Fabrication des dispositifs pour la détection couplée du mécanisme d’exocytose

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Propriétés des ultramicroélectrodes

La diminution de la taille de l’électrode est donc un atout analytique évident. Nous allons montrer qu’elle s’accompagne, à l’échelle micrométrique, d’un changement de régime de diffusion.

Régime de diffusion d’une UME

Comme nous l’avons vu précédemment, dans le cas d’une électrode millimétrique, l’épaisseur de la couche de diffusion (μm) est très faible devant la taille de l’électrode (r0 ≈ mm). La diffusion est donc linéaire semi-infinie. Dans le cas des ultramicroélectrodes, l’épaisseur micrométrique de la couche de diffusion et la taille de l’électrode sont du même ordre de grandeur. Les effets de bords ne peuvent plus être négligés. La diffusion devient alors sphérique et convergente (Figure A-3). Les mêmes conclusions peuvent être retrouvées mathématiquement en considérant le cas d’une UME sphérique de rayon r0, et une espèce R oxydée à sa surface. En effet, nous avons vu qu’en régime de diffusion pur : i = nFADRCR r0 x 1 + r0√ DRt Equation A-7.

Effets sur la constante de temps, la chute ohmique et le rapport signal sur bruit

Comme déjà mentionné plus haut, trois grandeurs se relèvent déterminantes pour les analyses électrochimiques.
La résistance Rs de la solution correspond au volume de solution limitée par les surfaces des électrodes de travail et de référence. Lorsqu’un courant faradique et/ou capacitif traverse la cellule, elle est responsable du phénomène de chute ohmique. Dans l’expression de la chute ohmique (Equation I-10), IC et IF sont les composantes capacitive et faradique du courant. Chute ohmique = (iC + iF) x Rs Equation A-10.
La capacité de la double couche électrochimique Cd est aussi à l’origine du bruit électrique, proportionnel à Cd, et constitue un filtre de constante de temps  qui limite la vitesse des variations de potentiel de l’électrode.  = Rs x Cd Equation A-11.
Le rapport signal sur bruit S/N est proportionnel au rapport du courant faradique sur le courant capacitif. S/N = iFiC Equation A-12.
Nous allons détailler comment le passage d’une électrode millimétrique à une ultramicroélectrode modifie ces trois composantes.

Cas d’une ultramicroélectrode sphérique

Lors de l’utilisation d’une ultramicroélectrode sphérique, la taille de la contre-électrode reste supérieure à celle de l’électrode de travail. Les lignes de courants entre les deux électrodes sont donc toujours contenues dans un volume conique.
On a donc toujours une résistance inversement proportionnelle au rayon r0 de l’électrode ( Rs = 4 r0 ). De plus, la capacité de la double couche reste proportionnelle à la surface de l’électrode. Ainsi, la constante de temps  de la cellule électrochimique est toujours proportionnelle au rayon de l’électrode et diminue avec la taille de l’électrode. Ces UME permettent donc la détection de changements rapides de concentration. Plus l’électrode est petite, plus des signaux rapides peuvent lui être appliqués.6 Les UME sont donc des outils de choix pour étudier en temps réel8 des phénomènes rapides jusqu’à des gammes de temps de l’ordre de la nanoseconde.9 A cet égard, leurs performances dans le cadre de la voltammétrie à haute vitesse de balayage (supérieure à 1 MV.s-1) sont remarquables. Le second avantage des UME est donc leur excellente résolution temporelle (de l’ordre de la milliseconde ou inférieure).
En régime stationnaire, l’expression du courant pour une UME sphérique (A = 4 r02) est : istat = nFADRCR r0 = 4 nFDRCR x r0 Equation A-13.
D’après cette équation istat est proportionnel à r0. Le rapport signal sur bruit, proportionnel au rapport du courant faradique sur la capacité de l’interface, varie donc de façon inversement proportionnelle au rayon de l’électrode, contrairement au cas d’une électrode millimétrique. Les ultramicroélectrodes permettent alors la détection de très faibles courants (jusqu’à 100 fA)7 avec un rapport signal sur bruit supérieur à celui obtenu avec des électrodes millimétriques dans les mêmes conditions.6 Enfin, les courants détectés étant très faibles, la chute ohmique devient minimale et indépendante des dimensions de l’électrode.6
Enfin, un autre avantage de l’utilisation des ultramicroélectrodes est la simplification du montage expérimental. Nous avons vu que la présence de la chute ohmique nécessite l’utilisation d’une contre-électrode afin de faire circuler le courant entre l’électrode de travail et cette dernière. Dans le cas des ultramicroélectrodes, les courant étudiés sont très faibles (de l’ordre du pA) et la chute ohmique, très limitée. Les UME permettent donc de travailler dans des milieux très résistifs sans perte de sensibilité ou dans les milieux usuels sans utiliser de contre-électrode.7
Les caractéristiques fondamentales des ultramicroélectrodes ont été présentées dans le paragraphe précédent à partir de la géométrie sphérique (cas mathématique le plus simple). Le travail de cette thèse a été réalisé à partir d’UME de type disque et bande. Nous allons donc montrer que les avantages mis en avant précédemment lors de l’utilisation d’électrodes sphériques sont également valables pour ces deux géométries.

Cas d’une ultramicroélectrode de type disque

Pour une électrode de type disque de rayon r0, la résolution de la seconde loi de Fick montre également qu’il est possible d’obtenir deux régimes de diffusion différents, à savoir linéaire puis sphérique. Pour t r02DR l’expression du courant stationnaire est la suivante (pour un disque de rayon r0) : istat = 4nFDRCR x r0 Equation A-14.
Le courant est donc proportionnel au rayon r0 de l’électrode. De plus, la résistance de la solution varie de façon inversement proportionnelle au rayon r0 de l’électrode et la capacité de la double couche est proportionnelle à l’aire de l’électrode (r0²). Ainsi, la constante de temps est proportionnelle au rayon de l’électrode, le rapport signal sur bruit est inversement proportionnel au rayon de l’électrode et la chute ohmique est minimale et indépendante de la taille de l’électrode. Ainsi, plus la taille de l’électrode diminue, plus la constante de temps est faible et plus le rapport signal sur bruit est élevé.

Détection de biomolécules électroactives libérées par une cellule unique : configuration synapse « semi-artificielle »

Les phénomènes biologiques étudiés et présentés dans cette thèse sont relatifs à la libération (exocytose vésiculaire) ou à la production (stress oxydant cellulaire) de molécules d’intérêt biologique par une cellule, vers le milieu extracellulaire. Quel que soit le mécanisme impliqué, les quantités de molécules libérées sont faibles, de l’ordre de la femtomole voire de l’attomole. Le but étant de détecter ces molécules au niveau de la cellule unique, il est nécessaire que le capteur utilisé, une UME, ait une taille adaptée et soit positionné de façon à collecter un maximum de l’information chimique libérée avec une résolution de quelques attomoles et ce, sans altérer la cinétique de libération. En d’autres termes, la distance électrode/cellule doit être la plus faible possible. En conséquence, les quantités de matière émises, bien que faibles, le seront dans un volume qui l’est tout autant, générant alors des concentrations suffisantes pour être détectées. La configuration utilisée pour ces mesures s’inspire d’un exemple de la Nature : la synapse chimique.

Synapse chimique

Pour maintenir leur fonctionnement, les organismes ont recours à la communication cellulaire assurée par deux grands systèmes : le système hormonal et le système nerveux. Lors de la transmission hormonale, les glandes endocrines libèrent des hormones dans le sang. Elles sont alors transportées et agissent sur des organes cibles à distance. Lors de la transmission nerveuse, la libération de molécules messagers, les neurotransmetteurs, est localisée au niveau des synapses.
Les synapses électriques sont constituées d’un élément émetteur et d’un élément récepteur en contact. L’information de nature électrique est alors transmise de manière continue et réciproque. Ce type de synapses constitue un mode de communication minoritaire par rapport aux synapses chimiques. La synapse chimique est également constituée d’un élément émetteur (la terminaison pré-synaptique) et d’un élément récepteur (la terminaison post-synaptique), mais les deux extrémités de ces éléments sont séparées de quelques dizaines de nanomètres. Cet espace est appelé fente synaptique (Figure A-4). Le transfert d’information peut avoir lieu entre deux neurones ou un neurone et une cellule réceptrice ou émettrice.
Un neurone est constitué d’un corps cellulaire et de deux types de prolongement : les axones et les dendrites. Au niveau de sa terminaison, l’axone contient des vésicules synaptiques (petits organites entourés d’une membrane), remplies de neurotransmetteurs.
Un potentiel d’action est d’abord généré par le neurone à la base de son corps cellulaire. Ce potentiel d’action se propage le long de l’axone du neurone émetteur. Une fois arrivé à la terminaison pré-synaptique, le signal électrique est converti en signal chimique : l’arrivée du potentiel d’action entraîne l’entrée d’ions calcium à l’intérieur du neurone. Cette augmentation de la concentration en calcium est alors responsable de la fusion de vésicules synaptiques avec la membrane de la terminaison pré-synaptique. Les neurotransmetteurs sont alors libérés dans la fente synaptique et se fixent aux récepteurs situés sur la dendrite du neurone post-synaptique. Une variation du potentiel local de la dendrite du neurone post-synaptique apparaît et entraîne la stimulation du corps cellulaire de ce neurone créant ainsi un nouveau potentiel d’action. L’information est donc transmise grâce à la libération de quelques milliers à quelques millions de molécules au maximum dans la fente synaptique.
La fiabilité de la communication cellulaire repose sur une reconnaissance parfaite de l’information avec un rapport signal sur bruit élevé. Ceci est possible car même si un très petit nombre de molécules est libéré (quelques femto à quelques attomoles), ces espèces sont émises dans un volume très restreint. Ceci correspond alors à des changements de concentration suffisamment importants pour permettre une détection rapide et précise de l’information. Lors de nos expériences électrochimiques, nous souhaitons détecter des quantités de molécules très faibles émises par une cellule. Mimer la configuration utilisée dans les synapses chimiques permet donc de concentrer dans un petit volume les molécules libérées.

Synapse « semi-artificielle »

Inspirée de la synapse chimique, la configuration synapse « semi-artificielle » (Figure A-5) a été adaptée au laboratoire pour détecter des signaux chimiques émis par une cellule vivante.11, 12 Le neurone émetteur est remplacé par l’objet à étudier (dans ce travail, il s’agit d’une cellule isolée) et le neurone récepteur, par l’électrode.
Le courant faradique détecté par une microélectrode est proportionnel à la concentration des molécules électroactives au voisinage de l’électrode (cf. Equation A-9). Comme nous l’avons vu, minimiser la distance entre la cellule émettrice et l’électrode permet de concentrer les molécules libérées. En pratique, à l’aide de micromanipulateurs, on atteint une distance de 50 à 100 nm en plaçant l’électrode au contact de la cellule. Le volume équivalent à la fente synaptique est alors de l’ordre du femtolitre. Si par exemple, 1000 molécules sont libérées par la cellule émettrice (1,66.10-21 moles), la concentration correspondante dans la fente synaptique est de l’ordre de 1 μmol.L-1. Cette gamme de concentration est alors détectable avec les UME. Utilisées dans cette configuration, les ultramicroélectrodes sont donc particulièrement bien adaptées à la détection de quantités infinitésimales de molécules libérées à l’échelle de la cellule unique, et ont permis, dans le cadre de cette thèse, l’étude de deux processus biologiques : l’exocytose et le stress oxydant. Comme décrit précédemment, leur taille, du même ordre de grandeur que celle des cellules étudiées offre une résolution spatiale assez précise pour détecter les molécules libérées par les vésicules sous l’électrode. On remarquera qu’en utilisant des électrodes de plus faibles dimensions, il est possible d’améliorer cette résolution et de sonder la surface de la cellule à différents endroits. Par consommation de la fibre de carbone d’une électrode dans une flamme (« etched-electrode »), il est possible d’atteindre des diamètres de 2 μm13 à 100-300 nm.14 En utilisant ces électrodes dans le cadre de l’étude de l’exocytose, l’existence de zones actives et non actives de sécrétion a été mise en évidence à la surface des cellules chromaffines.
La résolution temporelle des UME, bien supérieure la milliseconde, convient très bien à la cinétique des événements étudiés et permet alors la détection en temps réel des mécanismes biologiques. En effet, lors de l’exocytose, la durée de libération des molécules s’étend sur quelques dizaines de millisecondes (en moyenne 100 ms par événement d’exocytose). Par ailleurs, grâce à l’excellente résolution temporelle du patch-clamp, R. Chow et al. (Univ So Calif, Dept Physiol & Biophys, Los Angeles) ont montré que contrairement aux jonctions neuromusculaires ou aux neurones, pour lesquels les événements d’exocytose ont lieu environ une milliseconde après la stimulation, il existe un temps de latence chez les cellules chromaffines d’environ 50 ms.15 La charge de la double couche pour une électrode de carbone étant de quelques dizaines de millisecondes, les premiers événements peuvent être détectés. Dans les cas du stress oxydant, la cinétique des événements, bien supérieure à la seule diffusion des espèces vers l’électrode, est limitée par la production des espèces par la cellule.16 La durée de cette libération est très différente d’un modèle cellulaire à l’autre, mais s’échelonne de quelques minutes à plusieurs dizaines de minutes. Il est alors possible de détecter ces événements sur UME.
La sensibilité de ces électrodes permet la détection de courant de l’ordre du picoampère.7 De plus, leur utilisation offre également une excellente sélectivité. En choisissant le potentiel de l’électrode de travail, il est possible d’oxyder tout ou une partie du matériel biologique libéré. Par exemple, dans le cadre de la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS, Reactive oxygen species) et de l’azote (RNS, Reactive Nitrogen Species) pendant le stress oxydant, il est possible de détecter spécifiquement certaines espèces. En effet, des études voltamétriques de solutions de peroxyde d’hydrogène (H2O2), peroxynitrite (ONOO-), monoxyde d’azote (NO•) et nitrite (NO2-), quatre espèces, dont les travaux antérieurs du groupe montrent qu’elles sont impliquées dans le stress oxydant, ont mis en évidence que leurs vagues d’oxydation sont relativement bien séparées. Il est donc possible, en fixant le potentiel de l’électrode de travail à + 850, + 650, + 450 ou + 300 mV vs ECSS (Electrode au calomel saturé au chlorure de sodium) de détecter spécifiquement une ou plusieurs de ces espèces.17 De la même façon, seulement une partie des espèces libérées par exocytose peut être détectée. Par exemple, en fixant le potentiel de l’électrode de travail (électrode de carbone modifiée au Nafion) à + 400 mV vs Ag/AgCl, il est possible de ne détecter que la sérotonine et les catécholamines libérées par des cellules entérochromaffines de cochon d’inde. La mélatonine, s’oxydant à + 550 mV vs Ag/AgCl, n’est pas détectée.18 De manière générale, des traitements de surface de l’électrode sont utilisés pour induire une sélectivité vis-à-vis de certaines espèces soit en modifiant leur potentiel d’oxydation soit en bloquant l’accès de certaines d’entre elles à l’électrode en fonction de leur taille ou leur charge.

L’exocytose vésiculaire : nature des signaux et objectifs

L’utilisation des UME pour l’étude de l’exocytose a d’abord été développée, au laboratoire, sur les cellules chromaffines. Dans le cadre des travaux présentés dans cette thèse, les cellules étudiées appartiennent à la lignée BON, dérivée d’une tumeur carcinoïde du pancréas.19 Lors de l’analyse, ces cellules sont cultivées dans des boites de Petri placées sur la plateforme d’un microscope inversé au sein d’une cage de Faraday (Figure A-6). Le milieu de culture est remplacé par un tampon isotonique (315 mOsm, pH 7,4, θ = 22 ± 1 °C) afin d’éviter tout problème de passivation lié aux espèces contenues dans le milieu de culture. Les molécules de sérotonine libérées lors de l’exocytose après stimulation des cellules BON sont détectées par ampérométrie à potentiel constant sur UME à fibre de carbone de diamètre 10 μm. La référence utilisée est une électrode Ag/AgCl et le potentiel appliqué à l’électrode de travail, correspondant au plateau de la vague d’oxydation de la sérotonine, est + 650 mV vs Ag/AgCl.
La stimulation de la sécrétion est réalisée à l’aide d’un capillaire contenant une solution d’ionomycine injectée au voisinage de la cellule. L’ionomycine est un ionophore qui va entraîner une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire : sa présence entraine l’ouverture de canaux calciques de la membrane cellulaire. La concentration en calcium du tampon extracellulaire étant très supérieure à la concentration intracellulaire, le calcium va entrer dans la cellule et déclencher la sécrétion dépendante du calcium.20 L’UME et la micropipette de verre sont positionnées avec une précision inférieure au micromètre à l’aide de macro- puis de micromanipulateurs. Suite à la stimulation, les molécules de sérotonine contenues dans les vésicules sont libérées par la cellule BON dans la fente « synaptique semi-artificielle » créée entre la cellule et l’UME, et sont ensuite oxydées à la surface de l’électrode (Figure A-7). Expérimentalement, la succession d’événements individuels d’exocytose se présente sous la forme d’une suite de pics ampérométriques (Figure A-8) dont chacun correspond à l’ouverture d’une vésicule exocytotique et à la détection de son contenu. La durée de l’ampérogramme enregistré est de l’ordre de cinq minutes et dépend principalement de l’état cellulaire.

Le stress oxydant : nature des signaux et objectifs

Dans le cadre des travaux effectués au laboratoire pour détecter les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, plusieurs modèles cellulaires ont été étudiés : les kératinocytes (cellules de la peau),23 les fibroblastes (cellules des tissus conjonctifs),24 les macrophages et les lymphocytes (cellules sanguines du système immunitaire)17… Le peroxyde d’hydrogène (H202), le peroxynitrite (ONOO-), le nitrite (NO2-) et le monoxyde d’azote (NO•) sont détectables électrochimiquement par ampérométrie stationnaire sur UME de carbone platiné à + 300, + 450, + 650 et + 850 mV vs ECSS, respectivement. Lors des expériences, les cellules adhèrent au fond d’une boite de Petri placée sur la plateforme d’un microscope inversé au sein d’une cage de Faraday (Figure A-9). Le milieu de culture est remplacé par un tampon isotonique (315 mOsm, pH 7,4, θ = 22 ± 1°C) pour les mêmes raisons que dans le cas de l’exocytose. Les espèces sont détectées sur une UME de carbone platiné. L’électrodéposition de noir de platine conduit à un dépôt dendritique à la surface de carbone de 10 μm de diamètre, ce qui permet d’améliorer la sensibilité électrochimique de l’électrode (Figure A-10), en particulier vis-à-vis de la détection du monoxyde d’azote tout en augmentant sa surface active.25
La référence utilisée est une électrode au calomel saturée en chlorure de sodium (ECSS) car celle au calomel saturé par du chlorure de potassium ne convient pas du fait de la contamination du milieu par les ions potassium (dépolarisant membranaire). Le potentiel appliqué à l’électrode de travail dépend de la nature des espèces à détecter. L’activation de la réponse cellulaire peut être induite de deux façons : la stimulation mécanique ou la stimulation biochimique.

Stimulation mécanique

Les cellules sont stimulées à l’aide d’un microcapillaire de verre provoquant une microperforation de la membrane cellulaire. Cette perforation des bicouches provoque la dépolarisation de la membrane et la modification de l’équilibre osmotique. L’entrée d’ions, en particulier les ions calcium, va activer les pools enzymatiques (NADPH oxydase et NO synthase) responsables de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou de l’azote (RNS).26 On peut imaginer que cette stimulation mime l’agression subie par les cellules lors de l’entrée de virus, bactéries ou particules. Suite à la stimulation, les espèces sont libérées dans la fente « synaptique semi-artificielle » créée entre la cellule et l’UME, et sont ensuite détectées par oxydation à la surface de l’électrode. Les mesures sont effectuées en oxydation car l’oxygène dissous dans le milieu rend difficile l’analyse en réduction. L’UME et la micropipette de verre sont positionnées avec une précision inférieure au micromètre à l’aide de macro- puis de micromanipulateurs.
Expérimentalement, le signal détecté se présente sous la forme d’un pic ampérométrique unique mais de très longue durée (supérieur à 30 secondes en général) (Figure A-11).

Biogénèse et maturation des granules de sécrétion

La formation initiale des vésicules ou granules immatures a lieu dans l’appareil de Golgi.30 La face cis de l’appareil de Golgi est la zone d’entrée de protéines synthétisées au sein du réticulum endoplasmique qui constitueront l’intérieur des granules de sécrétion (Figure B-1, étape a). La face trans est la zone de sortie des vésicules. Chez les cellules neuroendocrines, les propriétés agrégatives des protéines destinées à se retrouver au sein des granules (comme la chromogranine A ou B), ainsi que leur propension à interagir avec les membranes du réseau trans-golgien entrainent la formation de bourgeons31 (Figure B-1, étape b). Ces bourgeons sont ensuite fermés pour créer les granules de sécrétions immatures.30 Lors de la phase de maturation (Figure B-1, étape c), les granules de sécrétion sont remplis d’hormones, synthétisées dans le cytoplasme, telles que les monoamines (adrénaline, sérotonine, …), de molécules d’ATP, d’acide ascorbique et d’ions calcium. Ce remplissage se fait par l’intermédiaire de transporteurs spécifiques situés sur la membrane granulaire32 qui déplacent les espèces contre le gradient de concentration en utilisant de l’énergie sous la forme d’ATP. Suite à un processus de condensation, le contenu vésiculaire, constitué d’une matrice à coeur protéique devient extrêmement dense et assure la cohésion des plus petites molécules.33, 34 En effet, dans les conditions de pH intravésiculaire (environ 5,5), les neurotransmetteurs de types monoamines (catécholamines, sérotonine, histamine, acide γ-aminobutyrique (GABA) …) se trouvent sous forme protonée et compensent les charges négatives des protéines de la matrice. Des liaisons électrostatiques et hydrogène35 permettent d’assurer la cohésion de l’ensemble en équilibre osmotique. C’est cette condensation qui permet de stocker ces molécules à haute concentration (par exemple, chez les cellules chromaffines, les catécholamines sont stockées à environ 550 mmol.L-1, l’ATP à 120 mmol.L-1, les ions calcium à environ 25 mmol.L-1…).

Migration des granules de sécrétion vers la membrane plasmique

Afin d’être rapidement mobilisables, les granules de sécrétion sont accumulés au voisinage de la membrane plasmique. Leur transport de l’appareil de Golgi à la périphérie de la cellule ainsi que leur rétention se fait par l’intermédiaire de nanomoteurs à kinésine suivant le cytosquelette, lui même constitué de microtubules et de filaments d’actine.
Les microtubules, formés de filaments protéiques sont responsables du mouvement des granules au sein de la cellule. Par exemple, la kinectine, une protéine membranaire du réticulum endoplasmique, fixe les granules à une protéine motrice nommée kinésine. Celle-ci entraine alors les granules le long des microtubules en direction de la périphérie de la cellule (Figure B-2). Une fois au voisinage de la surface cellulaire, les filaments d’actine, particulièrement denses dans cette zone,37 permettent la rétention des vésicules à proximité de la membrane.38 Le transport des granules de sécrétion se produit alors que ceux-ci semblent encore immatures,38 la maturation ayant lieu par la suite lors du parcours sur le réseau d’actine.

Accrochage des granules de sécrétion à la membrane plasmique

Les membranes biologiques ne fusionnent pas spontanément. En effet, toutes deux constituées de bicouches lipidiques chargées négativement, les membranes granulaires et plasmiques ont tendance à se repousser. Leur fusion exige donc l’annulation, tout au moins la minimisation de ces forces de répulsion, et pour cela, plusieurs familles de protéines semblent être mises en jeu. La première étape de ce mécanisme, l’arrimage, fait notamment intervenir les protéines Rab, petites GTPases qui, en se liant avec du GTP, viennent s’ancrer à la membrane granulaire. L’association Rab/GTP permet alors à la vésicule de se fixer spécifiquement à la membrane cible (Figure B-3, étape a). Cependant, le mécanisme de cette association relativement lâche (tethering) est encore mal compris.

Techniques analytiques utilisées : avantages et inconvénients

Il existe de nombreuses techniques permettant l’étude de la sécrétion (chromatographie, électrophorèse capillaire, spectrométrie de masse…). Parmi ces techniques, les méthodes électriques et optiques sont utilisées pour des analyses à l’échelle de la cellule unique et offrent la possibilité de mesurer la sécrétion en temps réel avec une excellente résolution : inférieure à la milliseconde en électrophysiologie et en ampérométrie et de l’ordre de la dizaine de millisecondes pour les méthodes optiques.22, 54, 57 Les modèles cellulaires classiquement utilisés pour ces études sont les neurones géants,58 les cellules chromaffines,22 les mastocytes,59 les PC1260 et les cellules β du pancréas.61

Technique électrophysiologique : le patch-clamp

La technique du patch-clamp a été introduite par Erwin Neher et Bert Sakmann (prix Nobel en 1991) en 1976 pour l’étude électrophysiologique des canaux ioniques.62 Elle a depuis connu de nombreuses évolutions permettant de comprendre comment les canaux ioniques modifient le potentiel transmembranaire (la différence de potentiel entre la face interne et la face externe de la membrane plasmique), et comment ils gouvernent certaines activités cellulaires telles que l’exocytose vésiculaire.
Comme nous l’avons vu dans les paragraphes précédents, la membrane cellulaire agit comme une barrière sélective dans le maintien de l’équilibre entre les milieux intracellulaire et extracellulaire. Elle est constituée de phospholipides assemblés en double feuillet. La tête polaire hydrophile des lipides est orientée vers l’extérieur de la membrane et leur queue, hydrophobe est orientée vers l’intérieur. Cette association rend la membrane imperméable aux molécules chargées. Cependant, des protéines, encastrées au sein de la membrane, constituent des canaux ioniques qui permettent aux ions de la traverser. Chaque canal peut être traversé par un flux ionique élevé, de l’ordre de 106 ions par seconde, générant alors un courant électrique. Ce courant, de faible intensité (environ 1 pA) ne peut être mesuré s’il reste noyé dans le bruit lié à l’activité globale de la cellule, et en particulier celui lié aux variations de charges au voisinage de la membrane. C’est sur ce principe que repose le patch clamp. Cette technique consiste en effet à enregistrer l’activité électrique d’un fragment de membrane cellulaire isolée électriquement de la surface cellulaire.

Les différentes configurations de mesure

Expérimentalement, une micropipette de verre de diamètre de l’ordre de quelques microns est placée en contact avec la membrane cellulaire. Le capillaire de verre est ensuite scellé à la membrane en imposant une dépression en son sein. La légère aspiration permet d’augmenter la résistance de la jonction pipette/cellule jusqu’au gigaohm (ce scellement pipette/cellule est couramment nommé « gigaseal ») et ainsi isoler électriquement le fragment de la membrane contenu dans la pipette. Cette forte résistance permet d’améliorer le rapport signal sur bruit et d’alors enregistrer des courants de l’ordre du picoampère. Cette configuration, appelée « cellule attachée » permet l’enregistrement de l’activité de seulement quelques canaux ioniques contenus dans la partie de membrane isolée. L’étude des propriétés chimiques et électriques de ces canaux est alors possible. La mesure de courant à potentiel fixé permet de détecter la conductance du canal ainsi que sa sélectivité ionique.
La technique du patch-clamp sert non seulement à étudier le fonctionnement des canaux membranaires, mais une évolution de la technique permet l’analyse de la transmission des signaux à l’échelle cellulaire. Pour cette application, d’autres configurations, dérivées de la « cellule attachée » sont utilisées (Figure B-8). La configuration « cellule entière » permet d’étudier la totalité de la surface cellulaire. A partir de la configuration « cellule attachée », le morceau de membrane contenu dans le capillaire de verre (« patch ») est aspiré et rompu mécaniquement. Il est également possible, pour se rapprocher des conditions physiologiques et éviter la dyalise de la cellule, de seulement perforer la membrane (par ajout d’un antibiotique par exemple) en configuration « cellule attachée ».63 La configuration « patch excisé » s’obtient en séparant la cellule de la pipette. Le patch de membrane reste fixé à la pipette et sa face intracellulaire est dirigée vers l’extérieur. Cette configuration est appelée « inside-out ». Enfin, la configuration « outside-out » s’obtient à partir de la configuration « patch excisé » en éloignant la pipette et en incisant la membrane qui, en se rabattant, referme l’orifice de la pipette en orientant sa face extracellulaire vers l’extérieur. Dans ces deux dernières configurations, « inside-out » et « outside-out », l’expérimentateur a ainsi accès au fonctionnement des canaux membranaires depuis le cytoplasme ou le milieu cellulaire.
De par sa structure et l’existence d’un gradient de concentration ionique de part et d’autre de la membrane, cette dernière possède une capacité dite capacité membranaire. De plus, la bicouche lipidique, relativement imperméable, présente une grande résistance. En tenant compte de la résistance de la solution, l’ensemble est alors assimilé à un circuit équivalent de type RC (la disposition des éléments du circuit dépend de la configuration expérimentale choisie). Lors des mesures, il est alimenté par une tension le plus souvent sinusoïdale. Le courant mesuré est alors également de forme sinusoïdale, de même fréquence, mais d’amplitude et de phase différentes. Basées sur les techniques d’impédances, les expériences consistent donc à déterminer les valeurs de résistance (donc de conductance) et de capacité du circuit équivalent correspondant au signal recueilli. La capacité déterminée, proportionnelle à la surface cellulaire, apporte des informations sur l’évolution de cette surface et, la conductance mesurée reflète la facilité avec laquelle les ions traversent les canaux. Comme nous le verrons plus bas, ces deux informations permettront de détecter des événements d’exocytose isolés ainsi que les pores de fusion.

Etude du mécanisme d’exocytose par patch-clamp

La résolution temporelle de la technique, de l’ordre de la milliseconde, est compatible avec la mesure en temps réel du mécanisme d’exocytose.64 Lors d’un événement exocytotique, la membrane granulaire est incorporée totalement ou en partie à la membrane cellulaire. Il en résulte une augmentation de la surface cellulaire totale qui se traduit par une augmentation de la capacité sous forme d’une marche (Figure B-9) (facteur de conversion capacité/surface : 10 fF/μm2). Cette technique, utilisée pour l’étude de l’exocytose des cellules chromaffines,64, 65 a ensuite été appliquée à de nombreux modèles cellulaires comme les cellules β du pancréas,66 les neutrophiles,67 les mastocytes59, 66, 68… Lors de l’étude des cellules chromaffines en configuration « cellule entière », le patch clamp a permis de mettre en évidence une augmentation de la capacité membranaire globale (2,6 à 6 pF)64 suite à la stimulation de la cellule. Cependant, dans la plupart des cas, une fréquence de sécrétion élevée et un rapport signal sur bruit moyen ne conduisent qu’à mesurer une augmentation globale de la capacité empêchant alors de discriminer les différents événements se produisant à la surface de la cellule. En effet, la taille des vésicules des cellules chromaffines (diamètre de l’ordre de 0,2 à 0,3 μm) n’est pas suffisamment élevée pour visualiser des « marches » de capacité. Par contre l’étude de la sécrétion des mastocytes, dont les granules géants ont un diamètre de l’ordre de 2,5 μm, a permis de visualiser facilement des « marches » de capacité de l’ordre de 0,1 à 0,8 pF.
Des avancées remarquables ont néanmoins été réalisées en étudiant la sécrétion des cellules chromaffines en configuration « cellule attachée ». Afin de bénéficier complètement de l’excellente résolution temporelle de la technique, la stimulation des cellules doit être correctement synchronisée avec la détection. Outre la stimulation électrique, l’utilisation de molécules capables d’emprisonner des molécules de calcium (« calcium cagé ») et de les libérer suite à un flash de lumière ultraviolette permet d’augmenter quasi-instantanément la concentration intracellulaire de calcium, déclenchant la sécrétion régulée des cellules endocrines.29 L’utilisation de ce mode de stimulation a alors permis une étude fine de l’influence de l’augmentation de la concentration intracellulaire du calcium sur la sécrétion.69, 70
Le patch-clamp a également permis de mettre en évidence l’existence de deux phases de cinétique différente au cours de la sécrétion.29, 71, 72 La libération du contenu vésiculaire est caractérisée par une première phase très courte, de quelques centaines de millisecondes à quelques secondes selon les modèles cellulaires, au cours de laquelle la fréquence de sécrétion est très élevée. Au contraire, au cours de la seconde phase, plus longue (de quelques dizaines de secondes à plusieurs minutes), la fréquence de sécrétion est plus faible. Néanmoins, vu sa durée, le nombre d’événements d’exocytose se déroulant lors de la seconde phase est cependant supérieur au nombre d’événements se déroulant lors de la première phase.
Bien que le patch-clamp permette de mesurer les changements de capacité correspondant à l’ensemble des événements se produisant sur la surface totale de la cellule, cette technique n’offre pas la possibilité de localiser les sites de libération. Ainsi, des mesures de capacitance couplées à une détection en microscopie électronique ont permis d’attribuer ces deux phases de cinétiques différentes à deux types de granules. Les granules fusionnant lors de la première phase sont ceux initialement accrochés à la membrane plasmique alors que ceux fusionnant lors de la deuxième phase sont ceux qui ont une position plus reculée au sein du cytoplasme au moment de la stimulation.68 Par la suite, la première phase a également été décomposée et interprétée plus finement comme étant la réponse de deux populations granulaires.73 La première population correspond à une petite quantité de granules totalement prêtes pour l’exocytose (« Readily Releasable Pool ») suite à l’augmentation de la concentration intracellulaire en calcium, alors que la deuxième population est constituée de granules dont l’amorçage n’est pas terminé. La différence sur le statut de ces deux populations est encore controversée : elle pourrait être due au complexe SNARE plus ou moins fermé74, 75 ou à différents isoformes de la synaptotagmine, protéine du complexe SNARE, plus ou moins sensibles au calcium.
D’autre part, la technique de « patch-ampérométrie » combine les mesures de capacité en configuration « cellule attachée » et la détection ampérométrique en introduisant une électrode de carbone au sein de la pipette de patch même si la distance électrode/membrane est alors grande et difficilement contrôlable, d’où une perte de résolution cinétique. Il est alors possible de détecter des « marches » de capacité chez les petites cellules comme les cellules chromaffines (« marches » de 0,3 à 12 fF).57 Il a ainsi été montré que l’augmentation de la capacité, signe de la création du pore, pouvait ne correspondre à aucun courant ampérométrique, signe de l’absence de sécrétion. Il est donc possible que le pore se referme (diminution de la capacité) avant la libération du contenu vésiculaire (fusion partielle ou « kiss-and-run »).57, 63 Ce phénomène a également été observé en couplant les mesures de capacité à la microscopie optique. Dans la majorité des cas, une fois le pore créé, il s’élargit rapidement (< 10 ms). Il a cependant été remarqué que le pore peut s’ouvrir et se fermer plusieurs fois avant de se refermer définitivement (« flickering »). Dans un premier temps, la fusion semble donc réversible. D’autre part, le couplage de ces deux techniques (patch-clamp et microscopie optique) a également montré que le gonflement de la matrice vésiculaire se produit après l’augmentation de capacité et n’est donc pas responsable de la formation du pore initial de fusion. Ce gonflement serait ainsi déclenché par l’entrée de solutés à travers le pore de fusion déjà ouvert qui entrainerait son expansion.77
Enfin, une fois le pore de fusion créé, la connexion entre le milieu intragranulaire et le milieu extracellulaire est établie et la surface de membrane granulaire incorporée contribue à la mesure de capacité. Il est alors possible d’estimer la taille du granule ayant fusionné. Cette donnée, ajoutée à la mesure de la conductance du pore de fusion, a permis d’estimer la taille du pore de fusion. Chez les mastocytes de souris beiges68 et chez les cellules chromaffines,57 la conductance moyenne est de 300-400 pS, ce qui correspond à un pore de fusion initial de l’ordre de 1 à 2 nm de diamètre.

Influences des paramètres physico-chimiques sur l’exocytose

– Gonflement de la matrice intragranulaire:
La forme des pics ampérométriques dépend de deux facteurs : la dynamique d’ouverture du pore et la vitesse de diffusion des cations dans la matrice. Des études ampérométriques sur cellules chromaffines, mastocytes et cellules β pancréatiques ont montré que ces deux processus sont gouvernés par le gonflement de la matrice.93 Par exemple, chez les cellules chromaffines, avant l’ouverture du pore, la cohésion de la matrice est assurée par des interactions entres les protéines négatives et leurs contre-ions, les monoamines, et des interactions par liaison hydrogène. Une fois le pore de fusion créé, les monoamines commencent à diffuser vers le milieu extracellulaire et sont remplacées au sein de la vésicule par des ions sodium et des protons initialement présents dans le milieu extracellulaire. Cet échange d’ions entraîne une désorganisation et la perte de cohésion de la matrice. Il en résulte un déséquilibre osmotique qui conduit au gonflement de la matrice35, 77, 83 qui serait responsable de l’expansion du pore de fusion et la libération du contenu granulaire.54 La libération des monoamines serait alors contrôlée par le gonflement de la matrice, lui-même régulé par la composition du milieu extracellulaire.93 Ces hypothèses ont été confirmées en étudiant la libération en présence d’ions monovalents (Cs+),83 divalents (Zn2+)83, 105 ou trivalents (Al3+, La3+).106 Globalement, les ions monovalents facilitent l’exocytose tandis que les ions divalents et trivalents, en assurant la compacité de la matrice, inhibent la libération.93
– Influence de la température sur le mécanisme d’exocytose:
L’influence de la température sur l’exocytose a été évaluée à partir de plusieurs modèles cellulaires. Chez les cellules chromaffines et chez les mastocytes, l’augmentation de la température jusqu’à la température physiologique (37 °C) est accompagnée d’une augmentation de la fréquence des événements d’exocytose, de la quantité de molécules libérées par vésicules et d’une accélération de la cinétique de libération.83, 91, 107-109 Par contre, dans le cas des plaquettes, la fréquence des événements augmente mais la quantité de molécules libérées par événement n’est pas modifiée lorsque la température augmente.83 La température altère donc la cinétique du mécanisme d’exocytose, mais peut aussi influencer directement la quantité de molécules libérées. On notera que l’analyse de plusieurs paramètres (fréquence, temps de montée des pics…) en fonction de la température permet d’extraire des valeurs d’énergie d’activation pour les différentes étapes d’un événement.98 Quoi qu’il en soit, l’origine de ces modifications est complexe. Du point de vue de la physicochimie, une hausse de température accentuerait le gonflement de la matrice mais diminuerait aussi la viscosité de la membrane, conditions qui favoriseraient la réalisation des événements d’exocytose. Un effet de la température sur la biosynthèse des vésicules n’est pas à exclure, même s’il est peu probable, considérant les faibles temps d’exposition (quelques minutes).
– Rôle du pH dans la régulation de l’exocytose:
Le gradient de pH entre le milieu intragranulaire et le milieu extracellulaire joue également un rôle important dans la régulation de l’exocytose. En réalité, l’impact du pH sur l’exocytose n’est pas toujours simple à expliquer et dépend notamment du modèle cellulaire. Selon ces derniers, le stockage des espèces est différent et l’effet du pH varie. Ainsi, chez les cellules chromaffines, la conformation de la chromogranine intravésiculaire dépend du pH. Dans les conditions physiologiques, le milieu intragranulaire acide permet de stocker les catécholamines à forte concentration en cohésion avec la matrice. En l’occurrence, à pH 5,5, la matrice se trouve sous la forme d’un tétramère. Lors de la fusion, elle entre en contact avec le milieu extracellulaire à pH 7,4, et change alors de conformation. Elle se trouve sous la forme d’un dimère moins agrégé, affaiblissant ainsi l’association des catécholamines avec la matrice. L’analyse ampérométrique de la diminution du pH extracellulaire de 7,4 à 5,5 montre que la cinétique de libération est ralentie110-112 et la quantité de molécules libérées est réduite,113, 114 en accord avec une déstructuration de la matrice moins marquée. De même en diminuant le pH intravésiculaire, le gradient de pH est amplifié et la quantité de molécules libérées augmente. Inversement, en inhibant les pompes à protons pour augmenter le pH intragranulaire, la cinétique de libération et la quantité de molécules libérées diminuent.115 Chez les cellules β du pancréas, l’insuline et la sérotonine sont stockées de façon différente au sein de la matrice intravésiculaire. La sérotonine, soluble, est située dans la partie liquide du granule alors que l’insuline forme un complexe avec les ions Zn2+. Les études ampérométriques montrent que le pH extracellulaire ne modifie pas la libération de sérotonine. Seule la libération d’insuline, qui nécessite la dissolution de la matrice, est affectée. En effet, à pH faible, l’insuline n’est pas libérée et, lorsque le pH extracellulaire augmente, sa cinétique de libération augmente.89 D’autre part, chez les PC12, la diminution du pH de 7,4 à 6,8 déclenche l’exocytose sans nécessiter la présence de sécrétagogue.116 Dans ce cas, l’impact du pH sur la matrice intravésiculaire n’est pas avéré.
– Influence de l’osmolarité sur le mécanisme d’exocytose:
La perturbation de l’équilibre osmotique entre les milieux intra- et extracellulaires permet également de réguler la fusion membranaire. Ainsi, un milieu extracellulaire hypotonique a pour conséquence l’entrée d’eau dans la cellule afin de restaurer l’équilibre. Ceci induit le gonflement de la matrice et indirectement l’augmentation de la tension de la membrane et la diminution de sa viscosité. L’effet inverse est attendu en conditions hypertoniques. Les données ampérométriques sont en accord avec ces hypothèses puisqu’un milieu extracellulaire hyperosmotique (630 mOsm) entraîne une diminution de la fréquence des événements chez les cellules chromaffines.55, 83 On remarque que la cinétique et la quantité de molécules libérées sont plus faibles qu’en conditions isotoniques.117 Inversement, en conditions hypotoniques (200 mOsm), la fréquence de sécrétion et la quantité de molécules libérées par les cellules chromaffines sont plus élevées qu’en conditions isotoniques.93 Il n’est par ailleurs pas exclu que l’osmolarité du milieu extérieur joue un rôle sur le gonflement de la matrice, favorisant ainsi la fusion en conditions hypotoniques et l’inhibant en conditions hypertoniques. En conditions hypertoniques extrêmes (1000 mOsm), seuls quelques pics ampérométriques d’amplitude très faible sont détectés suggérant la caractérisation d’événements de libération cantonnés au stade de pore de fusion et nommés « kiss-and-hold ».55
– Rôle des propriétés membranaires dans la régulation de l’exocytose:
Le cholestérol est un constituant des membranes granulaire et cellulaire participant à la fusion membranaire. Il se lie à la syntaxine du complexe SNARE. La détection ampérométrique de la sécrétion de cellules chromaffines dont le taux de cholestérol membranaire a été modifié ne présente pas de variations de la fréquence des événements106 mais, entraîne pourtant une diminution de leur cinétique74, 106 en accord avec une rigidification de la membrane cellulaire. Il a également été remarqué que chez les PC12, la diminution de cholestérol membranaire ne diminue pas seulement la fréquence des événements, mais réduit également la vitesse de libération et la quantité de molécules libérées.118 Par contre, lors de la diminution de la quantité de cholestérol, la fréquence de libération spontanée augmente chez les jonctions neuromusculaires d’écrevisses119 et les neurones de l’hippocampe.120 Ces résultats mettent en évidence la versatilité et le rôle complexe du cholestérol dans l’exocytose puisque ce dernier semble être impliqué dans les étapes d’arrimage et de fusion, voire favoriser le bon déroulement de la libération en assurant à la membrane cellulaire une courbure adaptée.
D’autre part, la courbure membranaire est essentielle à la formation du pore, pourtant sa nature influence aussi la sécrétion. La distribution des phospholipides est asymétrique dans les feuillets de la membrane, et ils se réorganisent au cours de l’exocytose. Il a été montré que cette asymétrie est nécessaire et contrôle la sécrétion.121 L’insertion de lipides exogènes au sein de la membrane plasmique peut donc favoriser ou non la fusion membranaire. Chez les cellules chromaffines, l’ajout de lysophosphatidylcholine (LPC) dans la membrane des cellules augmente la fréquence des événements et accélère la cinétique de libération. L’ajout d’acide arachidonique produit l’effet inverse.16 En effet, la forme conique inverse de LPC et la forme conique de l’acide arachidonique imposent des contraintes opposées au sein de la membrane (courbures positive et négative respectivement). Des résultats globalement similaires ont été observés chez les PC12, où l’ajout de phosphatidylsérine entraine une augmentation de la fréquence des événements alors que l’ajout de phosphatidylcholine, de phosphatidyléthanolamine ou de sphingomyéline ne modifie pas la fréquence mais seulement la cinétique des événements.122 Enfin, une étude ampérométrique récente123 a mis en évidence un effet antifusogène du LPC sur cellules PC12 et chromaffines. Cette donnée contradictoire ne remet pas en cause la technique analytique mais montre l’importance du modèle cellulaire et de la manipulation (concentration, nature, temps d’exposition…) des phospholipides.

Influence des paramètres biologiques sur l’exocytose

La première étape du mécanisme d’exocytose nécessite le transport des granules à proximité de la membrane plasmique. Le modelage des filaments d’actine du cytosquelette est une étape nécessaire à ce transport.124 La modification du cytosquelette semble donc être un facteur de contrôle. Par exemple, la présence de latrunculine conduit à la dépolymérisation du réseau d’actine et, après quelques minutes à l’augmentation, en termes de charge et d’intensité de la libération de sérotonine chez les mastocytes de rat.125 Cependant, après une heure de traitement, la libération est complètement inhibée.125 Ceci est cohérent avec le double rôle du réseau d’actine qui aide à la fois au déplacement des vésicules dans le milieu intracellulaire et qui agit comme un contrôle de la libération à l’échelle d’un événement individuel. Ainsi, une dépolymérisation modérée facilite l’émission du contenu vésiculaire par événement quand un traitement plus marqué, en annihilant la capacité des vésicules à se déplacer, bloque l’ensemble de la réponse exocytotique. D’autre part, la ryanodine et la caféine, agissant sur les mêmes sites que la latrunculine, ont des effets similaires.125
Une fois la vésicule de sécrétion arrivée à proximité de la périphérie de la cellule, la fusion des membranes nécessite la formation du complexe SNARE. Son rôle est notamment de compenser la répulsion électrostatique des membranes, toutes les deux globalement chargées négativement, et de les forcer à entrer en contact.124 Le rôle et l’importance de ce complexe, formé par l’association de protéines vésiculaires (VAMP/synaptobrévine) et cellulaires (SNAP-25 et syntaxine) ont été confirmés par ampérométrie.41 Par exemple, les neurotoxines clostridiales tétaniques et botuliques clivant spécifiquement les protéines du complexe SNARE,126 entrainent une diminution de la sécrétion des cellules chromaffines.41, 127
Bien que ce complexe ne soit pas supposé jouer un rôle sur la dynamique de fusion après la phase d’arrimage, il peut néanmoins réguler la cinétique des événements d’exocytose en modifiant la viscosité et la courbure membranaire locale. D’autre part, les interactions des protéines du complexe SNARE et d’autres protéines peuvent également être déterminantes. C’est le cas, par exemple de NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) qui, en se liant avec la protéine SNAP est responsable de l’activation du complexe SNARE, favorisant ainsi la fusion des membranes.41 Initialement, le complexe SNARE est en configuration dite cis (les protéines SNARES sont membranaires) et est alors inactif. En se liant au complexe SNARE, le NSF perturbe sa configuration. Le complexe devient trans (la synaptobrevine est localisée sur la membrane vésiculaire alors que SNAP 25 et Syntaxine 1 sont sur la membrane cellulaire) et permet aux membranes de s’approcher l’une vers l’autre.128
La protéine membranaire synaptotagmine est également responsable de la régulation de l’exocytose. Sous l’action du calcium, elle s’ancre dans la membrane granulaire, induit la courbure positive de la membrane et favorise la fusion50 (Figure B-15).

La microscopie optique

La microscopie optique, grâce à l’observation des granules avant la fusion, permet d’apporter des informations sur la localisation des événements d’exocytose, voire leur dynamique. Comme nous le verrons, elles sont principalement axées sur des études de fluorescence, et les vésicules doivent souvent être modifiées pour permettre leur observation.

Réactions bioluminescentes

Il est possible d’observer les événements d’exocytose par l’intermédiaire de réactions bioluminescentes. Le composé chimique à l’origine de ces réactions le plus répandu est la luciférine. Son oxydation, par l’action enzymatique de la luciférase conduit à la production d’oxyluciférine et à l’émission de photons. Cette réaction nécessite de l’oxygène et de l’ATP et l’intensité lumineuse est proportionnelle à la concentration en ATP.54 Les vésicules de sécrétion des cellules chromaffines contiennent, en plus des catécholamines et de la matrice, de l’ATP à forte concentration (0,12-0,25 mol.L-1),152 rendant possible la visualisation de l’activité exocytotique. Ainsi, en stimulant la sécrétion de ces cellules dans un milieu contenant de la luciférine et de la luciférase, l’exocytose peut être mesurée en temps réel mais sans pouvoir différencier les événements de libération.

Microscopie de fluorescence

Le principe de cette méthode analytique repose sur l’utilisation de sondes fluorescentes dont les propriétés dépendent du milieu où elles sont localisées. Il est alors possible d’élaborer de nombreuses stratégies pour étudier et visualiser la sécrétion d’une vésicule isolée. Ce type de microscopie repose sur la capacité qu’ont les sondes fluorescentes à émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. Une fois l’énergie du photon incident absorbée, la molécule se trouve dans un état électronique excité. Son retour à l’état fondamental se fait par émission d’un photon détecté par microscopie.

Les sondes fluorescentes

Parmi les marqueurs membranaires utilisés pour résoudre les mouvements des membranes, la sonde FM 1-43 est la plus commune. Elle présente l’avantage d’être peu fluorescente en milieu aqueux, mais son intensité augmente considérablement lorsqu’elle est liée aux membranes biologiques. Elle génère ainsi un rapport signal sur bruit très avantageux. De plus, étant chargée positivement, sa translocation à travers la bicouche lipidique est limitée voire impossible. Elle reste donc localisée sur le feuillet extérieur.54
Elle est ainsi utilisée pour marquer les membranes cellulaires puis les vésicules de sécrétion, son incorporation au sein de la membrane vésiculaire étant réalisée par endocytose.153 Ceci permet donc de visualiser les activités exocytotiques de la cellule.63 On remarque que la quantité de sonde insérée dans la membrane cellulaire durant la sécrétion donne une information similaire à celle obtenue lors des mesures de capacitance en patch-clamp. Par comparaison avec cette technique, l’augmentation de la fluorescence ne reflète que les événements d’exocytose alors que les variations de capacitance peuvent être modifiées par les événements d’endocytose. Très utilisée pour les préparations neuronales qui recyclent leurs vésicules par endocytose, elle offre la possibilité de visualiser les cycles exocytose/endocytose en discriminant les deux mécanismes.154-156 Du fait de son mode d’incorporation dans la membrane vésiculaire, la principale limitation de la sonde FM 1-43 est un emploi restreint aux cellules dont le recyclage des vésicules est rapide.
Les marqueurs vésiculaires présentent également d’excellentes propriétés pour l’étude de la sécrétion. Le principe de la détection d’un événement repose sur la différence de fluorescence de la sonde en fonction du pH qui passe d’un milieu acide (environ 5) à neutre (environ 7) au cours de la libération vésiculaire.
Par exemple l’acridine orange, un acide nucléique qui traverse facilement les membranes, entre dans les compartiments acides tels que les granules au sein desquels elle est protonnée et stockée. En milieu acide, elle est orange lorsqu’elle est excitée par un laser bleu. Les protéines modifiées constituent une autre classe de marqueurs vésiculaires. Ainsi, la GFP (Green Fluorescent Protein), intrinsèquement fluorescente, a été découverte en 1962 par O. Shimomura.157 Le clonage de son gène codant a été réalisé par M. Chalfie en 1992 et elle a ensuite été insérée dans un organisme pour la première fois en 1994 par R. Tsien.158 Ces trois chercheurs ont été récompensé par un prix Nobel de Chimie en 2008. Son gène, fusionné in vitro au gène de la protéine d’intérêt (dans le cas de l’étude de l’exocytose, il s’agit en général du neuropeptide Y (NPY) qui permet un marquage vésiculaire), est ensuite inséré dans les cellules à étudier par transfection.158 Il existe différents dérivés de la GFP, comme par exemple, la eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) ou la PHluorine dont les propriétés sont légèrement différentes (couleur de fluorescence ou sensibilité au pH). Il existe d’autres protéines fluorescentes basées sur ce principe. Nous pouvons citer par exemple, la DsRed (Discosoma Red Fluorescent Protein) et ses dérivées (comme la mRFP, monomeric Red Fluorescent Protein) mais leur rendement de transfection est plus faible et leur maturation est plus lente que ceux de la GFP et de ses dérivés. La GFP est donc très utilisée pour observer la localisation et suivre le mouvement des vésicules de sécrétion avant la fusion. On remarquera que des études avec un double marquage (milieu intravésiculaire/syntaxine) ont été mises en place afin de montrer le caractère réversible de la première étape de formation du complexe SNARE.

Table des matières

PARTIE A : Utilisation des ultramicroélectrodes pour la détection de molécules libérées par une cellule vivante
I. Généralités
II. Propriétés des interfaces chargées et des méthodes faradiques, inconvénients des électrodes usuelles
II.I. Courant faradique
II.II. Processus non faradiques
II.III. La chute ohmique
II.IV. Bilan
III. Propriétés des ultramicroélectrodes
III.I. Régime de diffusion d’une UME
III.II. Effets sur la constante de temps, la chute ohmique et le rapport signal sur bruit
III.II.1. Cas d’une ultramicroélectrode sphérique
III.II.2. Cas d’une ultramicroélectrode de type disque
III.II.3. Cas d’une ultramicroélectrode de type bande
III.III. Bilan
IV. Détection de biomolécules électroactives libérées par une cellule unique : configuration synapse « semi-artificielle »
IV.I. Synapse chimique
IV.II. Synapse « semi-artificielle »
IV.III. L’exocytose vésiculaire : nature des signaux et objectifs
IV.IV. Le stress oxydant : nature des signaux et objectifs
IV.IV.1. Stimulation mécanique
IV.IV.2. Stimulation biochimique
IV.V. Conclusion
PARTIE B : Mise au point du couplage de l’ampérométrie et de la microscopie de fluorescence pour l’étude de l’exocytose
I. L’exocytose vésiculaire
I.I. Mécanisme de l’exocytose
I.I.1. Généralités
I.I.2. Biogénèse et maturation des granules de sécrétion
I.I.3. Migration des granules de sécrétion vers la membrane plasmique
I.I.4. Accrochage des granules de sécrétion à la membrane plasmique
I.I.5. Fusion membranaire
I.II. Techniques analytiques utilisées : avantages et inconvénients
I.II.1. Technique électrophysiologique : le patch-clamp
I.II.2. L’ampérométrie
I.II.3. La microscopie optique
I.III. Originalité et intérêt de l’approche couplée
II. Développement des dispositifs pour le couplage
II.I. Contraintes expérimentales
II.II. Evolution et procédé de fabrication des dispositifs de couplage
II.II.1. Preuve de concept et premiers dispositifs
II.II.2. Evolution des dispositifs
II.III. Caractérisation électrochimique des dispositifs
II.III.1. Etude de l’influence du dépôt de collagène sur la détection électrochimique
II.III.2. Influence de la concentration de collagène
II.III.3. Influence de la vitesse de balayage
III. Choix d’un modèle cellulaire adéquat pour le couplage TIRFM/ampérométrie
III.I. Systèmes biologiques permettant l’étude de l’exocytose : intérêts et limites9
III.I.1. Les neurones
III.I.2. Les cellules hématopoïétiques
III.I.3. Les cellules endocrines
III.II. Etude ampérométrique des cellules BON
III.II.1. N13 et BC21 sans modification (ni transfection ni chargement)
III.II.2. N13 et BC21 non transfectées
III.II.3. N13 et BC21 transfectées VMAT1
III.II.4. N13 et BC21 électroporées en présence de sérotonine (N13/5-HT ; BC21/5-HT)
III.II.5. BC21 électroporées en présence de sérotonine sur électrode d’ITO
III.III. Rôle du modèle cellulaire pour le couplage : problématique du pH dans la bande cellule/électrode
III.III.1. Généralités
III.III.2. Modélisation du pH : le cas des cellules chromaffines
III.III.3. Modélisation du pH : le cas des cellules BON
IV. Fonctionnement des dispositifs de couplage
IV.I. Conditions expérimentales
IV.II. Démonstration de la faisabilité du couplage de l’ampérométrie et de la microscopie TIRF
IV.III.1. Analyse d’événements couplés
IV.III.2. Analyse des pics ampérométriques obtenus lors du couplage
IV.III. Couplage TIRFM/ampérométrie : conclusions des études sur cellules BON BC21
IV.III.1. Le couplage est-il viable pour d’autres modèles cellulaires que les BON ?
IV.III.2. Mise en regard de ce travail par rapport à la littérature
V. Conclusions et perspectives
PARTIE C : Mise au point d’un microsystème pour la mesure du stress oxydant
I. Le stress oxydant cellulaire
I.I. Production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de l’azote (RNS)
I.I.1. Les NADPH oxydases et l’anion superoxyde
I.I.2. Les NO synthases et le monoxyde d’azote
I.I.3. Réactions chimiques menant à la formation de ROS/RNS
I.II. Effets bénéfiques, néfastes, et régulation des ROS/RNS
I.II.1. Effets bénéfiques
I.II.2. Effets néfastes
I.II.3. Régulation des ROS/RNS
I.III. Etat de l’art de la détection des ROS/RNS
I.III.1. Détection des ROS/NOS par chimiluminescence
I.III.2. Détection des ROS/NOS par fluorescence
I.III.3. Détection des ROS/NOS par réaction avec des biomolécules
I.III.4. Détection des ROS/NOS par réaction de Griess
I.III.5. Détection des ROS/NOS par résonance de spin électronique (RSE)
I.III.6. Conclusion
I.IV. Détection électrochimique des ROS/RNS : principes et limites
I.IV.1. Détection électrochimique des ROS/RNS
I.IV.2. Détection des ROS/RNS par ampérométrie à potentiel constant
II. Améliorations de la mesure par microélectrode de carbone platinée sur cellule unique
II.I. Détection par chronoampérométrie à triple saut de potentiel des ROS/RNS produites par un macrophage immunostimulé
II.II. Intérêt des microsystèmes pour l’étude du stress oxydant
III. Fabrication des microsystèmes
III.I. Contraintes expérimentales
III.II. Procédé de fabrication des dispositifs
III.II.1. Preuve de concept et premiers dispositifs : historique
III.II.2. Evolution des dispositifs : but de cette thèse
III.III. Caractérisation électrochimique des dispositifs
III.III.1. Caractérisation de l’électrode de travail
III.III.2. Choix des potentiels de mesure
III.IV. Fonctionnement du dispositif
III.V. Conclusions et perspectives
Conclusion générale et Perspectives9
Partie D : Partie expérimentale
I. Fabrication des électrodes et des microsystèmes pour l’étude de l’exocytose et du stress oxydant
I.I. Fabrication des ultramicroélectrodes à fibre de carbone
I.I.1. Isolement de la fibre de carbone
I.I.2. Insertion de la fibre isolée dans un capillaire de verre
I.I.3. Fabrication de l’ultramicroélectrode de carbone
I.I.4. Isolation électrique des fibres de carbone
I.I.5. Polissage de la fibre de carbone
I.I.6. Platination de la surface active
I.II. Fabrication des dispositifs pour la détection couplée du mécanisme d’exocytose
I.II.1. Préparation du substrat
I.II.2. Création des électrodes
I.II.3. Isolation électrique des électrodes
I.II.4. Connexion électrique des électrodes
I.II.5. Traitement du dispositif
I.III. Fabrication des microsystèmes pour l’étude du stress oxydant
I.III.1. Création des électrodes
I.III.2. Chloration des électrodes de référence
I.III.3. Connexion électrique des électrodes
I.III.4. Préparation des canalisations
II. Techniques analytiques utilisées pour l’étude de systèmes biologiques
II.I. Techniques électrochimiques
II.I.1. La voltammétrie
II.I.2. L’ampérométrie à potentiel constant
II.I.3. Les électrodes de référence
II.II. Technique optique : la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM)
II.III. Mesure de l’exocytose
II.III.1. Détection de la sérotonine lors de l’exocytose des cellules BON par ampérométrie sur UME de carbone
II.III.2. Etude de l’exocytose des cellules BON par le couplage de l’ampérométrie sur UME d’ITO et de la microscopie TIRF
II.IV. Mesures du stress oxydant dans un microsystème
III. Culture cellulaire et préparation des solutions
III.I. Culture cellulaire
III.I.1. Culture des cellules BON
III.I.2. Culture des macrophages RAW 264.7
III.I.3. Congélation et décongélation des cellules
III.II. Solutions et Milieux de cultures
III.II.1. Milieux de culture des cellules BON
III.II.2. Milieu de culture des macrophages
III.II.3. Tampons physiologiques
III.II.4. Solutions utilisées lors des expériences in vitro
III.II.5. Solutions de stimulation
Références bibliographiques

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