Facteurs influençant la morbidité et la mortalité imputables aux IRA

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HAEMOPHILUS INFLUENZAE 

Diagnostic direct

Prélèvement

Il peut s’agir de sécrétions trachéobronchiques, du liquide pleural ou d’une hémoculture.
Faire un prélèvement pulmonaire protégé afin d’éviter toute contamination par la flore commensale du pharynx.

Culture

L’isolement d’Haemophilus influenzae se fait sur des milieux enrichis en sang.
Le germe présente des exigences en facteurs X et V qui sont tous les deux apportés par le sang cuit.
Il pousse sur gélose au sang cuit à la température de 35-37°C.

Identification

Ù Caractères morphologiques
Dans un produit pathologique ou dans une culture, Haemophilus influenzae apparaît sous forme de bacille gram négatif, immobile, non sporulé, de petite taille, souvent coccobacillaire.
Ù Caractères culturaux
♣ Exigence en facteur de croissance
Les globules rouges apportent les deux facteurs de croissance indispensables que sont le facteur X (Hémine) et le facteur V (NAD). Cette double exigence permet de le différencier des autres espèces notamment Haemophilus parainfluenzae qui ne nécessite que du NAD.
♣ Milieux de culture
Divers milieux sont utilisés pour la culture du germe.
-GSO : les sangs de cheval, de lapin et de cobaye donne de bons résultats -Gélose chocolat
-Milieux sélectifs : La recherche d’Haemophilus influenzae dans les produits pathologiques polymicrobiens provenant du tractus respiratoire demande des milieux sélectifs.
♣ Conditions de culture
L’incubation doit être à une température optimale de 35-37°C et la croissance est habituellement meilleure en atmosphère ordinaire qu’en anaérobiose.
Ù Caractères biochimiques
Haemophilus influenzae possède une oxydase, une nitrate réductase, une uréase et produit de l’indole.
En effet, huit biotypes ont été définis pour l’espèce, à partir des caractères métaboliques suivants : production d’indole, activités enzymatiques (urease et Ornithine Décarboxylase).

MYCOPLASMA PNEUMONIAE 

Diagnostic direct

Prélèvement

Ils doivent être riches en cellules auxquelles adhère M. pneumoniae. Les prélèvements de gorge, les aspirations nasopharyngées postérieures chez l’enfant, le liquide pleural ainsi que les prélèvements obtenus par les méthodes endoscopiques : Brossage bronchique, secrétions trachéales, liquide de lavage broncho alvéolaire, sont adaptés. Par contre les expectorations sont peu utilisées. Ils sont conservés à +4° C pendant 48h et à -70°C pour une longue période.

Culture

La culture de Mycoplasma pneumoniae est décevante et peu utilisée. Elle se fait sur milieu diphasique ou simultanément en bouillon et sur milieu gélosé.

Identification

Ù Caractères morphologiques
Mycoplasma pneumoniae, du fait de l’absence de paroi, est doué d’une grande plasticité, il n’est pas colorable au gram et n’est pas visible au microscope photonique. La morphologie peut être par contre appréciée à l’examen par contraste de phase ou mieux au microscope électronique où l’on note la présence d’une structure terminale à extrémité effilée : le « tip » qui permet l’adhésion aux différents supports (cellules cibles, verre).
Ù Caractères culturaux
Bien qu’ayant cultivé sur milieu embryonné, M.pneumoniae cultive sur milieu acellulaire. Les milieux de culture requis contiennent des extraits de levures, du sérum qui supplée à l’exigence en stérols, caractère de l’ordre. Ces milieux peuvent être rendus sélectifs par addition d’une bêta-lactamine et/ou d’une polymyxine.
Du fait de la lenteur de la culture, on privilégie les milieux diphasiques mais la culture sur milieu gélose en parallèle avec une culture en milieu liquide contenant soit du glucose, soit de l’arginine et un indicateur coloré, donne également de bons résultats. Le pH requis pour ces milieux est de l’ordre de 7,3-7,8 ; l’incubation se fait à 37°C en atmosphère microaéorophile (95% N2, 5% CO2) ou sous 5% CO2.
La culture est longue, en 3-21jours, M.pneumoniae donne sur milieu gélose en observation la loupe ou au microscope en contraste de phase, des colonies incrustées dans la gélose, en cratère ou en œuf sur le plat.
Ù Caractères biochimiques
Mycoplasma pneumoniae fermente le glucose, n’hydrolyse pas l’arginine ; Il réduit en aérobiose le chlorure de triphenyltétrazolium. Le germe possède des propriétés d’hémolyse et d’hémadsorption vis-à-vis des globules rouges de cobaye.
d- Sensibilité aux antibiotiques (57)
La sensibilité aux antibiotiques de M. pneumoniae est exceptionnellement recherchée. De très rares cas de résistances ont été décrits. Les mycoplasmes ont des caractéristiques naturelles expliquant leur résistance intrinsèque à certaines familles d’antibiotiques (bêta-lactamines, rifampicine, polymyxine).

Autres méthodes de diagnostic direct

Ù Recherche d’antigènes
Parmi les antigènes, l’adhésine P1 est le plus souvent détectée. Plusieurs méthodes sont disponibles : Immunofixation sur nitrocellulose, EIA par fixation directe de l’antigène ou par immunocapture. Elles utilisent des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, mais sont peu sensibles.
Ù Détection des acides nucléiques Ce sont des techniques d’actualités rapides :
♣ Technique d’hybridation moléculaire par utilisation de sondes moléculaires
♣ PCR

Diagnostic indirect

La détection des anticorps anti-mycoplasmes dans les secrétions oropharyngèes est possible.
La sérologie est la méthode diagnostique la plus couramment pratiquée. On recense différents techniques : RFC, Immunocapture ELISA, IFI, Agglutination passive de particules sensibilisées (hématies, gélatine, latex).

CHLAMYDIA PNEUMONIAE 

Diagnostic direct

Prélèvement

Ils doivent ramener le maximum de cellules. Ce sont des écouvillonnages pharyngés ; chez l’enfant, ce sont les prélèvements nasopharyngés postérieurs. Brossage protégé distal, LBA donnent les meilleurs résultats.
Les expectorations sont peu recommandées. Les prélèvements sont conservés à +4°C 1 à 4h avant d’être congelés à -70°C si l’analyse est différée.
Un milieu de transport est requis pour la culture cellulaire. Les milieux 2SP (sucrose diphosphate) additionné de 5% de sérum de veau fœtal (SVF) et SPG (sucrose phosphate glutamate) sont les plus utilisés.

Matériel de laboratoire

• Bec bunsen
• Réfrigérateur
• Congélateur à –20 et à –80°C
• Microscope optique et à fluorescence
• Microscope à contraste de phase
• Vortex
• Autoclave
• Balance de précision
• Hotte à flux laminaire
• Lames porte-objet
• Lame couvre-objet
• Lame IF à 2 puits
• Anse de platine
• Micropipettes
• Embouts stériles
• Tubes nunc
• Filtres de 0,2µm
• Seringues à usage unique
• Flacon 500ml
• Tubes à hémolyse
• Boite de pétri de 90mm
• Masque
• Gants
• Tubes coniques stériles de 50mm
• Centrifugeuse
• Flacon de culture

Matériel de prélèvement

• Ecouvillons stériles
•Tubes à hémolyse
•Seringues
•Eau physiologique
•Glacière
•Réfrigérant

Réactifs de coloration des lames

♦Colorants pour le Gram
– Violet de gentiane
– Lugol
– Füschine de Ziehl
♦ Réactifs pour la coloration de May Grunwald Giemsa
– Flacon 1 : fixateur RAL
• Flacon 2 : fixateur Eosine
• Flacon 3 : bleu RAL

Matériel d’isolement

•Anse de platine
•Boîtes de pétri
•Bec bunsen
•Gélose Müller-Hinton (MH)
•Gélose trypticase soja
•Sang de moutons
•Sang de cheval
•Gentamicine
•Bacitracine
•Polyvitex
•Jarre d’incubation
•Générateur de CO2 où bougie
•Etuve à 37° C
•Autoclave

Démarche diagnostique

Prélèvement

Conditions de réalisation des prélèvements

La qualité du prélèvement a conditionné la suite de l’analyse et la valeur des résultats. C’est ainsi que le respect des règles d’asepsie et de stérilité devait être de vigueur. Dans cette étude, les prélèvements qui ont été réalisés sont :
-Expectoration
-Lavage broncho-alvéolaire
-Aspiration bronchique
-Ecouvillonnage

Expectorations

L’expectoration consiste en un examen direct immédiat du crachat pour le comptage des cellules et la recherche de micro-organismes après coloration de gram.
Les prélèvements ont été réalisés le matin à jeûn en dehors de toute antibiothérapie.
La bouche peut être lavée à l’eau stérile pour éviter toute contamination et le malade doit être sensibilisé à un effort de toux de façon à ce qu’il ramène les secrétions du poumon profond.

Lavage broncho-alvéolaire

C’est une méthode qui permet le recueil des cellules libres adhérentes aux parois des espaces aériennes périphériques, des agents infectieux et des particules minérales présentes dans les lumières alvéolaires ainsi que les milieux biologiques qui tapissent le tractus respiratoire. C’est un acte médical réalisé par un médecin.

Aspiration bronchique

C’est un prélèvement qui consiste à aspirer les sécrétions à l’aide d’une sonde. C’est un acte médical strict qui permet d’éviter la contamination salivaire et augmente la densité des germes.

Ecouvillonnage

Il a été utilisé dans les prélèvements de la gorge, du rhinopharynx, dans les otorrhées et les prélèvements nasaux.(26)
✽ Prélèvement dans la gorge et le rhinopharynx
Il a été réalisé avant toute antibiothérapie locale ou générale. Il s’agissait de l’écouvillonnage des amygdales et leur pourtour en général.
En l’absence des amygdales, l’écouvillonnage se fait au niveau de la paroi postérieure du pharynx.
✽ Dans les otorrhées
Elles sont recueillies après nettoyage du conduit auditif externe par un antiseptique.

Transport et conservation des prélèvements

✽Ils doivent être transportés dans une glacière, à moins de 2 heures et à -4°C, acheminés rapidement au laboratoire et pris en charge. En effet, la flore commensale d’accompagnement se multiplie rapidement, ce qui peut fausser les résultats. De plus, certains agents infectieux comme les pneumocoques sont extrêmement fragiles.
Leur conservation se fait en bouillon dans des cryotubes à -70° C, en vue d’un éventuel ré-isolement des souches en cas de résultats douteux.
La température ambiante du laboratoire suffit pour la décongélation.
✽Les LBA, expectorations, AB sont conservés à 4°C au réfrigérateur.
Au delà, ils seront conservés à -80°C.

Traitement des prélèvements

♦Cas des expectorations
-Laver l’expectoration avec de l’eau physiologique stérile -Retirer complètement l’eau de lavage
-Ajouter un volume égal de N-acetylcysteine 1 % (MUCOMYST) ou utiliser un volume égal de digesteur EUROBIOR (ce qui correspond à une dilution au ½)
-Vortexer 2mn et laisser reposer 10 à 15mn
-Faire une dilution au 1/500 avec de l’eau physiologique stérile (à l’aide d’une anse calibrée, prélever 10μl d’homogéneisat et diluer dans 5ml d’eau),
-Homogéneiser.
Remarque: Réaliser le frottis destiné à la coloration au May Grunwald Giemsa avant d’ajouter le N-actylcysteine car ce dernier digère les cellules.
♦Cas des expectoration dans la recherche des legionelles Décontaminer par un mélange KCl/HCl, pH 2,2
♦Cas des aspirations bonchiques
Si elles sont trop diluées, réaliser une centrifugation à 6000 tours/ mn pendant 10mn.

Examen macroscopique

Cet examen a consisté à l’appréciation de l’aspect des prélèvements.
✽Expectorations purulentes et mucopurulentes: appopriées aux investigations bactériologiques.
✽Expectorations spumeuses: impropres à l’analyse bactériologique et ont été rejetées ✽Secrétions rhinopharyngées :purulentes ou claires ✽Exsudat de la gorge:aspect blanchâtre ou non
✽Sinus: purulent
✽LBA: sanglant, laiteux, opalescent, clair , rose ou mucopurulent Les caractéres cités seront retenus pour la suite du travail.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. Epidémiologie des infections respiratoires aigues
I-1. Affections des voies respiratoires supérieures
I-1-1. Les Otites moyennes aigues
I-1-2. Les Rhinopharyngites
I-1-3. Les Sinusites
I-1-4. Les Angines aigues
I-2. Affections des voies respiratoires inférieures
I-2-1. Les Bronchites
I-2-2. Les Bronchiolites
I-2-3. Les Pneumonies
I-3. Morbidité et mortalité dues aux IRA
I-4. Facteurs influençant la morbidité et la mortalité imputables aux IRA
I-5. Transmission
II. Diagnostic biologique
II-1. Les bactéries des IRA
II-1-1. Streptococcus pneumoniae
II-1-1-1. Diagnostic direct
II-1-2. Haemophilus influenzae
II-1-2-1. diagnostic direct
II-1-3.Legionella pneumophila
II-1-3-1. Diagnostic direct
II-1-3-2. Diagnostic indirect
II-1-4. Mycoplasma pneumoniae
II-1-4-1. Diagnostic direct
II-1-4-2. Autres méthodes de diagnostic direct
II-1-4-3. Diagnostic indirect
II-1-5. Chlamydia pneumoniae
II-1-5-1. Diagnostic direct
II-1-5-2. Autres méthodes de diagnostic direct
II-1-5-3. Diagnostic indirect
II-1-6. Moraxella catarrhalis
II-1-6-1. Diagnostic direct
II-2. Les Virus des infections respiratoires
DEUXIEME PARTIE : MATERILS ET METHODES
I. Cadre et population d’étude
I-1. Cadre d’étude
I-2. Population d’étude
I-3. Souches bactériennes
I-3-1. Les souches de référence
I-3-2. Les souches à tester
II. Matériels et Méthodes
II-1. Matériels et réactifs
II-2. Méthodologie
II-2-1. Les souches étudiées
II-2-2. Les algorithmes d’identification
II-3. Démarche diagnostique
II-3-1. Les prélèvements
II-3-1-1. Conditions de réalisations
a. Les expectorations
b. Le Lavage Broncho-alveolaire
c. L’Aspiration bronchique
d. L’Ecouvillonnage
II-3-1-2. Transport et conservation des prélèvements
II-3-1-3. Traitement des prélèvements
II-3-2. Examen macroscopique
II-3-3. Examen microscopique après coloration de gram
II-3-4. La culture
II-3-4-1. Test préalable de stérilité et d’efficacité
II-3-4-2. Ensemencement
II-3-5. Identification des souches bactériennes
II-3-5-1. Streptococcus pneumoniae
II-3-5-2. Haemophilus influenzae
II-3-5-3. Moraxella catarrhalis
II-3-5-4. L.pneumophila
II-3-5-5. Mycoplasma pneumoniae
II-3-5-6. Chlamydia pneumoniae
II-4. Mise au point des algorithmes
II-5. Validation des algorithmes
TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET COMMENTAIRES
III. Résultats
III-1Population d’étude
III-2. Souches bactériennes isolées
III-3. Résultats de la validation de l’identification des souches
III-3-1. Diagnostic de Streptococcus pneumoniae
III-3-2. Diagnostic d’ Haemophilus influenzae
III-4. Résultats de la validation de la démarche
III-4-1. Expression des résultats
IV. Discussion
IV-1. Démarche
IV-1-1. Prélèvements
IV-1-2. Examen microscopique direct
IV-1-3. Méthodes d’isolement et milieux de culture
IV-1-4. Identification des germes isolés
IV-2. Analyse des résultats
CONCLUSION
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES

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