Généralités et caractéristiques biologiques des levures

Milieux et conditions de culture

Milieux de culture

Les milieux qui ont été utilisés pour réaliser les différentes études sur ces souches de levures sont les suivants :
 Le milieu complet YP (1% Yeast Extract, (BIOKAR), 1% Bactopeptone, (DIFCO)) auquel sera ajouté le sucre à une concentration de 2% (glucose (YPD), fructose (YPF), saccharose (YPS), lactose (YPL)) et de l’agar à une concentration de 2% si le milieu est utilisé à l’état solide.
 Le milieu synthétique minimum YN (0,17% de Yeast Nitrogen base sans acides aminés et sans sulfate d’ammonium (DIFCO), 0,5% de sulfate d’ammonium) tamponné à un pH 5 avec un mélange acide succinique (1,35%)/soude (0,65%). Le sucre utilisé est ajouté à une concentration de 2% (glucose (YNB), xylose (YNX)). Dans le cas où ce milieu est utilisé à l’état solide de l’agar à 2% est alors ajouté.
Ces deux milieux sont directement autoclavés à 120°C pendant 20 minutes.
 Un milieu minéral synthétique, MMS (Verduyn et al., 1992), dans lequel l’apport de tous les éléments nutritifs peut être contrôlé. Ce dernier est composé de quatre solutions qui sont préparées séparément et stérilisées différemment :
– solution 1 : 5g (sulfate d’ammonium), 3g (KH2PO4) et 0,5g (MgSO4) dans 900ml d’eau distillée. – solution 2 : 20g (Source de carbone) dans 100ml d’eau distillée. – solution 3 : on mélange 1,5g (EDTA di-sodium) à 0,45g (ZnSO4, 7H2O) dans 75ml d’eau distillée où le pH est ajusté à 6 avec du NaOH 1M. Cet ajustement doit être fait après l’ajout de chacun des éléments suivants : 0,1g (MnCl2, 4H2O), 0,03g (CoCl2, 6H2O), 0,03g (CuSO4, 5H2O), 0,4g (Molybdène di-spodique (Na2MoO4, 2H2O)), 0,45g (CaCl2, 2H2O), 0,3g (FeSO4, 7H2O) et 0,1g (Acide borique(H3BO3)). Le volume est ensuite complété avec de l’eau distillée. – solution 4 : on dissout 10mg de d-Biotine dans 5ml de NaOH 0,1M, puis le volume est complété avec de l’eau distillée à 75ml et on ajuste le pH à 6,5 avec HCl 1M. Ce pH doit être maintenu après l’ajout de chacun des constituants suivants afin de faciliter leur dissolution : 100mg de Ca (D+) pantothénate, 100mg d’acide nicotinique, 250mg (My-Inositol), 100mg (Thiamine HCl), 100mg (Pyridoxal HCl) et 20mg (Acide paminobenzoïque).

La solution 1 est autoclavée à 120°C pendant 20 minutes, la solution 2 est autoclavée à 110°C pendant 30 minutes et les solutions 3 et 4 sont filtrées (0,2μm) et conservées à 4°C à l’abri de la lumière. Le milieu MMS est alors préparé en mélangeant les solutions 1 et 2 à 1 ml de chacune des solutions 3 et 4.

Conditions de culture

Pré cultures

Les pré-cultures utilisées au cours de ce travail sont réalisées dans le milieu désigné pour l’expérience (YPD, YNB ou MMS) en tube (3ml) ou en Erlenmeyer si la pré-culture est destinée à l’ensemencement d’un fermenteur. Cette pré-culture doit être fraîche et réalisée à partir de colonies isolées (conservées sur gélose) et est incubée à une température de 30°C sous agitation (100 rpm).

Cultures

Cultures sur milieu solide

Afin d’évaluer les exigences nutritionnelles de ces souches, deux milieux ont été utilisés. Un milieu complet (YPD) et un milieu minimum (YNB). La lecture des résultats se fait pendant trois jours à une incubation de 30°C pour noter d’éventuels changements.

Cultures en fioles Erlenmeyer

Les cultures réalisées dans ce travail ont été faites dans des fioles Erlenmeyer non bafflées remplies au 1/10 afin de réduire le problème de transfert d’oxygène. Leur incubation se fait à 30°C avec une agitation d’environ 200 rpm sur table agitante. Deux milieux ont été utilisés (YPD et MMS) afin de suivre la croissance des souches sélectionnées. Des prélèvements sont réalisés à différentes phases de croissance et des dosages effectués par HPLC afin de comparer la production de trois métabolites (éthanol, glycérol et acétate) ainsi que la consommation du sucre pour suivre la dynamique physiologique de ces cultures.

Culture en fermenteur

La souche utilisée au cours de cette fermentation est Issatchenkia orientalis, isolée à partir du lait de chamelle. La pré-culture est réalisée dans 50ml de YNB (2% de Glucose:) et incubée à 30°C pendant 12h sous agitation (100 rpm). Cette pré-culture (taux d’ensemencement de 10% (V/V)) a servi à ensemencer 1L de milieu YNB contenu dans un bioréacteur de 2L. L’ensemble est stérilisé à l’autoclave (120°C, 20mn) sous une pression relative de 1 bar.

Cette fermentation en mode batch a été réalisée dans un fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus (figure 7). Le pH est ajusté à 3 à l’aide d’une solution d’ammoniaque à 14% (V/V). La température de la fermentation est maintenue à 30°C grâce à un baffle chauffant et un système de refroidissement (en double cloison). Le bioréacteur a été balayé en permanence par de l’air à un débit de 0,1L/mn. La vitesse d’agitation est fixée à 400 rpm jusqu’à ce que pO2 atteigne 20%, puis augmentée pour éviter toute limitation d’oxygène dans le milieu. Ces systèmes sont connectés à un ordinateur et un programme informatique qui réalise en ligne l’acquisition des paramètres contrôlés (taux d’agitation, pH, température, débit d’air et pression partielle de l’oxygène dissous) (figure 8). Cette culture est suivie et des prélèvements, à travers un septum prévu à cet effet situé au centre du bioréacteur, sont effectués toutes les heures pour des dosages hors ligne (glucose, éthanol, glycérol et acétates).

Analyse phénotypique

Etude des caractères culturaux

L’étude des caractères culturaux des cinq souches retenues (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) (cf. 1er paragraphe-Résultats et discussion) nous a conduits à examiner l’aspect des cultures en milieu liquide et sur milieu solide après incubation à 30°C.

Caractères culturaux en milieu liquide

L’ensemencement des souches précédemment identifiées est réalisé sur milieu YPD liquide réparti dans des tubes à essai avec des cloches de Durham. L’aspect de la culture de chaque souche est soigneusement noté, on observe:
 la présence de dépôt au fond du tube ainsi que son aspect (fin, modéré ou épais).
 la présence de voile ou de pellicule en surface.
 la production de gaz.

Caractères culturaux sur milieu solide

La culture de ces souches sur YPD gélosé (même période et même température d’incubation) nous a permis de définir la forme, la couleur et l’aspect des colonies.

Etude des caractères morphologiques

Cette étude a pour but l’examen microscopique de la forme des cellules, des différentes organisations qui peuvent exister chez les levures et de «spores» asexuées ainsi que le mode de reproduction végétative. Elle est réalisée sur des cultures fraîches en YPD liquide incubées sous agitation à l’état frais, lutées à la paraffine (Bourgeois et al., 1996). Par contre l’organisation des cellules de levure et les «spores» asexuées sont recherchées par observation sur un fragment de colonie prélevé sur YPD solide.

Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues

Les expositions aux différents stress sont réalisées sur des cellules en pleine phase exponentielle de croissance avec deux répétitions et ceci afin d’évaluer les performances de nos souches.

Effet de la température

Afin de mettre en évidence l’effet du stress thermique sur ces souches, ces dernières sont ensemencées sur YPD solide puis placées dans des étuves à quatre températures différentes (25°C, 30°C, 37°C et 40°C) excepté pour la souche Issatchenkia orientalis (très résistante) dont la culture a été poursuivie jusqu’à 42°C. Leur croissance est suivie quotidiennement, pendant trois jours.

Effet du stress salin et osmotique

Les stress salin et osmotique sont provoqués par ajout d’une solution concentrée de l’agent salin (NaCl à 0.5M) ou osmotique (sorbitol 2M) dans le milieu de culture (YNB). Ces concentrations ont été mises au point par LISBP/INSA Toulouse.

Après l’ensemencement des cinq souches, une incubation a été faite à 30°C. A chacun de ces stress on en a ajouté un autre qui est le stress thermique en réalisant une autre incubation à 40°C. Ainsi l’effet combiné des deux stress peut être déterminé (salin-thermique et osmotique- thermique).

Effet du pH

Le milieu YPD solide a été préparé à quatre pH différents, trois acides (pH 2,5 ; 4 et 5) ajustés avec du HCl 1M et un basique (pH 7) ajusté avec du NaOH 0,1M. L’agar (2%) est ajouté aux deux milieux à pH 5 et 7 avant autoclavage alors que pour les milieux à pH 2,5 et 4 il est rajouté après autoclavage (agar 4% à diluer deux fois) afin d’éviter son hydrolyse. Pour chaque souche, une pré-culture a été préparée, centrifugée à 13 000 tr/mn pendant 3mn et lavée avec de l’eau distillée stérile. Après un bref passage au vortex et centrifugation, les cellules sont remises en suspension avec 100μl d’eau distillée stérile. Des dilutions séquentielles (10-1, 10-2, 10-3 et 10-4) ont été préparées et 10μl de chaque dilution sont déposés stérilement sur les boites précédemment préparées. Après séchage, elles sont incubées à 30°C et à 40°C. Les résultats sont ainsi suivis et notés quotidiennement pendant trois jours.

Effet de l’éthanol et du phényléthanol

Ces deux stress ont été étudiés sur les milieux YPD et YNB solides. L’éthanol est ajouté aux concentrations suivantes: 0%, 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, et 22% (V/V) et le phényléthanol à 0 ; 1 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 et 5 g/L. Les boites de Petri (fermées rapidement afin d’éviter toute évaporation) sont ensemencées de la même manière que précédemment (cf. paragraphe 5.3.3). L’incubation se fait à deux températures différentes (30°C et 40°C), car en dehors de la toxicité de l’éthanol s’ajoute le facteur de la température élevée qui pose un problème au cours de la fermentation. Les résultats sont ainsi suivis et notés quotidiennement pendant trois jours. La souche I. orientalis, montrant une résistance importante, a été sélectionnée afin de suivre sa croissance en milieu YPD et YNB liquides en présence d’éthanol aux concentrations suivantes: 0%, 5%, 8%, 12% et 20% (V/V d’éthanol). L’ensemencement est réalisé à 2UDO et l’incubation à 30°C sous agitation (200 rpm). La croissance cellulaire est ainsi suivie à intervalle de temps régulier par la mesure de la densité optique (600 nm, cf. paragraphe 6.1.1) et la viabilité cellulaire est déterminée par étalement sur milieu solide et par un comptage après coloration au bleu de méthylène (cf. paragraphe 6.1.3). La première technique est utilisée pour vérifier la fiabilité du comptage. C’est cette dernière qui sera représentée.

Méthodes analytiques

Détermination de la biomasse

Mesure de la densité optique (DO)

L’évolution de la densité optique est estimée par spectrophotométrie à 600nm (Spectrophotomètre Biochrom Libra S11) dans une cuve de 1mm de trajet optique. Afin de favoriser le détachement des cellules et leur propagation dans le milieu, un bref passage au sonificateur a été réalisé avec certaines souches qui préfèrent rester associées les aunes aux autres. La zone de linéarité du spectrophotomètre se situant entre 0,1 et 0,3 unités d’absorbance, des dilutions seront réalisées afin d’obtenir une densité optique située dans cet intervalle.

Détermination de la matière sèche

La détermination de la biomasse sèche (g/L) par une méthode gravimétrique a été réalisée de la manière suivante : un volume connu de culture est filtré à l’aide d’une pompe à vide sur des membranes (Sartolon polyamide 0,45 μm SARTORIUS®) préalablement séchées et pesées, puis rincées à l’eau distillée. Ces dernières sont ensuite séchées à l’étuve à 60°C sous vide (200mm de Hg) pendant 48h puis pesées. La différence de masse des membranes avant et après filtration de la suspension cellulaire permet de déterminer la masse sèche (g/L). De plus le suivi de la croissance a permis d’établir une corrélation entre ces deux paramètres (DO et matière sèche) afin d’homogénéiser la présentation des résultats.

Détermination de la viabilité cellulaire et du nombre de cellules

Mesure de la viabilité au bleu de méthylène

Le principe de cette première technique repose sur la propriété que possède le bleu de méthylène à pénétrer par diffusion dans toutes les cellules. La solution sera préparée comme suit : 10mg de bleu de méthylène sont dilués dans 10ml d’eau distillée auxquels sont ajoutés 2g de tricitrate de sodium dihydraté. L’ensemble est filtré sur une membrane Minisart 0,2μm (SARTORIUS®) puis on complète 100ml avec de l’eau distillée stérile.

Table des matières

RESUME
SUMMARY
RESUME EN ARABE 
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : Généralités et caractéristiques biologiques des levures
1-Morphologie
1.1-La forme levure
1.2- La forme pseudomycélium
1.3- La forme mycélium
2- Structure cellulaire de la forme levure
2.1- La paroi
2.2- L’espace périplasmique
2.3- La membrane plasmique
2.4- Le cytoplasme
2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique
3- Les exigences nutritionnelles
4- Métabolisme
4.1- Métabolisme oxydatif
4.2- Métabolisme fermentaire
4.3- Métabolisme oxydo-réductif
4.4- Métabolisme des monosaccharides
4.5- Métabolisme des di- et tri-saccharides
4.6- Métabolisme des pentoses
4.7- Métabolisme des polysaccharides
4.8- Le transport des sucres
4.9- Le transport des ions ammonium
4.10- Le transport des acides aminés
4.11-Le transport des peptides et des polypeptides
5-Facteurs influençant le comportement des levures
5.1- Effet de la température
5.2- Effet du pH
5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau
5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone
5.5- Effet de la concentration d’éthanol
5.6- Effet de l’acide acétique
Chapitre II : Utilisation industrielle des levures
A/ Production microbienne de l’éthanol
1-Intérêts de cette production
2-Procédés utilisés au cours de la fermentation
2.1-Fermentation type batch
2.2- Fermentation type fed-batch
2.3- Fermentation type continu
3-Les substrats utilisés au cours de cette production
4-Les microorganismes utilisés au cours de cette production
5-Inhibition et tolérance à l’éthanol
B/ Production microbienne des arômes
1-Définition
2- Les différents types d’arômes
2.1- Les arômes naturels
2.2- Les arômes de synthèse
2.3- Les arômes de transformation
2.4- Les arômes de fumée
3-Utilisation des arômes
4- Les arômes issus des biotechnologies
4.1- Les modes de production
4.2- Les microorganismes utilisés
4.3- Les composés volatils formés par les microorganismes
4.4- Le 2-phényléthanol (2PE)
5-Problématiques de production microbienne des arômes
MATERIEL ET METHODES 
1-Matériel biologique
2-Méthodes d’isolement des levures
2.1- Isolement à partir des échantillons solides
2.2- Isolement à partir du lait
2.3-Isolement à partir du miel
3- Méthodes d’identification des souches de levures
3.1-Méthode conventionnelle
3.2- PCR sur histones
3.3- Identification moléculaire au CIRM
4- Milieux et conditions de culture
4.1- Milieux de culture
4.2- Conditions de culture
5- Analyse phénotypique
5.1- Etude des caractères culturaux
5.2- Etude des caractères morphologiques
5.3- Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues
6- Méthodes analytiques
6.1- Détermination de la biomasse
6.2- Extraction d’alcools supérieurs et de leurs acétates
6.3- Analyse chromatographique par HPLC pour le dosage des différents sucres, éthanol, glycérol et acétate
6.4- Analyse chromatographique par GC-FID pour le dosage des alcools supérieurs et leurs acétates
7- Analyse physiologique
7.1- Culture en anaérobiose
7.2- Assimilation des substrats carbonés
RESULTATS ET DISCUSSION 
1- Identification des isolats de levure
1.1- PCR sur histones
1.2- Identification moléculaire
2- Caractères culturaux et morphologiques
2.1- Caractères culturaux
2.2- Caractères morphologiques
3-Effet des différents stress
3.1- Effet de la température
3.2- Effet du pH
3.3- Effet du stress salin
3.4- Effet du stress osmotique
3.5- Effet de l’éthanol
4- Analyse de la physiologie des cinq souches de levures retenues
4.1- Assimilation des substrats carbonés (Galerie API ID 32C)
4.2- Cinétiques et productions en aérobiose
4.3- Cinétiques et productions de la souche Issatchenkia orientalis et CEN.PK122-2N
sur YPD et MMS en anaérobiose
4.4- Cinétiques et productions sur différents substrats glucidiques
4.4.1- Culture et productions des cinq souches sur xylose
5- Profil aromatique des cinq souches de levures retenues
5.1- Le profil d’accumulation des alcools supérieurs et de leurs acétates
5.2- Tolérance au 2-phényléthanol
6- Intérêt et dynamique physiologique de la souche Issatchenkia orientalis.
6.1- Analyse de la viabilité cellulaire
6.2- Aspect macrocinétique de la fermentation alcoolique type batch
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES  REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES

Télécharger le rapport complet