Formation d’adduits à l’ADN

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Propriétés physico-chimiques

Les aflatoxines sont des molécules de faibles poids moléculaires (312 à 330 g/mol).
Elles sont très peu solubles dans l’eau, insolubles dans les solvants non polaires et très s lubles dans les solvants polaires comme 1999).
Sous lumière UV, les a bleue, tandis que les aflatoxines G émettent une fluorescence verte couleurs sont d’ailleurs à l’origine de leurs dénominations : « B » pour Blue pour Green (vert). Le « M » provient quant à lui du nom de l’aliment à partir duquel les Afl toxines M ont été extraites pour la première (Pfohl-Leszkowicz, 1999; Dutton, et al., flatoxines le chloroforme et le méthanol (Pfohl aflatoxines B émettent de manière intense une fluo flatoxines (Asao, et al., 1965) . fois, le lait (Milk).
La température minimale de décomposition s’élève à 237 °C. Cette température peut atteindre 299°C pour les structures les plus thermostables telles que les aflatoxines M (Pfohl-Leszkowicz, 1999). Cette propriété les rend particulièrement résistantes aux traitements thermiques comme la congélation, la pasteurisation ou encore la stérilisation.

Ecotoxicogenèse

On distingue plusieurs conditions favorables au développement de la moisissure du genre Aspergillus et à la production d’aflatoxines qui sont (Castegnaro, et al., 2002) :
La température :
Les températures minimales, optimales et maximales pour la prolifération d’aflatoxines sont respectivement de 12 °C, 26 °C et 40-42 °C.
Les teneurs en O2 et CO2 et en pH du substrat :
La plupart des moisissures sont aérobies et nécessite une bonne oxygénation et un taux de CO2 inférieur ou égal à 10%. La tolérance au pH est assez grande (2 à 7,5).
L’activité de l’eau :
Le minimum d’activité aqueuse nécessaire au développement des Aspergillus est de 0,80 tandis que le minimum pour la production de toxine est de 0,84.
La nature du substrat :
La production d’aflatoxine par l’Aspergillus est très minime si le substrat est d’origine animale alors qu’elle est optimale si elle se développe sur des céréales ou mieux encore sur les oléagineux.

Mécanisme d’action

Formation d’adduits à l’ADN

Les effets cancérogènes et mutagènes de l’aflatoxine sont dus à sa biotransformation par les CYP450, ayant pour résultat la formation d’AFB1-8,9-époxyde. Ce dernier a une durée de vie courte mais est particulièrement réactif, il est considéré comme le principal métabolite génotoxique via sa fixation à l’ADN (AFSSA, 2009). L’AFB1-8,9-époxyde va se lier de manière covalente à l’ADN, l’ARN et les protéines. Il a une affinité particulière pour l’azote N7 de la guanine. La réaction d’adduction de ces deux composés aboutit à la formation d’un adduit à l’ADN donnant ainsi le trans-8,9-dihydro-8 (7-guanyl)-9-hydroxy-AFB1. C’est la présence de cet adduit qui est à l’origine des mutations (Joubrane, 2011). La mutation la plus fréquemment observée est la transversion G en T, c’est-à-dire le remplacement d’une base nucléique guanine par une thymine (Brochard, et al., 2009).

Toxicité aiguë

Elle se caractérise par la dose létale (DL50) qui correspond à la concentration capable d’entraîner la mort de la moitié de la population testée. Concernant l’AFB1, ce type de toxicité est moins fréquent chez l’homme que chez les animaux. Chez le caneton, la DL50 de l’AFB1 est de l’ordre de 0,36 mg/kg. La toxicité aiguë entraîne généralement la mort des animaux, qui présentent un foie décoloré et augmenté de volume et un ictère avec présence d’ascite.
Lorsque l’animal ne meurt pas, il y a prolifération de cellules indifférenciées, au niveau des canalicules biliaires. Les reins présentent des glomérulonéphrites et les poumons sont congestionnés. Les signes comportementaux les plus caractéristiques précédant la mort sont une démarche chancelante, de la nervosité et des spasmes musculaires (Hussein, et al., 2001).

Effet de l’aflatoxine chez l’homme

Cancer du foie

L’aflatoxine est liée au développement du cancer hépatocellulaire (CHC) chez l’homme et est l’hépatocarcinogène expérimental le plus puissant connu chez l’homme (CIRC, 2002). Aucun modèle animal exposé à la toxine à ce jour n’a échoué au développement du CHC. Le carcinome hépatocellulaire représente environ 9,2 % de tous les nouveaux cancers dans le monde, et ce nombre augmente d’année en année (Hussain, et al., 2007).
C’est le cinquième cancer le plus fréquent chez les hommes et le septième chez les femmes, et il survient à un âge relativement jeune dans les régions aux ressources limitées (Jemal A, 2011). De nombreuses études ont estimé que 23 % des cancers hépatique sont attribuables à l’aflatoxine dans les zones à forte exposition à cette mycotoxine (Omer, et al., 2004; Liu, et al., 2010). Environ 84% de tous les nouveaux cas de CHC surviennent dans ces régions, mais particulièrement en Afrique subsaharienne et dans la région d’Asie-Pacifique, avec une prévalence 16 à 32 fois plus élevée dans ces régions que dans les régions riches en ressources (Williams JH, 2004). La tumeur porte un pronostic particulièrement grave dans les populations à forte incidence, se classant au troisième rang des taux annuels de mortalité par cancer, et 93 % des patients meurent dans les 12 mois suivant l’apparition des symptômes, le taux le plus élevé de toutes les tumeurs humaines (Hussain, et al., 2007). L’interaction synergique entre aflatoxine et hépatite B endémique en Afrique de l’ouest doit être aussi prise en compte. L’hépatite virale B (HVB) est la principale cause du CHC en Afrique subsaharienne (Lavanchy, 2005; Fattovich, et al., 2008 ). En effet, l’aflatoxine et l’HVB ont un effet synergique multipliant par 60 le risque de développer le CHC (Ross, et al., 1992; Qian, et al., 1994; Wang, et al., 2001). Une étude en Côte d’Ivoire confirme le lien entre l’exposition à l’aflatoxine et l’apparition du CHC en Côte d’Ivoire. Cette étude menée sur un nombre limité de patients renseigne sur le niveau d’exposition des populations à l’aflatoxine.
Cette mycotoxine ayant un effet synergique avec l’hépatite virale B, le risque de développer un CHC dans cette population est très élevé eu égard au niveau d’adduit aflatoxine-lysine détecté surtout chez les témoins déjà atteints d’hépatite B (Manda, et al., 2018).
À côté de l’interaction synergique entre aflatoxine et hépatite B, il y a une autre interaction susceptible d’entraîner le CHC également ; c’est celle de l’alcool et de l’aflatoxine. Si une consommation répétée et prolongée sur le long terme de boissons alcoolisées constitue le principal facteur de risque d’une cirrhose et donc d’un cancer du foie primitif (Insitut-Curie), alors couplé  avec la présence d’aflatoxine le risque de développer ce cancer peut être décuplé.

Cancer des voies respiratoires

Comme les cellules hépatiques, les cellules du système respiratoire sont capables de transformer l’aflatoxine en différents métabolites. Des études de toxicité réalisées chez des animaux exposés à l’aflatoxine par voie respiratoire rapportent des lésions et des cancers des voies respiratoires et du foie ainsi que des altérations du système immunitaire (Sabourin, et al., 2006). Ceci pose la question de l’éventuelle exposition à ce composé par d’autres voies que la voie alimentaire. Ainsi, des études ont permis de mettre en relation des expositions à l’ aflatoxine en milieu professionnel (secteurs agricoles et agro-alimentaires) et l’apparition d’atteintes des voies respiratoires qui peuvent évoluer vers des cancers (trachée, bronches, poumons) (Chen, et al., 2014).

GENERALITES SUR LE MAIS

Le maïs, de nom scientifique Zea mays, est une céréale herbacée annuelle de la famille des poacées. C’est une monocotylédone de l’ordre des cyperales, famille des poacées, tribu des andopogoneae. La production mondiale de maïs en 2013 était de 839 millions de tonnes, contre 653 millions de tonnes pour le blé (Planetoscope-Statistique, 2013). Cultivé depuis des millénaires en Amérique Centrale, il aurait été domestiqué dans la région centrale du Mexique à partir de téosinte (Euchluena mexicana Schrod, plante annuelle qui pourrait être le plus proche parent du maïs) (Cma/aoc).

Exigences écologiques

Le maïs est une plante très exigeante en lumière. C’est une culture très sensible aux températures élevées qui plafonnent son rendement. En effet, la fécondation est perturbée dèsqu’on dépasse 35° (Rouanet, 1984) C. Cependant un minimum de 10° C est requis pour sa germination ; quand le sol est mal humidifié, les hautes températures deviennent défavorables.
La température a une influence non négligeable sur la durée du cycle végétatif (Rouanet, 1984). Le mais est très sensible aux variations de la fertilité du sol. Il répond bien aux apports d’engrais, notamment d’azote. Il affectionne particulièrement les sols riches en matière organique, sains, profonds et doués de bonnes propriétés physiques. Il est tolérant à l’acidité (sols de pH 5,5 à 7). La culture du maïs nécessite une pluviométrie supérieure à 700 ou 800 mm ; ces quantités dépendent toutefois du climat (hygrométrie) et de la durée du cycle de culture (Poda, 1979).

Importance de la culture du maïs

Le maïs est la culture alimentaire de base la plus largement pratiquée en Afrique subsaharienne. Elle occupe plus de 33 millions ha chaque année (FAOSTAT, 2012). La culture couvre presque 17 % des quelques 200 millions ha de terres cultivées en Afrique subsaharienne.
Elle est pratiquée dans divers environnements de production et est consommée par des personnes avec des préférences alimentaires et des contextes socio-économiques divers. On estime que plus de 300 millions de personnes en Afrique sub-saharienne dépendent du maïs comme source d’alimentation et de subsistance. Les zones consacrées à la production de maïs et de céréales ont augmenté de manière considérable dans les régions d’Afrique subsaharienne depuis 1961 (FAOSTAT, 2012). Des 22 pays au monde où le maïs compose le pourcentage le plus élevé d’apport calorique dans le régime alimentaire national, 16 sont en Afrique (Nuss, et al., 2011). Le maïs compose presque la moitié des apports en calories et en protéines en Afrique orientale et australe, et un cinquième en Afrique occidentale.
Le maïs, comme toutes les céréales, a une importance socio-économique considérable.
Il représente dans les pays en développement une ressource pour l’alimentation humaine. En raison de sa large utilisation dans le monde, beaucoup d’effort sont consentis par les instituts et organismes de recherches dans le domaine de la création et de l’adaptabilité des variétés de maïs aux conditions agro-pédologique des régions du Togo à des fins diverses.
Au Togo, la culture du maïs occupe une part importante aussi bien dans l’agriculture que dans l’économie. Il est cultivé partout, et offre près de 50% des emplois liés à l’agriculture. Cette culture mobilise plus de producteurs dans la région Maritime et la région des Plateaux. Cet engouement des producteurs dans la culture du maïs, s’explique non seulement par le fait que sa culture est peu exigeante en conditions pédoclimatiques (Douya, 1989; Adejetey, 2001) mais aussi et surtout par son importance dans l’alimentation des populations  togolaises. Une enquête sur la consommation avait révélé que le maïs constitue le premier poste de dépense alimentaire des ménages (FAO/SMIAR, 2004). Le maïs se positionne comme la principale culture céréalière de base au Togo devant le sorgho, le riz et le mil. Jadis cultivé essentiellement dans les régions des Plateaux et Maritime, la culture du maïs s’est progressivement répandue sur toute l’étendue du territoire Togolais.
La production de maïs au Togo n’a cessé d’évolué depuis les années 1960. En effet elle était de 650 831 tonnes sur une superficie de 522630 ha en 2011 contre 638 129 tonnes sur une superficie de 534 573 ha en 2010 (DSID, 2011). Le maïs s’affiche comme la céréale dominante entre 2001 et 2011 avec un poids moyen de 63%. Cette tendance confirme l’engouement porté à cette spéculation qui se positionne désormais comme une culture de rente.
Dans les deux régions au Sud du Togo, la production, la commercialisation du maïs grain et de ses dérivés constituent les activités principales d’une portion considérable de la population. La culture de maïs occupe une grande partie des terres cultivées et sa production est destinée à l’alimentation de ses populations rurales et urbaines sans cesse croissante. La filière engendrée par la culture génère de multiples emplois et revenus notamment aux femmes (SOTED, 1997).

Conservation moderne

Dans la conservation moderne conseillée pour les variétés améliorées, le maïs est conservé en grains. Cette conservation suit l’itinéraire suivant : déspather le maïs récolté, bien le sécher, l’égrener, mélanger 100kg de mais avec 1 sachet de sofagrain (phosphure d’aluminium) ou d’actellic super (poudre insecticide pyréthrinoïdes particulièrement efficace pour le contrôle des charançons du Grain et du grand capucin) et mettre le maïs ainsi traité en sac de juste par 100 kg. La durée de la conservation moderne dépend de la période de rémanence des produits de traitements (sofagrain et actellic super qui est 3 mois).
La conservation moderne n’est effectuée que par 12,2% (Kluvi, 2006) des producteurs qui ont adopté les variétés améliorées. Elle n’est donc pas encore courante en raison, selon les  producteurs, du manque de moyens financiers pour l’achat des produits de conservation (Kluvi, 2006).

METHODOLOGIE

ÉCHANTILLONNAGE

Afin d’obtenir une représentativité de notre échantillonnage nous avons effectué un sondage aléatoire élémentaire. Nous sommes allés dans chacune des chefs-lieux des préfectures que comportent les deux régions puis nous avons ciblé les jours de marché des grandes villes qui accueillent les revendeuses des villages environnants. Nous avons procédé ensuite à des échantillonnages de 750 g à 1 kg de maïs chez plusieurs revendeuses. Dans chaque région un total de 25 échantillons a été prélevé. Chaque échantillon a été mis dans un sachet en papier. Sur ce dernier est collé un code indiquant les coordonnées de l’échantillon. Avant chaque échantillonnage les revendeuses ont été questionnées quant aux différentes méthodes utilisées pour la conservation de la céréale sur plusieurs mois après la récolte.

Protocole d’analyse de l’aflatoxine avec le VICAM

Le VICAM est un système de test destiné à la détermination de la quantité de différentes mycotoxines présentes dans les produits alimentaires. Le VICAM Série 4-EX Fluorometer
est un appareil de mesure quantitative pouvant détecter jusqu’à des concentrations extrêmement faibles (0,1 ppb) de mycotoxines présentes dans des échantillons préparés en utilisant des colonnes d’immuno-affinité VICAM. L’appareil présente une capacité de stockage de données élargies qui permet de stocker tous les protocoles de tests de mycotoxines.
Le principe de détermination de la teneur en aflatoxine est basé sur leur extraction dans les aliments par des solvants organiques adéquat (méthanol), leur filtration, leur purification avec une colonne d’immuno-affinité et la lecture avec le VICAM.

Extraction

Chaque échantillon de maïs est pesé (500g) et broyé avec un Blender (figure 5A) ; 50g de la poudre obtenue est additionnée à 5g de sel industriel (NaCl) (figure 5B) pour faciliter la filtration. L’ensemble est mis dans un erlenmeyer et complété avec 100 mL de méthanol 80% (figure 5C) qui est obtenu en mélangeant 200 mL d’eau distillée et 800 mL de méthanol 100%. C’est à cette concentration du méthanol (80%), que le mélange est filtré convenablement.
L’erlenmeyer est fermé à l’aide d’un parafilm pour empêcher l’évaporation de l’alcool lors de l’agitation. Ensuite les erlenmeyers sont placés durant 30 minutes sur un agitateur (figure 5D) à 250 tours/minute pour l’obtention d’un mélange homogène et la libération des molécules d’aflatoxine contenues dans le maïs.

Purification

Après la filtration la purification a été effectuée par passage dans une colonne d’immunoaffinité. La séparation de l’aflatoxine du filtrat repose sur la réaction antigèneanticorps pour la purification sélective des mycotoxines à partir d’extraits alimentaires. Le principe est que l’analyte présent dans l’échantillon est retenu par un anticorps spécifique fixé sur la phase stationnaire de la colonne. Les composés interférents non reconnus par l’anticorps, ne sont pas retenus. La purification consiste à verser 2ml de la solution (2iéme filtrat) dans une seringue reliée à une colonne de test VICAM (aflatest). Ces colonnes permettent la fixation des molécules d’aflatoxines grâce aux anticorps situés sur la phase stationnaire et la libération des impuretés. Le système est rincé avec 5ml d’eau distillée. La libération de l’analyte lors de la phase d’élution passe par la rupture des liaisons avec l’anticorps. Après la phase de fixation 1ml de méthanol 100% est rajouté dans la seringue pour l’élution.
L’aflatoxine est très soluble dans les solvants polaires et le méthanol sert à casser les liaisons établies entre les molécules d’aflatoxines et l’anticorps (figures 7,8). L’éluat est recueilli dans un micro tube.

Discussion

Notre étude, ayant pour objectif principal le dosage de la teneur en aflatoxine fournit l’une des premières documentations sur la contamination du maïs par l’aflatoxine au Togo. À côté de cet objectif premier, elle nous a aussi permis d’aller sur le terrain et de voir les conditions dans lesquelles est stocké et vendu le maïs consommé par des millions de togolais. Notre étude nous a enfin permis d’évaluer la position du Togo par rapport aux normes internationales.
La méthode VICAM utilisée dans cette étude pour le dosage des aflatoxines est une méthode validée qui permet la détection jusqu’à 0,1 ppb d’aflatoxine totale, valeur en en deçà des taux autorisés dans le maïs. La disponibilité, la facilité d’utilisation et la rapidité d’obtention des résultats font d’elle une méthode de choix en analyse de routine. Notre étude est un travail préliminaire qui s’est fixé comme objectif la détermination des taux d’aflatoxines totales contenues dans les matrices, et les résultats obtenus avec le VICAM sont satisfaisants. Pour la détermination des types d’aflatoxines une autre méthode telle que la chromatographie liquide haute performante (CLHP) serait plus adaptée.
Les observations sur le terrain nous ont permis de faire cas des mauvaises conditions de stockage de la céréale. En effet les sacs de maïs sont souvent stockés a l’air libre couvert par une bâche à la tombée de la nuit, ou dans des magasins où il fait excessivement chaud parce que n’ayant aucune aération. Toutes les femmes enquêtées ont révélé n’utiliser aucun produit pour conserver la céréale, pour lutter contre une quelconque infestation des moisissures ou pour lutter contre les insectes. L’absence de moyen de prévention rend la céréale encore plus vulnérable et plus exposée à toute contamination aspergilliaire. Ces mauvaises conditions de stockage relevé sur le terrain sont de probables sources de prolifération du contaminant.
Les résultats du dosage ont montré une grande variabilité des teneurs en aflatoxine allant d’un minimum de 0,17 ppb à un maximum de 1600 ppb. Les teneurs obtenues étaient très élevées pour beaucoup d’échantillons et certains même dépassaient nos attentes en particulier l’échantillon 25 de la région des Plateaux avec un pic de contamination de 1600 ppb. Les échantillons provenant de la région des Plateaux présentent de plus grandes contaminations avec une médiane de 25 ppb contre une médiane de 9,2 ppb dans la région Maritime. Ce qui n’est pas surprenant vu que le maïs présente de loin les niveaux les plus élevés signalés d’aflaDOSAGE toxine en comparaison au riz qui présente de moindres niveaux de contamination (Blake, et al., 2018).
Ces résultats ne sont pas conforment à ceux de Diedhiou et al. (2010) au cours de son étude sur la colonisation d’Aspergillus et la contamination des grains de maïs par l’aflatoxine dans deux zones agro-écologiques du Sénégal à savoir le bassin arachidier et la zone Sénégal oriental-Casamance. Durant l’étude ils avaient analysés 25 échantillons de maïs. Les teneurs en aflatoxine des échantillons venant de la zone Sénégal oriental-Casamance variaient entre 0 et 1,7 ppb. Les échantillons venant du bassin arachidier avaient des teneurs un peu plus élevé avec une moyenne de 15,9 ppb. Ces valeurs inferieurs aux nôtres s’expliquent par le climat sahélien, peu humide qui règne au Sénégal et qui serait un frein au développement aspergilliaire.
L’origine de ces teneurs élevées pourrait être multiple. Elle pourrait s’expliquer par :
 des semences contaminées par aspergillus flavus et aspergillus parasiticus
 le climat humide et chaud,
 des sols contaminés avant la culture,
 de mauvaises conditions de stockage et/ou d’entreposage entraînant la prolifération des moisissures faisant suite à une biosynthèse de l’aflatoxine.
Les teneurs très élevées obtenues nous permettent de déduire rapidement du grand danger sanitaire auquel est exposée la population togolaise compte tenu des risques que constituent l’ingestion répétée de produits très contaminé. En effet plusieurs études ont démontré la cancérogénécité, et tous les autres dommages causé par l’ingestion ou l’inhalation de molécules d’aflatoxine (Qian, et al., 1994; Wang, et al., 2001; Sabourin, et al., 2006; Kew, 2013; Manda, et al., 2018). À cela s’ajoute la stabilité de la toxine jusqu’à des températures avoisinant les 300°C, températures qui ne sont pas atteintes avec nos modes de cuisson (Pfohl-Leszkowicz, 1999).
Les premières victimes sont les enfants parce que ces derniers consomment très tôt le maïs. En effet au Togo les repas post-sevrages sont essentiellement constitués de bouillies à base de farine de maïs. Ce qui confirme les résultats de S. Egal, et al (2005) qui ont montré que l’exposition d’enfants (9 mois-5 ans) à l’aflatoxine au Togo était liée à une forte consommation de maïs. Cette exposition peut être cause de retard de croissance et kwashiorkor (Lamplugh, 1982.; De Vries, 1990; Tchana, 2010).

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
I. GENERALITES SUR L’AFLATOXINE
I.1. Structure et propriétés physico-chimiques
I.1.1. Structure
I.1.2. Propriétés physico-chimiques
I.2. Ecotoxicogenèse
I.3. Toxicocinétique
I.3.1. Absorption
I.3.2. Distribution
I.3.3. Métabolisme
I.4. Mécanisme d’action
I.4.1. Formation d’adduits à l’ADN
I.4.2. Métabolisme des protéines
I.5. Toxicité
I.5.1. Toxicité aiguë
I.5.2. Toxicité chronique
I.6. Effet de l’aflatoxine chez l’homme
I.6.1. Cancer du foie
I.6.2. Cancer des voies respiratoires
I.6.3. Kwashiorkor
I.6.4. Le retard de croissance
I.7. Réglementation
II. GENERALITES SUR LE MAIS
II.1. Exigences écologiques
II.2. Importance de la culture du maïs
II.3. Méthodes de conservation
II.3.1. Conservation traditionnelle
II.3.2. Conservation moderne
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. OBJECTIF
II. CADRE DE L’ETUDE
III. METHODOLOGIE
III.1. ÉCHANTILLONNAGE
III.2. Matériels
III.2.1. Matériels biologique
III.2.2. Matériels de laboratoire
III.3. Méthodes
III.3. 1.Protocole d’analyse de l’aflatoxine avec le VICAM
III.3.2. Extraction
III.3.3. Filtration
III.3.4. Purification
III.3.5. Détection et quantification
III.4. Analyse des données
IV. RESULTATS ET DISCUSSION
IV.1. Résultats
IV.2. Discussion
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE

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