Fusion cellulaire et électroperméabilisation : mécanisme, applications

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Le champ électrique et le vivant :

Bien que certains effets du champ électrique sur levivant aient été observés depuis des siècles, les premières études décrivant l’effet invitro d’un champ pulsé datent de la fin des années 1960 (Coster 1965, Sale et al. 1968). Il a été observé que, suite à l’application d’impulsions électriques, les membranes cellulaires se déstructuraient à l’image d’un diélectrique qui claquerait sous un champ électriqu intense (Neumann et al. 1972, Crowley 1973, Zimmermann et al. 1974). Quelques années plus tard, il a été démontrque cette déstructuration pouvait être réversible et permetitaà certaines molécules de, contrairement à leur nature, traverser la membrane (Mir et al. 1988, Rols et al. 1998).
La membrane cellulaire est principalement constituée d’une double couche lipidique (phospholipides présentant une tête hydrophile et une queue hydrophobe) dans laquelle sont insérées des protéines (figure 1.1). Les échangesntre l’intérieur et l’extérieur de la cellule se font en général à travers ces protéines, ou par diffusion à travers les phospholipides dans le cas de molécules lipophiles.

Schéma plus réaliste (Mauroy 2010)

Ainsi, la membrane est très sélective concernant les échanges intra et extracellulaires. Or, durant les expériences précitées, des moléculesnormalement bloquées par la membrane se retrouvaient à l’intérieur de la cellule suite à l’ application d’impulsions électriques. Ceci prouve que, grâce aux impulsions électriques, la membrane entre dans un état perméabilisé (restreint) laissant diffuser certaines macromolécules, et dans les deux sens.

Membrane cellulaire et électroperméabilisation :pore ou pas pore ?

Dans le cas d’impulsions longues ou de très forte amplitude, la membrane est totalement détruite (lyse cellulaire) (Sale et al. 1968). Mais que se passe-t-il au niveau membranaire dans le cas d’impulsions plus modérées? Il y a bien création de défauts membranaires facilitant l’accès de grosses molécules, mais les phospholipides sont-ils seulement « déstabilisés » au sens physico-chimique, ou des pores se créent-ils littéralement ? A ce jour, la communauté scientifique n’a pas définitivement statué sur le sujet et les deux théories existent (voire 3 en considérant la possibilité d’une combinaison de déstabilisation et de présence de pores). En effet, le fait, qu’à ce jour, les deux termes électroporation et électroperméabilisationrestent utilisés, témoigne de cette incertitude.
En se penchant sur la théorie, des simulations en dynamique moléculaires montrent qu’en appliquant un potentiel transmembranaire (différence de potentiel entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule) à l’aide d’un champ électrique externe, il est possible de former des pores dans la membrane (Tarek 2005, Delemotte et al. 2008). Ces simulations montrent ainsi que la présence d’un champ électrique externe assez élevé déstabiliserait tellement la bicouche lipidique que des molécules d’eau pourraient se frayer un chemin créant ainsi un pont hydrique à travers la membrane : un pore. Ce pont permet ensuite la diffusion de molécules hydrophiles vers le cytoplasme ou vers lemilieu extracellulaire. Ce type de pores serait très peu stable et aurait une durée de vie rèst courte (Vernier et al. 2010) (Figure 1.2).
Figure 1.2 : Simulations en dynamique moléculaire du cycle devie d’un pore (Vernier et al. 2010). D’autre part, la dynamique moléculaire laisse penser que la formation de pores est indépendante de la durée des impulsions. En fait, pour peu que la tension transmembranaire soit supérieure à 2 V, et que l’impulsion dure plus de 2 ns, des pores se créeraient en moins de 10 ns et disparaitraient en quelques dizaines de ns (Vernier et al. 2007).
Cependant, une membrane cellulaire est plus complexe qu’une bicouche lipidique car beaucoup de protéines et de molécules différentes’ys insèrent et l’entourent. La création de pores dans la membrane des modèles cellulaires est donc controversée(Teissié et al. 2005).
D’autant plus que les ponts hydriques n’ont pas enc ore été expérimentalement mis en évidence. Toutefois, l’augmentation de la perméabisationl de la cellule ne peut être remise en cause. Et c’est cet accès facilité au cytoplasme qui est à l’origine du nombre et de la diversité des applications de l’électroperméabilisation.

Applications de l’électroperméabilisation:

L’état perméabilisé décrit précédemment peut êtreéversible. Néanmoins, bien que les impulsions d’électroperméabilisation classique ne durent que quelques dizaines de microsecondes, la membrane met plusieurs minutes avant de retrouver son état naturel et barrer la route à la majorité des molécules (Pucihar et al. 2008). Dépendamment de l’intensité et de la durée des impulsions appliquées, plusieursétats sont possibles (Figure 1.3).
Figure 1.3 : Schéma récapitulant les différents effets obtenuspar application d’impulsions électrique sur des cellules et quelques applications : IRE = Electroporation irréversible (ablation de tumeurs), ECT = ElectroChimio thérapie, EGT = Electro transfert degènes (Silve 2011)
Cette diversité d’états en fonction des paramètresappliqués ainsi que la possibilité d’accéder facilement à l’intérieur de la cellule ont ouvert la voie à bon nombre d’applications dont les principales sont listées ici et en figure1.4:
• Lyse cellulaire et extraction de contenu cytoplasmique:
Déjà en 1968, Sale et Hamilton avaient mis en évidence que l’application de champs intenses entrainait la destruction de la membrane provoquant une lyse cellulaire. Cette méthode a ensuite été utilisée pour l’analyse du contenu de ellulesc après leur lyse. D’autre part, Neumann a très tôt démontré (1972) que même une perméabilisation réversible pouvait permettre à certaines molécules de sortir de la cellule.
• Ablation tumorale :
Toujours dans le registre de la perméabilisation iréversible, il est possible de détruire une tumeur sans intervention chirurgicale (Davalos et al. 2005). En effet, l’augmentation de la durée des impulsions ou de leur nombre peut induiredes dommages irréversibles à un tissu sans induire d’effets thermiques. Ainsi, un tissu tumoral peut être détruit sans avoir à y accéder directement (par chirurgie). Cette technique proposant une méthode efficace d’ablation tumorale, même dans des zones difficilesd’accès, et sans intervention chirurgicale lourde, semble donc tout à fait cliniquement réalisable.
• Agroalimentaire :
Dans ce cadre, l’utilisation de champs intenses est exploitée par les industriels pour l’extraction de jus (raisin, betterave, canne à suc re), la stérilisation de jus de fruits ou de lait (Jeyamkondan et al. 1999).
• Electrochimithérapie (ECT):
L’accès facilité au cytoplasme grâce aux impulsions électriques a permis à beaucoup d’applications, nécessitant l’entrée de molécules ydrophiles dans la cellule, de se développer. Néanmoins, l’application in vivo la plus aboutie dans ce domaine reste l’électrochimiothérapie. Ce traitement consiste à lectroperméabiliser réversiblement et localement les cellules cancéreuses avant d’injecter un médicament cytotoxique. Dans le cadre de la chimiothérapie classique, la quantité demédicament entrant dans les cellules est faible car ces dernières sont souvent non-perméantes (n’entrant pas d’elles-mêmes dans les cellules). Les doses sont alors augmentées pour maximiser la quantité de principe actif dans les cellules tumorales. D’un autre côté, les fortes doses entrainent des effets secondaires importants. Le rôle de la perméabilisation du tissu tumoral juste avant (ou juste après) l’injection du médicament va permettre une entrée massive des molécules d’intérêt, et donc une réduction des doses nécessaires à l’induction d’un effet.
Les premiers tests in vitro (Mir et al. 1988, Orlowski et al. 1988) combinaient l’effet de la bléomycine (agent anti-cancéreux par induction de assuresc de l’ADN) et d’impulsions électriques. Très rapidement, le traitement fut appliqué sur l’animal (Mir et al. 1991a) puis en tests cliniques (Mir et al. 1991b). En 2006, les protocoles furent standardisé et un générateur TM dédié mis sur le marché (Cliniporateur ) (Mir et al. 2006). A ce jour, plus de 100 cliniques prodiguent efficacement des traitements par électrochimiothérapie.
• Outil de laboratoire :
Toujours dans le cadre de l’accès au cytoplasme, l’électroperméabilisation est très souvent utilisée en routine de laboratoire pour le transfer de gènes dans des bactéries (transformation) ou de cellules (transfection) (Taketo 1988, Potter 1988). Ces utilisations ont permis l’entrée sur le marché de plusieurs systèmes commerciaux d’électroperméabilisation.
• Thérapie génique (EGT):
Le transfert d’un gène à l’intérieur de cellules ou d’un tissu à l’aide d’impulsions électriques a aussi été transposé à la médecine. En effet, l’utilisation de l’électroperméabilisation permet de s’affranchir de l’emploi d’un quelconque virus qui pourrait entrainer un risque pour le patient
10
(Mir et al. 2005, Mir 2009). Le premier test clinique en Phase I d’électrotransfert de gène sur des patients atteints de cancer est concluant (Daud et al. 2008).
• Nanoporation
Grâce aux progrès technologiques, il est maintenant possible de délivrer des impulsions ultracourtes (10 ns à 300 ns) et de très forte amplitude (10 à 150 kV/cm) ; ce sont les nanopulses (nPEF). Les premières expérimentations uggèrents que l’application sur le vivant de ce genre d’impulsions très courtes pourrait entraîner la perméabilisation des membranes lipidiques internes de la cellule sans endommager l’enveloppe externe (Schoenbach et al. 2001). Néanmoins, bien que ces impulsions induisent des effets internes de la cellule (apoptose,…) (Schoenbach et al. 2007), il a été noté que la membrane externe étaitaussi perméabilisée. Cependant, dans ces conditions, la embrane cytoplasmique n’est perméable qu’à de petites molécules (Vernier et al. 2006, Villemejane 2009, Dalmay et al. 2012).
• Electrofusion :
Comme mentionné en partie I.1.1.b, ce mode de production d’hybridomes fut découvert en 1982 par l’équipe de Zimmermann. La partie qui suit traite plus en détail cette application.
Figure 1.4 : Exemples d’applications d’électroperméabilisation.

Electrofusion cellulaire : paramètres, mécanisme

• Influence des paramètres électriques :
En réalité, les limites entre les états de perméabilisation ne sont pas aussi tranchées que le laisse penser la figure 1.3 ; ces états sont aussi fortement dépendants du type cellulaire. Par ailleurs, d’autres paramètres que la durée et l’amplitude des impulsions électriques impactent la perméabilisation (Pucihar et al. 2002). Toutefois, plusieurs études ont constaté que 8 à 10 impulsions suffisaient à avoir un bon niveau d’expr ession de plasmides in vivo (Rols et al. 1998). Teissié et al. (1998) ont aussi prouvé qu’au-delà de 10 impulsions, le taux de perméabilisation ne changeait pas significativement. De même, l’augmentation de la fréquence de répétition n’améliore pas le taux de rméabilisationpe (Pucihar et al. 2002), mais peut augmenter son seuil. Le principal avantage de l’augmentation de la fréquence des impulsions est la diminution de la contraction musculaire durant les tests in vivo. Quant aux tests in vitro, ils utilisent généralement une fréquence de 1 ou2 Hz.
Concernant l’électrofusion, ces mêmes paramètres peuvent avoir une influence sur l’efficacité. Les expériences de Teissié (1998) ontprouvé qu’au-delà de 20 impulsions (de 100 µs), le pourcentage de fusion chutait, en même temps que la viabilité cellulaire. D’autre part, le rendement de fusion ne changeait pas en augmentant la durée d’impulsion au-delà de 100 µs, contrairement à la viabilité qui chutait ic i aussi. L’application de 10 impulsions d’une durée de 100 µs avec une fréquence de 1 Hz semble al plus appropriée dans le cadre de l’électrofusion.
• Mécanisme de fusion :
Afin de fusionner deux cellules, il faut tout d’abord mettre en contact leurs membranes. Or, lorsque deux cellules sont très proches, plusieurs forces entrent en jeu. L’ensemble de ces forces donne lieu à une énergie libre d’interaction gouvernant l’adhésion ou la répulsion des membranes (figure 1.5.A). Cette énergie présente deux minimas correspondant aux situations d’adhésion stable. A une distance de 3-10 nm, il existe une adhésion faible entre les membranes, gouvernée par les forces de Van Der Waals entre les molécules des deux surfaces lipidiques se faisant face. Pour des distances plus courtes (1-2 nm), le minimum, se traduisant par une adhésion forte, est gouverné par les forcesd’ondulation et d’hydratation. Les forces d’ondulation sont dues aux fluctuations membranaires pouvant empêcher l’interaction entre les membranes. Quant à la force d’hydratation, elle correspond à une répulsion provenant de la couche structurée de molécules d’eau présente àla surface de la membrane. Ces deux
dernières forces érigent une barrière énergétiquempêchante les membranes de se mettre en contact. Pour qu’il y ait fusion, il est nécessaire que le bilan des forces corresponde à une attraction et non plus à une répulsion. Le processus de fusion doit donc être précédé par la déstabilisation des molécules d’eau inter-facialesafin de diminuer la répulsion due aux forces d’hydratation. C’est l’application d’une impulsion électrique qui entraine, dans le cas de l’électrofusion, cette déstabilisation conduisant à l’état fusogène (Ramos 2000, Lentz et al. 1994).
Figure 1.5 : Théories sur le processus d’électrofusion. A. Energie libre d’interaction entre deux membranes en fonction de leur distance (Ramos 2000). B. Modèle d’électrofusion, ‘mécanisme de la tige’ (Chernomordik et al. 2008, Mauroy 2010).
Dès lors que les deux membranes sont en contact (pas de continuité lipidique ou aqueuse), elles peuvent fusionner. Le modèle théorique de fusion le plus largement repris dans la littérature est le mécanisme de la tige (figure1.5.B). Tout d’abord proposé en 1984 par Markin (Markin et al. 1984), il a ensuite été repris par Chernomordik en1995 (Chernomordik et al. 2008). Les études ont montré l’existence, dans ce mécanisme, d’une étape intermédiaire où les feuillets externes des membranes sont connectés mais pas les feuillets internes : c’est la tige d’hémifusion. Cette tige est instable mais peut s’étendre en diaphragme. Enfin, un pore de fusion se forme dans la bicouche du diaphragme d’hémifusion ou directement à partir de la tige. Ce pore connecte alors les deux cytoplasmes.
Le faible taux de fusion obtenu par les différentes méthodes représente un frein à l’essor de l’électrofusion. D’autant plus que pour certaines applications comme l’immunothérapie du cancer, il est nécessaire de produire de grandes quantités d’hybridomes à partir d’un faible échantillon tumoral pour espéreravoir une dose efficace de vaccin (annexe 2). Or les rendements proposés par électrofusion encuvette classique d’électroporation restent insuffisants. Il est important de noter que la fusion anarchique dans ces dispositifs donne lieu à une suspension mixte contenant des hybridomes hétérogènes souvent polynucléaires (probablement peu viables) et des fusions homogènes nécessitant une irradiation. Ainsi, le réel rendement de fusions utile est très faible. S’il était possible de placer les cellules de manière à n’avoir que des fusions binucléaires hétérogènes, le rendement réel serait décuplé. Mes travaux de thèse ont vocation à montrer que les microtechnologies ont un fort potentiel pour surmonter ce verrou.

Biopuces ou Lab-On-Chip : De la Bio pour la Bio !

Le prix Nobel Richard Feynman durant son discours en 1959 sensibilisait la communauté scientifique au domaine des micro/nanotechnologies (« There’s plenty of room at the bottom », Feynman 1959). Bien que la technologie ne le permettait pas encore à l’époque, ce scientifique entrevoyait déjà comment les micro/nano dispositifs pourraient révolutionner la science. Ce discours est souvent considéré comme le point de départ de la recherche en micro/nanotechnologies. Il a toutefois fallu attendre le développement des procédés technologiques de fabrication des circuitsintégrés pour que les microsystèmes voient le jour. Ainsi, ce n’est qu’à partir des années 70-80 que les MEMS (pour MicroElectroMechanical Systems) ont commencé à émerger. Depuis les années 80, un nombre incalculable de systèmes microscopiques a été développé et commercialisé. Ces systèmes sont maintenant utilisés dans la vie de tous les jours, et le domaine reste en plein essor. Mais les ambitions du Professeur Feynman et de son doctorant Albert R. Hibbs pour les microtechnologies allaient encore plus loin. En 1959, ils voyaient déjà ce que les microsystèmes pourraient faire dans le cadre de la médecine. Des microsystèmes comme les puces implantables régulatrices d’insuline (Lang et al. 2011, Raoux et al. 2011), la mesure en continu de la pression intraoculaire (Auvray et al. 2012) ou encore dans le domaine des implants rétiniens (Djilas et al. 2011) sont à l’étude. C’est ainsi que le domaine des Bio-MEMS (par abus de langage : microsystèmes à applications Biomédicales) se développe rapidement devenant une thématique de recherche à part entière. Les laboratoires sur puce ou LOC (Lab On Chip) s’insèrent dans cette thématique. Dans un LOC, plusieurs fonctions sont combinées pour détecter, synthétiser, extraire, analyser ou encore utiliser des molécules chimiques ou biologiques, recréant ainsi tout un laboratoire sur quelques cm² (voire moins). Ces analyses se passant dans un environnement fluidique et à l’échelle du micromètre ; les LOCs se placent dans le domaine de la microfluidique.

Table des matières

I. Contexte et état de l’art 
I.1. Fusion cellulaire et électroperméabilisation : mécanisme, applications
I.1.1 : Fusion cellulaire.
a. Pourquoi ?
b. Comment ?
I.1.2 : Le champ électrique et le vivant :
a. Membrane cellulaire et électroperméabilisation : pore ou pas pore ?
b. Applications de l’électroperméabilisation
c. Electrofusion cellulaire : paramètres, mécanisme
I.2. Lab On Chip : de la bio pour la bio !
I.2.1. La microfluidique et les applications biomédicales
I.2.2. Systèmes microfluidiques (Lab On Chip) pour l’électrofusion
a. Piégeage par voie biochimique
b. Piégeage par voie microfluidique
c. Piégeage par voie électrique
I.3. Conclusion
II. Théorie et conception 
II.1. Les forces mises en jeu
II.1.1 Diélectrophorèse (DEP) et facteur de Clausius-Mossotti
a. Modèle électrique d’une cellule
b. DEP conventionnelle et DEP à ondes progressives
II.1.2. Evaluation des forces mises en jeu
a. Définition des forces mises en jeu
b. Bilan des forces avec approximations
c. Calcul par éléments finis : sans approximations
II.2. Piégeage et appariement de cellules : optimisation des géométries
II.2.1. Etude de la fusion : géométrie à plots isolants
II.2.2. Parallélisation : méthode fluidique
II.2.3. Parallélisation : méthode électrique (électrodes non connectées)
a. Présentation de la stratégie de capture
b. Structure d’appariement
c. Matriçage
II.3. Potentiel transmembranaire : prise en compte de l’environnement cellulaire
II.3.1. Théorie : calcul et simulation du potentiel transmembranaire
a. Calcul analytique du potentiel transmembranaire
b. Calcul numérique (en éléments finis) du potentiel transmembranaire
II.3.2. Evolution du potentiel transmembranaire pour deux cellules très proches
II.3.3. Evolution du potentiel transmembranaire dans la structure à plots isolants
II.3.4. Potentiel transmembranaire dans la structure de parallélisation à plots conducteurs
II.4. Conclusion
III. Microfabrication 
III.1. Fabrication de la biopuce
III.1.1. Résumé du protocole de fabrication
III.1.2. Cas des électrodes fines
III.1.3. Cas des électrodes épaisses : dépôt électrolytique d’or
a. Dépôt d’or
b. Gravure d’électrodes épaisses
III.1.4. Microfabrication des canaux fluidiques
III.2. Packaging
III.2.1. Packaging irréversible PDMS/SU8
a. Les différentes techniques de packaging SU8
b. Protocole développé
c. Caractérisation de la silanisation
– Etude par spectroscopie FT-IR
– Etude par microscopie AFM
– Etude de mouillabilité et de stabilité dans le temps du greffage
d. Caractérisation du collage
– Mesure de flux limite
– Mesure en traction (pull-test)
e. Application au packaging de dispositifs fonctionnels et au scellement d’autres matériaux
III.2.2. Procédés de packaging réversible en cours de développement
a. Collage PDMS/PDMS
b. Collage PDMS/DMPMS
III.3. Conclusion
IV. Résultats des expérimentations biologiques 
IV.1. Milieux de fusion
IV.1.1. Conductivité et électroperméabilisation
IV.1.2. Effet de l’osmolarité
a. Variation du volume cellulaire due au choc osmotique
b. Effet du choc osmotique sur la DEP
c. Détermination des caractéristiques cellulaires par électrorotation
d. Osmolarité et viabilité cellulaire
IV.1.3. Déformation mécanique d’une cellule pendant l’application d’un champ électrique ou « électrodéformation »
a. Déformation due à l’application de la diélectrophorèse
b. Electrodéformation durant l’application d’une impulsion
IV.1.4. La cellule après impulsion
IV.2. Etude de l’électrofusion dans une structure à plots isolants
IV.2.1. Procédure expérimentale et fusion dans la structure à plots isolants
IV.2.2. Effet de la concentration du champ électrique sur la fusion
a. Rendement de fusion
b. Dynamique de fusion
IV.3. Structures pour la parallélisation de l’électrofusion sur puce
IV.3.1. Piégeage de cellules : comparaison des deux structures développées
a. Piégeage fluidique
b. Piégeage électrique (DEP)
IV.3.2. Electrofusions en parallèle (B16F10, Jurkat)
IV.4. Conclusion
V. Conclusions et perspectives 
Annexe 1 : Rappels sur le système immunitaire
Annexe 2 : Immunothérapie du cancer
Annexe 3 : Rappels de calcul thermique
Références bibliographiques 
Liste de publications

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