Gène et protéine CFTR

Plus de 2 000 mutations du gène CFTR sont à ce jour référencées, dont la plus fréquente est la mutation homozygote F508del (délétion de la phénylalanine en position 508). CFTR est une glycoprotéine transmembranaire appartenant à la famille des protéines ABC (Adenosine-5’- TriPhosphate Binding Cassette), transporteurs transmembranaires utilisant l’ATP (Adenosine-5’- TriPhosphate) comme source d’énergie. CFTR est exprimée au pôle apical des épithélia sécréteurs, permettant l’efflux d’ions chlorures depuis la cellule vers la lumière. Au niveau pulmonaire, elle contribue ainsi activement au maintien de l’équilibre osmotique et plus particulièrement à l’hydratation du mucus.

Gène CFTR

Le gène CFTR est localisé sur le bras long du chromosome 7 en position 7q31.2 et est composé de ~ 190 kb (kilobases) formant 27 exons à l’origine de la synthèse d’un ARNm (Acide RiboNucléique messager) de 6,5 kb (figure 4) (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rowntree and Harris, 2003). Les mutations du gène CFTR sont à l’origine de la mucoviscidose.

Protéine CFTR

Le gène CFTR code pour une glycoprotéine transmembranaire du même nom de 168 kDa (kiloDaltons) constituée de 1 480 acides aminés (Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). La protéine CFTR appartient à la famille des transporteurs ABC et est aussi connue sous le nom d’ABCC7 pour ATP-Binding Cassette sub family C member 7. Les transporteurs de la famille ABC représentent l’une des plus grandes familles de protéines et restent conservés entre les différents règnes du vivant. Leur rôle principal est le transport actif de nombreux substrats (acides aminés, peptides, protéines, lipides, ions, toxines…), permettant de réguler la balance électrolytique et hydrique des membranes plasmiques et intracellulaires par hydrolyse d’une molécule d’ATP (Gadsby et al., 2006; Gentzsch et al., 2010; Gustafsson et al., 2012).

Le modèle théorique du canal a été obtenu par modélisation moléculaire en utilisant des modèles expérimentaux de protéines homologues appartenant à la famille des transporteurs ABC (figure 5). La structure tridimensionnelle de la protéine montre une portion constituée de motifs en hélice et correspondant aux domaines transmembranaires (MSD1 et MSD2 – Membrane-Spanning Domain ou également appelé TMD – TransMembrane Domains). Ils sont surmontés par deux domaines intracellulaires capables de se lier à l’ATP, appelés NBD1 et NBD2 (Nucleotide Binding Domain). Enfin, une région régulatrice (R) leur est juxtaposée. L’étendue des domaines est la suivante : 81-350 : MSD1, 433-584 : NBD1, 860-1149 : MSD2, 1219-1382 : NBD2, le domaine R n’est quant à lui pas identifié mais il s’étend entre les résidus 590-831 (CFTR1 database, http://www.genet.sickkids.on.ca/Home.html).

Les domaines MSD1 et MSD2 comprennent chacun six hélices α hydrophobes contribuant à la formation du canal, à la sélectivité anionique et à sa faible conductance. Dix des douze hélices α contiennent un ou plusieurs acides aminés chargés positivement, favorisant le passage d’ions chargés négativement. Les hélices 7 et 8 sont quant à elles, le siège de modifications post-traductionnelles telles que la glycosylation (figure 5). Les domaines hydrophiles de liaisons aux nucléotides, NBD1 et NBD2, sont formés d’un feuillet β entouré d’hélices α et contenant des séquences consensus de liaison à l’ATP. Ces domaines participent ainsi à la régulation des mécanismes ATP-dépendants d’ouverture et de fermeture du canal. Enfin le domaine de régulation R, cytoplasmique, permet de relier les deux séquences répétées MSD-NBD. Il est spécifique de CFTR et contient de nombreux résidus chargés et les principaux sites potentiels de phosphorylation par les PKA et PKC (Protéines Kinases A et C) (Chappe et al., 2003; Riordan et al., 1989).

Localisation de CFTR

L’expression de la protéine CFTR est ubiquitaire (figure 6). Elle est retrouvée au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales des organes à glandes exocrines tels que le pancréas, les glandes salivaires, les poumons, le foie, les intestins, la peau et les appareils génitaux (Crawford et al., 1991). En fonction de ces différents tissus, elle ne sera pas exprimée de la même manière. En effet, dans l’épithélium des glandes salivaires et pancréatiques elle est fortement exprimée alors qu’elle l’est moins au niveau pulmonaire (Kreda et al., 2005).

Au niveau pulmonaire, la protéine CFTR est majoritairement présente au niveau de l’épithélium de surface des voies aériennes et notamment à la face apicale des cellules ciliées (figure 7) et des glandes sous-muqueuses (Jacquot et al., 1993).

Fonction de CFTR

Canal à ions chlorures
Le canal CFTR est sensible à l’AMPc (Adenosine MonoPhosphate cyclique) et sa principale fonction est de permettre le passage des ions Cl- de l’intérieur vers l’extérieur de la cellule (Anderson et al., 1991). La conductance aux ions Classociée au canal CFTR présente des caractéristiques spécifiques, notamment aux anions. Sa séquence de perméabilité : Br- > Cl- > I- >F- , se distingue de celles des autres canaux Clépithéliaux dans lesquelles l’I- (iodure) est plus perméable que le Cl- (Anderson et al., 1991). La conductance du canal a par la suite été évaluée entre 6 11 pS (picoSiemens) en fonction du type cellulaire, de la température et de la concentration ionique (Sheppard and Welsh, 1999).

Transporteurs
Même si la principale fonction du canal CFTR est celle d’un canal Cl- , il n’en reste pas moins qu’il est aussi capable de transporter d’autres molécules, telles que des anions polyatomiques : le nitrate (NO3- ), le bicarbonate (HCO3- ), le méthanoate (HCCO- ) et l’éthanoate (CH3COO- ) (Linsdell et al., 1997), et du glutathion réduit (GSH). Le GSH est un tripeptide ubiquitaire des cellules eucaryotes, contribuant à protéger l’organisme des espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Linsdell and Hanrahan, 1998). Le flux de GSH à travers le canal CFTR est une propriété intrinsèque à celui-ci, aussi des anomalies du transport du glutathion seraient directement liées aux mutations du gène CFTR (Kogan et al., 2003).

Régulateur d’autres canaux
En 1986, avant même la découverte du canal CFTR, une hyperabsorption de Na+ avait été observée dans des cellules épithéliales CF (Boucher et al., 1986). Le canal sodique ENaC (Epithelial Na+ Channel) responsable de ces efflux est régulé négativement par le canal CFTR (figure 8) (Gentzsch et al., 2010; Kunzelmann et al., 1995; Mall et al., 1998). Chez les patients atteints de mucoviscidose, l’absence ou la déficience du canal CFTR va entraîner une levée de l’inhibition de la fonction du canal ENaC, provoquant alors un influx accru de Na+ de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule, entraînant un déséquilibre osmotique, qui aboutit à une déshydratation du liquide de surface des voies aériennes. Ce mécanisme a ensuite été confirmé chez des souris sur-exprimant la sous-unité β du canal ENaC (il en existe trois : α, β, γ) dans les poumons, qui présentaient une déshydratation et une obstruction des voies aériennes par le mucus (Mall et al., 2004). De manière controversée, quelques études ont montré qu’une perte de l’activité de CFTR entraînait une diminution de la conductance de Clsans augmenter l’absorption de Na+ dans les épithélia CF (Chen et al., 2010; Itani et al., 2011). Le canal CFTR est requis pour l’activation du canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel), canal Cl- dépendant de l’AMPc, par  PKA ou l’ATP (figure 8) (Gabriel et al., 1993).

Le canal ROMK (Renal Outer Medullary Potassium), principalement localisé au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales rénales serait également régulé par CFTR (Morales et al., 1996) (figure 8). En 1997, il a été suggéré que le canal CFTR régulait l’activité d’autres canaux tels que les CaCC (Calcium (Ca2+)-activated Chloride Channel) (figure 8) et les échangeurs Cl- /HCO3- (Kunzelmann et al., 1997; Seidler et al., 1997). Dans un modèle d’ovocytes de Xénope, il a été montré que CFTR régulait positivement l’activité des aquaporines, protéines membranaires permettant le transport de l’eau et de solutés de part et d’autre de la membrane plasmique (Schreiber et al., 1999; Schreiber et al., 2000).

Table des matières

INTRODUCTION
La mucoviscidose
1. Epidémiologie
2. Historique
3. Gène et protéine CFTR
1) Gène CFTR
2) Protéine CFTR
3) Localisation de CFTR
4) Fonction de CFTR
a. Canal à ions chlorures
b. Transporteurs
c. Régulateur d’autres canaux
d. Régulation de CFTR
5) Mutations de CFTR
a. Mutations de classe 1
b. Mutations de classe 2
c. Mutations de classe 3
d. Mutations de classe 4
e. Mutations de classe 5
f. Mutations de classe 6
g. Hétérogénéité phénotypique de la mucoviscidose
4. Diagnostic et dépistage de la mucoviscidose
5. Manifestations cliniques extra-pulmonaires
1) Digestives
a. Atteinte gastro-intestinale
b. Atteinte pancréatique
c. Atteinte hépatobiliaire
2) Génitales
3) Osseuses
4) Rénales
5) Glandes sudoripares
6) ORL
6. Manifestations cliniques pulmonaires
1) Physiologie pulmonaire
a. Généralités
b. Epithélium des voies aériennes
c. Liquide de surface des voies aériennes
2) Physiopathologie pulmonaire de la mucoviscidose
3) Inflammation pulmonaire
a. Généralités : Défense immunitaire et inflammation
b. Inflammation pulmonaire dans la mucoviscidose
c. Les voies de signalisation impliquées dans l’inflammation
d. Rôle de CFTR dans l’inflammation
7. Stratégies thérapeutiques
1) Prise en charge de l’atteinte digestive, pancréatique, hépatobiliaire et osseuse
2) Prise en charge de l’atteinte pulmonaire
a. Thérapie améliorant la clairance mucociliaire
b. Thérapie anti-infectieuse
c. Thérapie anti-inflammatoire
d. Transplantation pulmonaire
3) Nouvelles stratégies thérapeutiques
a. Thérapie génique
b. Thérapie protéique
c. Thérapie anti-inflammatoire
Les microARN
1. Découverte des miARN
2. Principe de l’ARN interférence
3. Biosynthèse des miARN
1) Organisation génomique
2) Transcription du pri-miARN
3) Maturation nucléaire du pri-miARN
4) Export dans le cytoplasme
5) Maturation cytoplasmique du pre-miARN
6) Appariement à l’ARNm cible
4. Mode d’action des miARN
1) Interaction avec les transcrits
2) Les miARN mimics
3) Les miARN inhibiteurs
5. Outils bio-informatiques pour la prédiction des sites cibles
6. MiARN et mucoviscidose
1) Régulation de CFTR par les miARN
2) Régulation des processus inflammatoires par les miARN
3) Régulation de l’obstruction bronchique et de l’infection par les miARN
7. MiARN : biomarqueur et thérapies
1) MiARN : biomarqueur
a. Généralités
b. Applications
2) MiARN : perspectives thérapeutiques
a. Thérapies de remplacement
b. Thérapies de blocage
c. Voies d’administration
d. Applications thérapeutiques
OBJECTIF DU TRAVAIL
RESULTATS
Article : Small RNA and transcriptome sequencing reveal the role of miR-199a-3p in
inflammatory processes in cystic fibrosis airways
1. Contexte de l’étude
2. Résultats
3. Conclusion
4. Article
5. Résultats complémentaires
6. Résultats de révision de l’article
Origine de la dérégulation de miR-199a-3p
1. Matériels et méthodes
2. Contexte pro-/anti-inflammatoire
1) Contexte pro-inflammatoire
2) Contexte anti-inflammatoire
3. Dysfonction intrinsèque de CFTR
4. Modulation calcique
5. Infection par Pseudomonas aeruginosa
6. Conclusion
Interaction entre les miARN
1. Matériels et Méthodes
2. Régulation de NFκB1 par miR-9-5p
3. Interaction entre miR-199a-3p, miR-636 et miR-9-5p
4. Lien entre miR-9-5p et miR-199a-3p
5. Spécificité des transfections
6. Impact de la co-transfection de deux miARN sur l’activité NF-κB, la sécrétion en IL-8 et
IL-6
7. Conclusion
Article : miR-636, a newly-identified actor for the regulation of pulmonary
inflammation in cystic fibrosis
1. Contexte de l’étude
2. Résultats
3. Conclusion
4. Article
Biomarqueurs
1. Matériels et méthodes
2. Plasmas
3. Neutrophiles
4. Conclusion
Small RNAseq et RNAseq – Vertex
1. Matériels et méthodes
2. Résultats
1) RNAseq – Vertex
2) Small RNAseq
DISCUSSION
CONCLUSION

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