utilisant les concentrations critiques en microplaque.

❖ Principe
Une bactérie attaquant le glucose est incubée en présence d’une ou de deux concentrations critiques d’un antibiotique donné. Après 18 heures la croissance est décelée et traduite grâce à un indicateur coloré, le rouge de phénol.
❖ Lecture
Le virage ou non de l’indicateur coloré est apprécié. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus par la méthode de E-test qui est la méthode de référence. Cette comparaison permettra de vérifier la validité des résultats obtenus avec la microméthode.

Sur milieu solide

❖ Principe
C’est le même principe que sur milieu liquide : mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d’antibiotique selon une progression géométrique de raison 2 [4, 5, 19, 41]. Cette méthode, utilisant un milieu solide (gélose), offre la possibilité d’étudier simultanément plusieurs types de bactéries par rapport à un antibiotique [12].
❖ Lecture
Après avoir lu la CMI de la souche de référence, celle de la souche à tester est déterminée en partant de la boite contenant la plus faible concentration de l’antibiotique vers la boite contenant la plus grande concentration. La CMI est donnée par l’inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d’antibiotique [41].

Méthode de diffusion ou antibiogramme standard

❖ Principe
Des disques de papier buvard imprégnés d’une quantité définie d’antibiotique sont déposés à la surface d’un milieu gélosé (qui est généralement le milieu Mueller-Hinton) préalablement ensemencé avec une suspension de bactéries en phase exponentielle de croissance.

L’antibiotique diffuse dans toutes les directions et il se forme un gradient de concentration à partir de la source (disque). Après incubation, on constate que chaque disque est entouré d’une zone d’inhibition de la croissance bactérienne dont le diamètre est plus ou moins large .

❖ Lecture
Après incubation, les diamètres d’inhibition autour des disques des souches de référence et des souches à tester sont respectivement mesurés à l’aide d’une règle à coulisse .

E-test (Epsillometer-test)

❖ Principe
Le E-test permet de déterminer la CMI grâce à l’utilisation de bandelettes imprégnées d’un gradient de concentrations exponentiel continu de l’antibiotique à tester. Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5mm de large et de 50mm de long) sont appliquées sur la surface d’un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche à étudier [12, 28, 41].
❖ Lecture
Les boites sont lues à condition d’avoir une ellipse d’inhibition clairement visible. La CMI est lue au point d’intersection de l’ellipse et de la bandelette, celle de la souche de référence est lue en premier lieu .

Table des matières

INTRODUCTION
Première partie : GENERALITES
I/ GENERALITES SUR LA SENSIBILITE
I-1 Notion de sensibilité
I-2 Méthodes ude sensibilité
I-2-1 thod dilution
I-2-1-1 Sur milieu liquide
I-2-1-1-1 Macrodilution
I-2-1-1-2 Microdilution
I-2-1-2 Sur milieu solide
I-2-2 Méthode de diffusion ou Antibiogramme standard
I-2-3 E-test (Epsillometer-test)
I-3 Conditions d’application et limites des techniques d’étude de la sensibilité
I-4 Résultats
I-4-1 Expression des résultats
I-5-2 Interprétation des résultats
I-6 Intérêt de l’étude de la sensibilité
II/ GENERALITES SUR L’ASSURANCE QUALITE
II-1 Historique
II-2 Concept de l’assurance qualité
II-2-1 Définition de la qualité
II-2-2 Concept de l’assurance qualité
II-3 Mise en place du système qualité
II-4 Types d’assurance qualité
II-4-1 Assurance qualité interne
II- 4-2 Assurance qualité externe
Deuxième partie : TRAVAIL PERSONNEL
I/ MATERIEL
I-1 Cadre d’étude
I-2 Matériel
II/ METHODOLOGIE
II-1 Contrôle interne de la qualité de la sensibilité
II-1-1 Organisation du laboratoire
II-1-1-1 Exigences
II-1-1-2 Manuel qualité du laboratoire
II-1-2 Entretien du matériel
II-1-3 Validation des résultats des études de sensibilité : utilisation des souches de référence
II-1-3-1 Définition des souches de référence
II-1-3-2 Obtention
II-1-3-3 Conservation
II-1-3-4 Régénération
II-1-3-5 Utilisation
II-1-4 Contrôle de la qualité des milieux de culture
II-1-4-1 Préparation
II-1-4-2 Contrôle de la qualité
II-1-4-2-1 Contrôle de la profondeur
II-1-4-2-2 Contrôle du pH
II-1-4-2-3 Contrôle de la stérilité
II-1-4-2-4 Contrôle de l’efficacité
II-1-4-3 Conservation des milieux préparés
II-1-5 Contrôle de la qualité de l’inoculum
II-1-6 Autres contrôles
II-1-7 Documentation
II-1-8 Audit
II-2 Contrôle externe de la qualité de la sensibilité
II-2-1 Souches testées
II-2-2 Profil de sensibilité aux antibiotiques
II-2-3 Recherche de béta-lactamase
II-2-4 Références utilisées pour les valeurs critiques
III/ RESULTATS
III-1 Contrôle interne de la qualité de la sensibilité
III-1-1 Résultats des contrôles effectués
III-1-2 Figures résultant des contrôles de qualité
III-2 Contrôle externe de la qualité de la sensibilité
III-2-1 Souches testées
III-2-2 Profil de sensibilité aux antibiotiques
III-2-3 Recherche de béta-lactamase
IV/ DISCUSSION
IV-1 Contrôle interne de la qualité de la sensibilité
IV-1-1 E-test
IV-1-2 Les souches de référence
IV-2 Contrôle externe
IV-2-1 Méthodes utilisées
IV-2-2 Profil de sensibilité aux antibiotiques
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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