Formulation des nanoparticules de polymères préformés à partir d’émulsion 

Fonctions 

La respiration

La respiration se défini par deux mécanismes : l’inspiration qui fournit l’oxygène de l’air à l’organisme et l’expiration qui permet d’éliminer le CO2.
Cet échange gazeux se produit au niveau des poumons et dans les alvéoles pulmonaires grâce à une différence de pression.
L’échange gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires s’effectue par diffusion alvéolo-capillaire. Le gaz présent dans les alvéoles doit être renouvelé. Il existe un ensemble de structures qui joue un rôle plus ou moins actif dans le processus de ventilation. Les muscles ventilatoires constituent l’ensemble actif. Les voies aériennes, le poumon, la paroi thoraco-abdominale forment le système mécanique passif.
La respiration est un phénomène automatique et inconscient. Au repos, le rythme ou fréquence respiratoire d’un adulte moyen est de 16 respirations par minute.
Chaque jour, un adulte inspire environ 8000 litres d’air (à raison de 0,5 litre d’air environ par inspiration).
Le poumon est constitué d’une partie conductrice constituée par les bronches et les bronchioles et une partie respiratoire correspondant aux alvéoles.
La respiration implique des changements de volume au niveau du poumon qui sont possibles grâce à la distensibilité de cet organe. La capacité de rétractation élastique des alvéoles survenant lors de la ventilation est majoritairement due au tissu pulmonaire.
Le tissu conjonctif du poumon est constitué par un réseau de fibres connectées entre elles et fixées à la fois au tissu conjonctif du poumon et à celui qui entoure les vaisseaux. La distensibilité pulmonaire est assurée par un équilibre entre les différentes protéines de structure qui constituent les fibres (élastine, collagène, glycoprotéine, protéoglycanes). L’élastine peut être dégradé par une protéase (élastase) dont le rôle est de défendre le poumon contre les agressions extérieures. Mais la présence d’antiprotéase d’origine hépatique limite l’action de l’élastase. Lorsque cet équilibre est perturbée on observe un dysfonctionnement dans le système mécanique ventilatoire. Ce cas de figure estrencontré dans l’intoxication tabagique où une diminution de l’activité antiprotéasique est observée.

Circulation pulmonaire et échanges gazeux

Lors de l’inspiration, l’air entre dans les poumons via la cavité nasale puis la trachée et le dioxygène (O 2) contenu dans l’air passe au travers de la paroi des alvéoles pulmonaires. Il se fixe alors dans les capillaires sanguins directement sur les globules rouges (hématies) et à l’inverse le CO 2 dissout dans le plasma sanguin passe dans le sens inverse du sang vers l’air pulmonaire pour êtreexpulsé par l’expiration.
Le sang alors oxygéné est ainsi transporté dans l’ensemble du corps (organes puis cellules) par les artères grâce à la circulation sanguine. Au niveau descellules se produit la respiration cellulaire où l’O 2 est consommé et leCO2produit, par une réaction d’oxydo-réduction qui dégage de l’énergie sous forme d’une molécule appelée ATP (Adénosine TriPhosphate). Le CO 2 produit est dissous dans le plasma sanguin et est réacheminé vers les poumons par la circulation sanguine veineuse pour être expulsé dans l’air pulmonaire par le mécanisme d’expiration.
Le transport de l’oxygène vers les tissus s’effectue soit par convection oudiffusion (figure 4)

Clairance muco-ciliaire

Les plus grosses particules sont arrêtées et éliminées par la cavité nasale et le nasopharynx. Les particules de plus petite taille pénètrent au niveau des voies aériennes supérieures et inférieures et se déposent, principalement par mécanismes d’impaction (projections contre les surfaces par inertie des particules) et de sédimentation (chute sous l’action de la gravité), au niveau de la muqueuse trachéobronchique, avant d’être éliminées par le jeu de l’épuration mucociliaire.
Le mucus intervient dans la défense de la muqueuse, à la fois par ses propriétés anti-infectieuses (antiprotéases) que par ses propriétés mécaniques et rhéologiques. Il constitue une barrière efficace entre l’environnement et la muqueuse des voies aériennes. Les particules sont piégées dans le mucus et peuvent remonter vers le pharynx puis l’oropharynx grâce au mouvement coordonné des cils de l’épithélium pour être avalées voire expectorées : on parle de l’ascenceur muco-ciliaire.
Ce mucus respiratoire est mobilisé en permanence par le mouvement ciliaire des cellules ciliées, à une vitesse qui croît depuis les bronchioles jusqu’à la trachée comme l’explique le tableau II.

Exemples de maladies respiratoires

L’administration médicamenteuse par inhalation présente un intérêt majeur dans le traitement local des pathologies telles que la tuberculose, la mucoviscidose, l’asthme, les fibroses cystiques, la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO),…

La tuberculose

C’est une maladie infectieuse causée par des bacilles acido-alcoolo résistants (BAAR) appelés bacille de Koch. Ces micro oragnismes sont également appelés bacilles « tuberculeux » à cause des nodules ou tubercules qu’ils entraînent. On distingue deux formes de tuberculoses. La tuberculose pulmonaire qui est la seule forme contagieuse et la tuberculose extra pulmonaire qui n’est pas contagieuse [41]. La tuberculose représente encore aujourd’hui un important problème de santé publique. Parmi ce total de cas recensé 10% étaient VIHpositif [W10]. Malgré un traitement connue et efficace, plus de 98% des décès par tuberculose sont notifiés dans les pays d’Afrique, d’Asie et d’Amérique latine. Au Sénégal la forme pulmonaire est la plus fréquente et constitue 80% des cas. L’incidence de la tuberculose est de 150/100 000 habitants à Dakar [38]. La tuberculose se traite actuellement par la prise d’antibiotique sous forme de comprimé. L’administrationpulmonaire pourrait être envisagée pour le traitement local de cette forme de tuberculose.
Des études sont actuellement menées pour développer une forme inhalée en vue de surmonter le problème d’efficacité du traitement actuel. Le principe actif serait directement délivré au niveau du site d’action désiré, ce qui permettrait d’améliorer l’observance en diminuant le nombre d’administration et d’éviter la survenue d’effets indésirables.

La mucoviscidose

Il s’agit d’une des maladies génétiques les plus fréquentes. Elle résulte d’une anomalie du transport trans-épithélial du chlore et de l’eau. Le gène muté responsable est localisé sur le chromosome 7 et code pour une protéine membranaire CFTCR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) qui est un canal chlore établissant un équilibre hydroélectrique de part et d’autre de la membrane. Le traitement actuel est symptomatique et non curatif. La priseen charge se résume à une kinésithérapie respiratoire quotidienne, antibiothérapie en cas d’infection, une oxygénothérapie ou un régime hypercalorique, normolipidique et vitaminothérapie ; pour les cas critiques unegreffe pulmonaire est envisagée.

Administration de substances médicamenteuses par inhalation

La voie pulmonaire est sollicitée dans le traitement local des affections des voies aériennes mais elle pourrait être utilisée dans le traitement systémique des pathologies.
Dans l’industrie pharmaceutique de grands axes de recherche sont développés en innovation galénique autour du thème de l’administration de principes actifs par inhalation. L’objectif est d’explorer de nouveaux systèmes d’administration de substances médicamenteuses en vue d’améliorer l’absorption des principes actifs en évitant l’effet de premier passage hépatique ; d’améliorer l’observance en étant non-invasif et surtout de permettre aux molécules actives d’atteindre spécifiquement leur cible. La voie pulmonaire apparaît comme étant une voie prometteuse et alternative face à la voie orale et parentérale.

L’historique de l’administration par voie pulmonaire

Les troubles du système respiratoire se traitent depuis plusieurs milliers d’années par administration pulmonaire. Divers écrits et dessins retrouvé à travers le monde en témoignent [47]. Ainsi les feuilles de l’atropa belladona étaient déjà fumées 2000 ans av. J-C par les indiens afin de traiter les crises de toux [9, 46].1000 ans plus tard, les grecs fumaient des extraits de pin afin de traiter la tuberculose [46].
Au II ème siècle après J-C, un médecin grec, Galien, proposa de soigner les affections bronchiques (principalement la tuberculose) par inhalation d’eau de mer.
L’inhalation fut redécouverte en Europe vers le XVII ème siècle. Des plantes telles que l’Atropa Belladonna mais aussi le Datura Stramonium, fumées en mélange au tabac, restèrent jusqu’au début du XX ème les traitements les plus efficaces de lacrise d’asthme. Le mode d’administration par inhalation fut longtemps destiné exclusivement à un traitement loco-régional des pathologies pulmonaires.
Toutefois la découverte au XIX ème siècle des gaz médicaux anesthésiants permit d’envisager l’inhalation comme un nouveau mode d’administration systémique.
Les premiers dispositifs pour inhalation sont apparus au XIX ème siècle et sontdepuis lors en constante évolution : le premier nébuliseur fut mis au point en 1829 suivi d’un nébuliseur portable en 1858 (figure 6).

L’administration par inhalation

La voie pulmonaire présente un grand intérêt dans l’administration de médicaments aussi bien pour une action locale que systémique. Elle offre une alternative aux voies orales et injectables pour l’administration de moléculesfragiles telles que les protéines, peptide et nucléotides.

Avantages offerts par la voie pulmonaire

Pour l’obtention d’un effet systémique

L’ultra structure de la barrière alvéolo-capillaire et du surfactant qui la recouvre est particulièrement bien adapté aux échanges gazeux entre l’air et le sang. La membrane alvéolo-capillaire offre ainsi un site d’échange idéal entre le milieu extérieur et le compartiment sanguin avec une surface d’absorption très importante. En effet la surface d’absorption de l’épithélium pulmonaire est plus importante que celui de l’épithélium gastro-intestinal. De plus la membrane alvéolaire est très vascularisée et fine (0,2 à 0,7µm d’épaisseur) ce qui la rendtrès perméable. La voie pulmonaire est non invasive, son accès est simple et indolore ce qui améliore l’observance. Ce facteur ne peut être négligé, il est prisen compte dans l’évaluation de l’efficacité thérapeutique.
Les aérosols pénètrent dans les poumons à l’inspiration. Selon les propriétés physico-chimiques, les particules peuvent soit traverser la muqueuse alvéolaire et passer dans la circulation sanguine, soit se déposer sur la muqueuse bronchoalvéolaire avant d’être éliminée par voie digestive ou passer dans l’organisme par voie sanguine ou lymphatique [W9]. Une fois arrivées au niveau des voies aériennes périphériques, les particules peuvent traverser l’épithélium respiratoire. En fonction des propriétés physico-chimiques des particules ondistingue deux types de transports : paracellulaire et transcellulaire. Le transport transcellulaire s’effectue de trois manières différentes : diffusion passive, transport actif, transcytose. Les molécules relativement lipophiles peuvent, après aérosolisation dans les fluides pulmonaires, diffuser facilement à travers l’épithélium tandis que le passage des molécules hydrophiles se fait soit par transport actif soit par transport paracellulaire à travers les jonctions serrées.
Actuellement de nombreuses molécules, principalement des peptides et des protéines, sont testées en vue d’une administration par voie pulmonaire pour un effet systémique. L’insuline et l’ocytocine, la calcitonine et l’œstradiol ont montré une bonne biodisponibilité après administration pulmonaire [7].La voie pulmonaire est également sollicitée pour des traitements issus de la thérapie génique c’est-à-dire soigner en inoculant des séquences nucléotidiques déterminées. Cependant, bien que contenant des protéases, les poumons sont riches en inhibiteurs de protéases permettant de protéger la plupart des peptides et protéines inhalés.
En comparaison à la voie orale, l’administration par inhalation permet d’éviter le métabolisme hépatique et le pH acide de l’estomac. Sa faible activité enzymatique est un avantage majeur pour l’absorption de molécules fragiles.
Pour finir la cinétique d’absorption est indépendante du régime alimentaire et de la vitesse du transit gastro-intestinal.

Facteurs influençant l’efficacité thérapeutique des substances administrées par inhalation

L’efficacité thérapeutique d’un principe actif administrée par inhalation dépend  du dépôt pulmonaire des particules au site d’action ainsi que de la quantité déposée. Ces paramètres sont eux même influencés par les caractéristiques intrinsèques des particules, de la morphologie du système respiratoire de l’individu et du profil de respiration.
L’efficacité dépend également du temps de rétention au niveau du site d’action lorsque l’effet local est recherché, ou de la vitesse d’absorption dans le sang lorsque l’effet estsystémique.

Influence du diamètre aérodynamique des particules sur le dépôt pulmonaire

La taille est la caractéristique la plus utilisée pour décrire des particules, c’est ainsi que la notion de diamètre aérodynamique a été introduite.

Influence du patient sur le dépôt pulmonaire

L’âge est à prendre en compte dans la déposition des particules. En effet le calibres des voies aériennes est différent entre un adulte et un enfant [9].De plus les pathologies pulmonaires caractérisées par une inflammation et/ou une broncho constriction peuvent altérer la déposition dans le système respiratoire [26]. En effet, l’accumulation du mucus et le rétrécissement du calibre des voies aériennes augmentent les turbulences de l’air modifiant la déposition des particules.

Autres paramètres influençant l’efficacité thérapeutique

La plus importante préoccupation lors de la formulation d’une préparation pour inhalation est de s’assurer de la capacité des molécules actives à franchir les barrières biologiques telles que l’épithélium pulmonaire. Le surfactant, recouvrant l’épithélium est un obstacle à la dissolution des particules solides contenant le principe actif, en raison de son pouvoir d’agrégation. Notons que le
DPPC, phospholipide principal du surfactant, est un composé amphiphile possédant la propriété anti-mouillante. En effet il augmente la tension de surface solide-liquide et diminue ainsi l’étalement du liquide (gouttes) [21].
L’épithélium alvéolaire constitue plus de 90% de l’obstacle au passage alvéolocapillaire [51].A cela s’ajoute qu’après aérosolisation les particules solides ont une faible durée d’action due à la clairance muco-ciliaire des voies aériennes périphériques (alvéoles et bronches) [16]. C’est pour cette raison qu’il faut souvent 3 à 4 inhalations pour observer un effet thérapeutique.
La présence des macrophages au sein de la muqueuse alvéolaire peut également avoir un impact sur la fraction absorbée du principe actif. Les particules peuvent s’adsorber à la surface des macrophages ou se fixer spécifiquement sur lesimmunglobines de ceux-ci. Après adhésion, les macrophages internalisent lesparticules et forment des vacuoles. Elles sont ensuite digérées par des enzymes.
La Capture et la vitesse de phagocytose peuvent varier en fonction de la taille et de la composition des particules. Ainsi les particules de 6 µm sont moins rapidement phagocytées que celles de 3 µm. Cependant il existe une valeur seuil où cette relation n’est plus exacte. Il a été démontré que les particules inférieures à 260 nm étaient moins fréquemment et moins rapidement phagocytées que celles de 3 µm [20].

Les dispositifs pour l’administration pulmonaire

Les systèmes d’inhalation font l’objet d’avancées considérables [12].
Actuellement il existe trois grandes classes de dispositifs pour inhalation : les nébuliseurs, les inhalateurs de poudre sèche, les aérosols doseurs pressurisés et leurs dérivées.

Les nébuliseurs

Ce genre de système est le plus ancien des trois cités et a pour but l’aérosolisation de principes actifs en solution ou en suspension dans l’eau. La nébulisation ou production d’aérosol correspond à la dispersion d’une suspension médicamenteuse en fines particules ou gouttelettes dans un milieu gazeux. On distingue deux types de nébuliseurs :

Les inhalateurs doseurs pressurisés (IDP) « Metered dose inhalers- MDI »

Les IDP sont des dispositifs multi-doses qui délivrent une quantité déterminée de principe actif à partir d’une suspension ou d’une solution de ce principe actif dans un gaz propulseur liquéfié. Ces dispositifs sont les plus utilisés (Ventoline®, Becotide®). En effet les IDP présentent certains avantages. Ils sont portables et facile d’emploi, multi-doses. Cet appareil permet la délivrance de doses de manière reproductibles.
Toutefois les IDP possèdent plusieurs inconvénients. En effet ils requièrent une synchronisation entre le mouvement inspiratoire et la délivrance de la dose.
Cette synchronisation est désignée par le terme « coordination main-bouche » [44]. La fraction de particules fines qui se dépose dans les voies aériennes périphériques est inférieure ou égale à 20%. Ceci est principalement du à la grande vitesse (> 30m/s) à laquelle l’aérosol est projeté hors du dispositif, provoquant l’impaction de plus de 50% des particules au niveau de l’oropharynx [31].Des problèmes de stabilité des principes actifs ont également été rapportés, spécialement lorsque le principe actif est en suspension dans le gaz propulseurs liquéfié [9].

Les nanoparticules pour l’administration pulmonaire

Depuis quelques années les nanotechnologies sont un atout majeur pour la médecine. Une série impressionnante de progrès médicaux ont été réalisés dans le domaine de l’imagerie, dans l’amélioration du traitement mais aussi dans l’outil de diagnostic.
L’utilisation des nanoparticules dans le domaine biomédical est en pleine expansion. Leurs tailles nanométriques leur permettent d’atteindre des régions de l’organisme d’accès difficile. Elles peuvent également pénétrer dans les cellules et ainsi traverser des barrières biologiques. Elles peuvent être fonctionnalisées afin d’être spécifiquement dirigées contre les organes ou tissus malades. D’après certaines études, les nanoparticules ayant un diamètre inférieur à 250 nm ont une meilleur biodisponibilité au niveau des poumons car faiblement phagocytés par les macrophages.
Il a été également montré que le profil toxicologique et le comportement biologique des nanoparticules sont fortement influencés par leurs propriétés physico-chimiques de surface. Il est donc important de comprendre l’impact des propriétés de surfaces des nanoparticules sur leur interaction avec les cellules.

Application pharmaceutique : amélioration de la qualité des traitements.

De nombreuses études ont été menées dans le but de concevoir des systèmes permettant d’acheminer des principes actifs moléculaires ou macromoléculaires comme les acides nucléiques, les peptides, les protéines et les hormones à leur cible spécifique et cela sans causer d’effets secondaires, ni endommager les cellules saines. L’intérêt de ce système encore appelé « vecteur » est de permettre à ses molécules fragiles de franchir les barrières biologiques [24]. La vectorisation des médicaments est une technique d’administration médicamenteuse qui permet de délivrer le médicament uniquement aux cellules pathologiques.

La forme des nanoparticules

Le principe actif peut être dispersé dans une matrice formant la nanosphère ou bien être encapsulé dans le cœur hydrophobe d’une nanocapsule. La nanoparticule de type nanosphère est une matrice solide [15].Les nanocapsules sont constituées d’un réservoir dont la barrière solide entoure une phase solide, semi solide ou liquide (huileux ou aqueux). Les deux formes de nanoparticules sont illustrées dans la Figure 13.

Table des matières
INTRODUCTION 
PREMIERE PARTIE: GENERALITES
I. Généralités sur l’appareil respiratoire
I.1 Anatomie fonctionnelle de l’appareil respiratoire
I.1.1. Anatomie des régions du tractus respiratoire
I.1.2. L’épithélium respiratoire
I.1.3. Fonctions
I.1.3.1. La respiration
I.1.3.2. Circulation pulmonaire et échanges gazeux
I.2. Mécanisme de défense
I.2.1. Facteurs mécaniques
I.2.2. Clairance muco-ciliaire
I.2.3. La flore bactérienne des voies respiratoires
I.3. Exemples de maladies respiratoires
I.3.1. La tuberculose
I.3.2. La mucoviscidose
II. Administration de substances médicamenteuses par inhalations
II.1. L’historique de l’administration par voie pulmonaire
II.2. L’administration par inhalation
II.2.1. Avantages offerts par la voie pulmonaire
II.2.1.1. Pour l’obtention d’un effet systémique
II.2.1.2. Pour l’obtention d’un effet local
II.2.2. Facteurs influençant l’efficacité thérapeutique des substances administrées par inhalation
II.2.2.1. Influence du diamètre aérodynamique des particules sur le dépôt pulmonaire
II.2.2.2. Influence du profil de respiration sur le dépôt Pulmonaire
II.2.2.3. Influence du patient sur le dépôt pulmonaire
II.2.2.4. Autres paramètres influençant l’efficacité Thérapeutique
II.3. Les dispositifs pour l’administration pulmonaire
II.3.1. Les nébuliseurs
II.3.2 Les inhalateurs doseurs pressurisés (IDP) « Metered dose inhalers- MDI »
II.3.3 Les inhalateurs à poudres sèches (IPS)
III. Les nanoparticules pour l’administration pulmonaire
III.1. Définition
III.2. Application pharmaceutique : amélioration de la qualité des traitements
III.2.1. La forme des nanoparticules
III.2.2 Les types de nanoparticules
III.2.3. Relation masse et taille
III.3. Procédés de préparation des nanoparticules
III.3.1. Les matériaux
III.3.2. Formulation des nanoparticules de polymères préformés à partir d’émulsion
III.3.2.1. La méthode d’émulsion/évaporation de solvant
III.3.2.2. La méthode d’émulsion spontanée par diffusion de solvant
III.3.2.3. La technique par précipitation saline «salting out»
III.3.3 Formulation des nanoparticules de polymères préformés sans étape d’émulsification
III.3.3.1. La technique de nanoprécipitation
III.3.3.2. La méthode de dialyse
III.3.4. La méthode utilisant la polymérisation in situ
III.4. Caractérisations des propriétés physico-chimiques des Nanoparticules
III.4.1. La mesure de taille
III.4.2. Le potentiel de surface ou potentiel zêta
III.5. Les nanoparticules pour la voie pulmonaire
III.6. Modèles in vitro d’épithélium pulmonaire humain
III.7. Marquage fluorescent de nanoparticules : intérêt et applications
III.7.1. Intérêt de la fluorescence
III.7.2 Applications du marquage des NP par fluorescence
III.8. Risques potentiels des nanoparticules
DEUXIEME PARTIE: TRAVAIL EXPERIMENTAL
I.Objectifs
II. Matériel et méthodes
II.1. Matériels
II.2. Méthodes
II.2.1. Préparation des nanoparticules
II.2.2. Caractérisation physico-chimique des nanoparticules
II.2.3. Mesures de fluorescence
II.2.4. Passage des nanoparticules à travers le modèle d’épithélium pulmonaire humain
II.2.4.1. Culture de cellules Calu-3 et mise en place du modèle de barrière pulmonaire
II.2.4.2. Etude du passage des nanoparticules à travers la barrière pulmonaire
II.2.4.3. Quantification des nanoparticules
III. Résultats et discussion
III.1. Caractérisation physico-chimique des nanoparticules
III.2. Etablissement d’une méthode de quantification des nanoparticules par spectrofluorimétrie
III.2.1. Etude préliminaire : mesure de la fluorescence d’une solution de rhodamine B et de PLGA-Rhodamine B
III.2.2. Mesure de la fluorescence des suspensions de nanoparticules marquées par la rhodamine
III.3. Etude du passage de trois types de nanoparticules à travers la monocouche cellulaire Calu-3
IV. Conclusion et perspectives
CONCLUSION GENERALE 
BIBLIOGRAPHIE
Webographie

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