Generalites sur la cysticercose porcine

La cysticercose porcine couramment appelée « Ladrerie » est l’infestation du porc par Cysticercuscellulosae, la forme larvaire deTaenia solium, un des agents du Téniasis humain. L’Homme constitue le seul hôte définitif du ver tandis que le porc est l’hôte intermédiaire. Le porc s’infecte en ingérant des œufs de Taenia solium à partir d’excrément humain et développe la cysticercose porcine qui est en général asymptomatique. L’homme peut également développer accidentellement la cysticercose suite à l’ingestion d’œufs du ver. Cependant, à l’opposé de chez le porc, l’expression clinique de la cysticercose humaine dépend généralement de la localisation des kystes de cysticerques au sein de l’organisme [1, 2]. Ainsi, les crises convulsives et les épilepsies sont les signes cliniques dominants de la Neurocysticercose, la forme la plus grave chez l’Homme [1- 4].

La cysticercose porcine est une maladie cosmopolite quoiqu’elle soit retrouvée davantage dans les pays en développement où l’endémicité de la maladie s’explique par la promiscuité entre l’Homme et le porc associée à de mauvaises conditions d’élevage et d’hygiène [4, 5]. Elle se rencontre en Afrique dans des pays où la prévalence se situe entre 11 à 21% comme au Cameroun ou au Tchad avoisinant les 39,8% [6 – 8] et 25% au Tanzanie [9].Le Pérou a la plus forte prévalence pour la région de l’Amérique latine, celle-ci se situe entre 15 à 75% [10]. La cysticercose porcine touche également plusieurs pays d’Asie comme la Chine ou l’Inde [11, 12]. A Madagascar, la prévalence est variable de 0,06 % à 8,87% selon la région. Par ailleurs, la perte financière liée à cette maladie est estimée aux environs de 36 milliards d’Ariary en 2012[13]. Ce qui la situe actuellement à la première place des maladies porcines en termes de perte financière. Cette perte est surtout induite par le prix réduit offert pour lesviandes et les abats infestés mais également par la prise en charge de la maladie [14, 15].

Actuellement, le diagnostic de la cysticercose porcine repose sur l’inspection post-mortem de la viande lors de l’abattage du porc. In vivo, le langueyage ou palpation de la langue à la recherche de cysticerques est utilisé surtout lors d’enquête épidémiologique au niveau des élevages. Cependant, la limite de ces deux pratiques concerne le fait que les animaux faiblement infestés passent souvent inaperçus. La DSV estime que seulement le tiers des animaux infestés sont détectés à travers ces deux méthodes [13]. Les diagnostics en laboratoires sont alors requis pour confirmer les cas de cysticercose [16]. Trois techniques sont les plus utilisés à savoir l’Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) pour la détection d’anticorps et l’ELISA pour la détection d’antigènes qui sont des méthodes quantitativeset l’Enzyme ImmunoTransferBlot (EITB) ou Western Blot [17-19]qui est un test qualitatif. Les méthodes pour la détection d’anticorps utilisent des antigènes extraits directement soit du liquide vésiculaire soit des extraits bruts de la membrane de cysticerques [20, 21]. De ce fait, elles sont des techniques laborieuses et couteuses pour les éleveurs particulièrement ceux des pays en développement. Par ailleurs, la sensibilité et la spécificité de ces outils diminuent en cas de faible infestation avec une sensibilité de seulement 55,5% pour l’ELISA et de 64,7% pour l’EITB [22] surtout lors de l’utilisation d’antigènes bruts [17, 20]. Ces problèmes de diagnostics supposent donc que les données actuelles ne reflètent pas la prévalence réelle de la cysticercose.

GENERALITES SUR LA CYSTICERCOSE PORCINE

DÉFINITION

La cysticercose porcine ou ladrerie est une cestodose larvaire due àCysticercus cellulosea, la larve de Taenia solium ou le ver solitaire de l’homme. Ce dernier étant la forme adulte provoquantla Taeniase humaine. En malgache, la maladie porte communément le nom de « voavary » qui signifie littéralement grain de riz.

CLASSIFICATION- CYCLE EVOLUTIFMORPHOLOGIE DU VER

T. solium est un cestode qui fait partie de l’embranchement des Plathelminthes et appartenant à la classe des Cestoïdea regroupant des parasites dépourvues de tube digestif et à corps segmenté. Il appartient à la sous-classe des Eucestoda à cause de leurs organes de fixation appelés « scolex ». Il fait partie des espèces des Cyclophylidea, et de la famille des Taeniidae. Les Cyclophidae sont caractérisées par un scolex à quatre ventouses sphériques et des orifices génitaux latéraux tandis que les Taeniidae sont caractérisées par des parasites dont les crochets ont trois éléments constitutifs : le manche, la lame et la garde.

Le ver adulte peut mesurer jusqu’à 1 à 3m . Il vit dans l’intestin grêle sur lequel il s’attache grâce à son scolex tandis que les larves se localisent préférentiellement au niveau des muscles. Ces larves appelés également cysticerques ou métacestodes, au début de leur évolution, se présentent sous forme de très petits kystes, d’environ 1mm de diamètre. A l’état complet de son développement, elle est vésiculeuse et opalescente mesurant 6 à 18 mm de long. La vésicule est remplie d’un liquide clair, apparenté à l’«eau de roche» au sein duquel se trouve invaginé un protoscolex [23]. Ce dernier est muni d’un rostre, une petite saillie rétractile, et de crochets comme les vers adultes.

L’homme représente le seul hôte définitif hébergeant le ver adulte : Taenia solium. Il développe ainsi le teniasis humain dont la contamination s’effectue suite à l’ingestion de viande de porc insuffisamment cuite. Cependant, l’homme peut également développer la cysticercose en ingérant de façon accidentelle des œufs de T. solium contenus soit dans ses propres matières fécales, il s’agit donc d’une autocontamination soit dans la nourriture ou dans l’eau contaminées. Dans l’organisme hôte, le ver atteint sa maturité au bout de trois mois. Des proglottis gravides contenant jusqu’à 60000 œufs , se détachent de la partie distale du ver et sont excrétés dans les fèces. Ces anneaux peuvent s’ouvrir soit dans le milieu extérieur soit dans l’intestin de l’homme libérant des œufs qui vont se mélanger avec les excrétas contaminant ainsi l’environnement.

Le porc constitue l’hôte intermédiaire des cysticerques (Figure 3). Etant un animal coprophage par excellence, il s’infeste en ingérant des œufs contenus dans des selles contaminées. Les œufs subissent l’action d’enzymes digestives et évoluent en embryons. Ces embryons vont traverser la paroi gastrique et migrent vers les muscles les plus actifs de l’organisme dont ceux de l’échine, du jambon, de la langue, les muscles cardiaques voire même au niveau du système nerveux central de l’animal. Toutefois, seuls les embryons parvenus dans les muscles striés restent viables, s’accroissent et donnes des larves infestantes (C. cellulosae). Le cysticerque se forme en trois à cinq mois et reste infestant pendant environ un an sans traitement.

EPIDEMIOLOGIE DE LA CYSTICERCOSE PORCINE 

La cysticercose porcine est unezoonose cosmopolite et endémique de nombreux pays . Elle affecte particulièrement les régions rurales d’élevage intensif de porc où les conditions d’hygiène sont défectueuses et les installations sanitaires rares. La promiscuité homme animal y est également importante.

Selon l’OMS, les foyers endémiquesde la maladie (colorés en rouge sur la carte) sont l’Amérique centrale (Mexique, Guatemala, Honduras) et du Sud (Bolivie, Pérou, Brésil) où les prévalences varient de 10% à 75% [9]. Des pays de l’Asie dont la Chine et l’Inde ainsi que la région du sud-est asiatique (Indonésie, Inde, Vietnam, Cambodge, Laos, Corée, Chine, Népal, Mongolie, Philippines, Myanmar) sont également considérés endémiques de la cysticercose porcine [10,11]. Madagascar fait partie des pays d’endémicité pour le continent africain entre autres pays (Sénégal, Bénin, Côte d’Ivoire, Togo, Ghana, Burkina-Faso, Nigéria, RD du Congo, Cameroun, Burundi, Kenya, Rwanda, Tanzanie, Ouganda, Mozambique, Zimbabwe, Afrique du sud).Dans ces régions, l’élevage porcin est l’exploitation de choix du fait qu’il nécessite peu d’investissement particulièrement pour l’alimentation [25-28]. Les animaux sont alors laissés en divagation où ils se nourrissent de pâturages et d’ordures favorisant la continuité du cycle de T. solium. Par ailleurs, l’absence de toilettes et de structures sanitaires adéquates semblent être commune à ces régions entrainant la présence de déjections humaines en quantité non négligeable dans l’environnement [29, 30]. Par contre, en raison de conditions socio-économiques plus favorables et d’infrastructures adéquates ainsi que de conditions d’hygiènes plus rigoureuses, la cysticercose a pu être éradiquée en Europe excepté dans les pays de la péninsule ibérique (Espagne et Portugal) et de certains pays de l’Europe de l’Est, dans la région nord-américaine, en Australie, au Japon et en Nouvelle-Zélande. De part des pratiques religieuses ne permettant pas l’élevage porcin et la consommation de viandes de porc, la cysticercose est rarement retrouvée en Israël, dans les pays du Maghreb et au MoyenOrient. Concernant la Téniase, à l’heure actuelle, environ 2,5 millions de personnes sont porteurs du ver adulte T solium [30].

MOYENS DE DIAGNOSTIC 

La détection de la cysticercose porcine peut se faire par des tests visuels qui se reposent sur l’identification de l’agent pathogène à travers la palpation de la langue ou lors de l’inspection post-mortem des viandes. Les tests immunologiques constituent également un diagnostic de certitude de la cysticercose porcine.

IDENTIFICATION DE L’AGENT PATHOGENE 

Cette technique vise à rechercher puis à identifier les cysticerques. L’examen de la langue appelé encore le langueyage est un moyen facile et rapide pour identifier les porcs malades. Il est praticable même au niveau des élevages par les éleveurs. Elle consiste à palper et à explorer la face ventrale de la langue de l’animal. Les cysticerques sont palpables dès la 2ème semaine après l’infestation puis visibles à l’œil nu à partir de la 6ème semaine sous une forme ovale. Des études menées par Dorny en 2004 ont montré une sensibilité et une spécificité du langueyage respectivement de 16,1% et 100% .

Bien que sa spécificité soit très élevée, cette technique ne permet qu’une détection des animaux massivement infectés et son efficacité dépend de l’expérience de l’explorateur.

En outre, des lésions mécaniques ou provoquées par des actinobactéries peuvent donner de faux positifs [32,33]. D’où la nécessité de procéder à l’inspection des viandes en abattoirs ou dans les tueries. La procédure d’inspection consiste à contrôler visuellement la carcasse du porc. La technique officielle consiste à palper puis à inciser les muscles notamment l’échine, le jambon et les aisselles, qui constituent la localisation préférentielle des cysticerques ainsi que les organes de prédilection des métacestodes comme le cœur et la langue. Les kystes sont visibles à la surface d’incision. Cependant, malgré une spécificité de 100%, la sensibilité reste faible à 38,7%[31]. Ce qui fait que les animaux faiblement infestés peuvent passé inaperçues.

Table des matières

INTRODUCTION
I PREMIERE PARTIE : GENERALITES ET RAPPELS THEORIQUES
I.1 GENERALITES SUR LA CYSTICERCOSE PORCINE
I.1.1 DÉFINITION
I.1.2 CLASSIFICATION- CYCLE EVOLUTIF- MORPHOLOGIE DU VER
I.1.3 EPIDEMIOLOGIE DE LA CYSTICERCOSE PORCINE
I.1.4 MOYENS DE DIAGNOSTIC
I.1.4.1 IDENTIFICATION DE L’AGENT PATHOGENE
I.1.4.2 LES TESTS SEROLOGIQUES
I.1.5 TRAITEMENT – PREVENTION DE LA CYSTICERCOSE PORCINE
I.2 CLONAGES DE PROTÉINES ET PROTÉINES RECOMBINANTES
II DEUXIEME PARTIE : METHODES ET RESULTATS
II.1 METHODES
II.1.1 CADRE DE L’ETUDE
II.1.2 RESUME DE LA DEMARCHE EXPERIMENTALE
II.1.3 MATERIELS BIOLOGIQUES
II.1.3.1 SERUMS DE PORCS
II.1.3.2 ANTIGENES MEMBRANAIRES BRUTS :CS50
II.1.3.3 LES GENES UTILISES : ADNc
II.1.3.4 LES VECTEURS DE CLONAGE ET D’EXPRESSION
II.1.3.5 LES CELLULES HÔTES
II.1.4 MESURES DE SECURITE AU LABORATOIRE
II.1.5 UTILISATION DE LA CS50
II.1.5.1 TEST ELISA
II.1.5.2 DETERMINATION DES BANDES SPECIFIQUES PAR LE TEST ENZYME – LINKED IMMUNOELECTRO-TRANSFERT BLOT (EITB)
II.1.6 CLONAGE DE GENES D’INTERET DE CYSTICERQUES
II.1.6.1 AMPLIFICATION DES GÈNES
II.1.6.2 DIGESTION DU PLASMIDE PET-MBP ET DES GÈNES AMPLIFIÉS
II.1.6.3 LIGATION
II.1.6.4 PRÉPARATION DE BACTÉRIES CHIMIO COMPÉTENTES
II.1.6.5 TRANSFORMATION DES BACTÉRIES TOP10
II.1.6.6 VÉRIFICATION DE LA TRANSFORMATION DES BACTÉRIES PAR PCR SUR COLONIES
II.1.7 PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES
II.1.7.1 PREPARATION ET TRANSFORMATION DES SOUCHES D’EXPRESSION
II.1.7.2 PRE- CULTURE
II.1.7.3 EXTRACTION DES PROTÉINES TOTALES
II.1.7.4 TRAITEMENT DE LA FRACTION PROTÉIQUE INSOLUBLE
II.1.7.5 ANALYSE DES FRACTIONS SOLUBLES ET INSOLUBLES SUR SDS-PAGE
II.1.8 PURIFICATION DES PROTEINES RECOMBINANTES
II.1.8.1 PRINCIPE
II.1.8.2 PREPARATION
II.1.8.3 FIXATION PROTÉIQUE SUR LA RÉSINE
II.1.8.4 LAVAGE DE LA RÉSINE – PROTÉINE
II.1.8.5 ELUTION PROTEIQUE
II.2 RESULTATS
II.2.1 RESULTAT DE L’UTILISATION DE LA CS50
II.2.2 RESULTAT DU CLONAGE ET DE LA PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES
II.2.2.1 RESULTAT DE L’AMPLIFICATION AVEC LESAMORCES SPECIFIQUES
II.2.2.2 VERIFICATION PAR PCR SUR COLONIES DE LA TRANSFORMATION BACTERIENNE
II.2.2.3 RESULTATS DES ANALYSES DE SEQUENCES DES CLONES CHOISIS
II.2.2.4 RESULTATS DES ANALYSES SUR SDS_PAGE ET SUR WESTERN BLOT DES PROTEINES RECOMBINANTES
III TROISIEME PARTIE : DISCUSSION
III.1ANALYSE DES RESULTATS OBTENUS PAR RAPPORT A LA MISE AU POINT DU TDR DE LA CYSTICERCOSE PORCINE
III.2 ANALYSE DES PERSPECTIVES PAR RAPPORT AUX RESULTATS OBTENUS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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