Généralité sur le secteur des fruits à coque

Purification de l’extrait 

Elle a été faite sur une colonne de gel de silice (Merck, Allemagne). La colonne est constituée d’un tube de verre de 2 cm de diamètre et de 40 cm de longueur équipée d’un robinet et comportant à sa partie supérieure une ampoule de 150 ml de volume.

La laine de verre est placée à la base, la colonne a été remplie de chloroforme sur une hauteur de 20 cm. Ensuite, 5 g de sulfate de sodium anhydre ont été introduits dans la colonne de façon à obtenir une base pleine. D’autre part, 15 g de gel de silice 60 (Machery-Nagel, Allemagne) ont été mis dans du chloroforme, et la suspension translucide obtenue est versée dans la colonne en évitant d’emprisonner des bulles d’air. Après 1 h de repos, 15 g du sulfate de sodium anhydre ont été ajoutés avec précaution. Le chloroforme est alors drainé jusqu’à affleurement avec le sommet du sulfate de sodium.

Les 50 ml de l’extrait chloroformique correspondant à 10g de produit de départ sont concentrés jusqu’à un volume d’environ 2-3 ml et sont déposés au sommet de la colonne, le récipient est rincé 3 fois par quelque ml de chloroforme qui sont également introduits dans la colonne. La colonne est d’abord lavée par 150 ml d’hexane ou d’éther de pétrole dépourvus de carbures benzéniques, puis par 150 ml d’éther diéthylique. Les aflatoxines sont éluées par 150 ml de chloroforme-méthanol (97-3 : V/V). Le produit d’élution est évaporé à sec au rotavapeur. Enfin, la détermination est réalisée par CCM.

Détection des aflatoxines par la CCM 

La couche mince a été préparée à l’avance par le traçage d’une ligne de départ appelée« ligne de dépôt » sur laquelle nous avons déposé nos échantillons avec des concentrations ascendantes 10μl. ,20μl. ,30μl. et 40 μl.

Le chromatogramme a été développé à l’obscurité dans le solvant de développement constitué par un mélange de chloroforme -méthanol (1/9 V/V). Le solvant est laissé s’évaporer dans l’obscurité, puis la plaque est irradiée avec de la lumière UV en la plaçant à 10 cm de la lampe. La tâche d’aflatoxine B1 donne une fluorescence bleue.

La méthode de décontamination 

Afin d’obtenir un produit purement bio nous avons décidé de travailler avec des méthodes de lutte biologique, utilisant des microorganismes antagonistes contre les pathogènes pour protéger la noblesse de notre aliment contre toute détérioration de la qualité nutritionnelle ainsi que sa qualité organoleptique.

Par son pouvoir probiotique, de nombreuses études rapportent les effets bénéfiques des lactobacilles contre les microorganismes pathogènes tels que virus, bactéries, champignons. Ils agissent également simplement en occupant la niche écologique et en entrant en compétition avec les pathogènes. Ils peuvent également produire des métabolites qui inhibent les pathogènes ou dégrader les toxines produites par ceux-ci (Turpin, 2013).

Pour réaliser le test antifongique nous nous somme basés sur la procédure suivante : 1. Recherche des bactéries lactiques dans les amandes : Cette étape permet de connaitre la possibilité de la croissance des bactéries lactiques sur notre matrice alimentaire.

Après avoir préparé nos échantillons, ainsi que la série des dilutions nous avons procédé à un ensemencement sur la gélose MRS, qui est un milieu sélectif pour le développement des bactéries lactiques et plus précisément les lactobacilles selon la méthode de dénombrement par incorporation à la gélose.

Introduction 
Partie1 : Présentation de l’organisme d’accueil et étude bibliographique 
I. Présentation de l’INRA
II. Généralité sur le secteur des fruits à coque
1. Le secteur amandier
1.1 Importance
1.2 Situation du secteur des amandes au niveau mondial
1.3 Présentation du secteur amandier au maroc
1.4 Composition et bienfaits
III. La qualité microbiologique et risques sanitaires liés à la consommation des fruits à coque
1. L’influence de la contamination sur la qualité des aliments
2. Les différents microorganismes responsables de la contamination des fruits à coque
3. La normalisation
IV. Méthodes de décontamination
1. La lutte chimique
2. La lutte biologique
3. La lutte physique (irradiation)
4. Le séchage et le stockage sous une atmosphère contrôlée
Partie 2 : Materiel et méthodes 
I. Echantillonnage
II. Les analyses bactériologiques
1. Préparation des échantillons
2. Préparation de la série de dilution
3. Principe de la méthode d’ensemencement
4. Composition et préparation des milieux de culture
5. Les méthodes de recherche des différents microorganismes
5.1 La recherche de la flore mésophile aérobie totale(FMAT
5.2 La recherche des coliformes
5.3 La recherche des germes pathogènes (salmonelles)
III. Les analyses mycologiques
1. Préparation des échantillons
2. Technique de suspension-dilution
3. Milieux de culture et ensemencement
4. Composition et préparation des milieux
5. Purification des isolats de moisissures
6. Caractérisation des isolats de moisissures
IV. Les analyses mycotoxicologiques
1. La chromatographie sur couche mince (CCM)
1.1 préparation des échantillons
1.2 Extraction
1.3 Purification de l’extrait
1.4 Détection des aflatoxines par la CCM
1.5 Confirmation de l’identité de l’aflatoxine B1
V. La méthode de décontamination
1. Recherche des bactéries lactiques dans les amandes
2. Isolement des bactéries à partir du lait
3. Diffusion à la gélose (principe d’antibiogramme)
3.1 Germe testé
3.2 Milieu de culture
3.3 Matériel antifongique
3.4 Protocole de la méthode de diffusion
Partie3 : Résultats et discussion
I. Analyse bactériologique
II. Analyse mycologique
1. Isolement, purification et identification des isolats
2. Identification des souches appartenant au genre aspergillus
3. Identification des espèces appartenant au genre penicillium
4. Discussion
III. Analyse mycotoxicologique
IV. Méthode de décontamination
Conclusion et perspective 
Bibliographie
Annexes

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