Soutenance mémoire
DONNEES SUR Dombeya macrantha (CORDEMOY, 1895)
Position systématique
La classification de Dombeya macrantha est la suivante :
Règne : PLANTAE
Sous-règne : TRACHEOBIONTA
Division : MAGNOLIOPHYTA
Classe : MAGNOLIOPSIDA
Sous classe : DILLENIIDAE
Ordre : MALVALES
Famille : MALVACEAE (ex – STERCULIACEAE)
Genre : Dombeya
Espèce : macrantha
Nom vernaculaire : Hafotsy
Description botanique Dombeya macrantha (figure 1, p. 9) est un arbuste de 1-4 m de hauteur. Les jeunes rameaux sont arrondis, densément velus fauves ou roussâtres. L’écorce, gris noir, est velue pubescente puis glabrescente pourvue de lenticelles brunes très inégales saillantes peu distinctes. Les feuilles sont à limbe ovale, cordé à la base, aigu au sommet, à marges dentées ou irrégulièrement crénelées, discolores, densément velu-hispides et fauves ou ferrugineuses en dessous, plus ou moins bullées et velues pubescentes ou glabrescentes en dessus ; pétiolées, à stipules caduques. Les fleurs sont axillaires, solitaires pédicellées ; le calice est 5-fide, à lobes ovales longuement acuminés, dressés, épais, velus en dehors et glabres en dedans ; les pétales sont obovales ou subelliptiques, les étamines sont groupées en 5 faisceaux alternant avec 5 staminodes, l’ovaire est ovoïde. Le fruit est capsulé subglobuleux densément et longuement soyeux hispide et fauve.
Répartition géographique Dombeya macrantha pousse dans le centre de Madagascar et est présente dans les régions d’Amoron’i Mania et du Vakinakaratra (figure 2).
Utilisation empirique La fibre d’écorce de Dombeya macrantha est utilisée pour confectionner des cordes d’attache et les feuilles comme papier hygiénique pour les populations locales. La plante entière est ornementale (ARENES, 1959).
Méthodes d’extraction
Extraction à froid La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique) suivant le rapport 1/10 P/V (c’est-à-dire 1 g de poudre dans 10 ml de solvant). Le mélange est soumis à une agitation magnétique pendant 3 h à la température ambiante puis laissé macérer au réfrigérateur pendant une nuit. Le macérat est de nouveau agité pendant 30 min puis filtré sur quatre épaisseurs de gaze. Le filtrat est centrifugé à 10000 tours/min (centrifugeuse Hettich Universel II) pendant 15 min. Le surnageant est récupéré, concentré) pour avoir le rapport 1/1 (P/V, méthode de concentration, § 2.2.3. p. 15
Extraction à chaud La poudre végétale est mise en suspension dans de l’eau distillée ou de l’éthanol absolu dans le rapport 1/10 (P/V). Le mélange est chauffé sous agitation magnétique à 96°C pendant 3 h. Après refroidissement, il est mis à macérer à +4°C pendant une nuit. Le macérat est à nouveau agité pendant 30 min à la température ambiante. La suite des manipulations est identique à celle de l’extraction à froid.
EXTRAITS OBTENUS
A l’aide de différents solvants (ED, mélange hydroéthanolique 75% et éthanol absolu), des extractions à chaud et à froid ont été effectuées à partir de la poudre des pétales de fleurs. La toxicité des extraits obtenus a été évaluée à l’aide de tests sur souris (voir méthode au § 2.2.1, p. 29) et sur microorganismes (voir méthode au § 2.2.3, p. 30).
Extraits bruts à froid
1 Extraits brut aqueux : Dix grammes de poudre de pétales de fleurs ont été délayés dans 100 ml d’ED. La suite de la manipulation est décrite au § 2.2.1.1 (p. 13). A partir de cette poudre, un extrait brut aqueux à froid de volume 10 ml (rapport 1/1, P/V), de couleur marron est obtenu. Il est visqueux et son pH égal à 5.
2 Extrait brut hydroéthanolique : Dans un mélange hydroéthanolique 75% de volume 100 ml, 10 g de poudre de pétales de fleurs ont été mis en suspension ; voir : § 2.2.1.1 (p. 13). Cette extraction donne 10 ml d’extrait brut hydroéthanolique de couleur orange, d’aspect limpide et de pH égal à 4.
Extraits à chaud
1 Extraits brut aqueux : L’extraction a été effectuée à partir de 10 g de poudre de pétales de fleurs qui ont été délayés dans 100 ml d’ED. La suite des opérations est décrite au § 2.2.1.2 (p. 13). 10 ml d’un extrait brut aqueux à chaud de couleur marron foncé, visqueux et de pH égal à 3,5 ont été obtenus.
2 Extrait brut éthanolique : Dix grammes de poudre de pétales des fleurs ont été délayés dans 100 ml d’éthanol absolu (voir § 2.2.1.2 p. 13). Un extrait brut éthanolique de volume 10 ml, de couleur orange, d’aspect limpide et de goût légèrement amer a été obtenu. Son pH est égal à 3,5. Injectés aux souris, ces différents extraits bruts ont provoqué des symptômes d’intoxication mais ne se sont pas montrés létaux (voir § 3.1.1, p. 33). Les résultats des tests d’activité antimicrobienne ont montré que les extraits bruts à froid n’inhibent pas la croissance des germes-tests (voir tableau 5, p. 35). L’extrait aqueux à chaud a agi sur Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes en donnant respectivement des halos d’inhibition de diamètres 10 mm, 12 mm et 9 mm. Par contre, l’extrait brut éthanolique à chaud a montré une activité sur tous les germes testés sauf Pseudomonas aeruginosa. Pour la suite de nos manipulations, nous avons choisi l’extrait brut éthanolique car d’après ces résultats, il est le plus actif sur les microorganismes. Il a été appelé EB pour la suite des travaux.
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
L’étude chimique des pétales de fleurs a montré qu’ils renferment des molécules douées d’activités biologiques dont l’activité antimicrobienne. Parmi les quatre extractions (§ 2.2.1, p. 13) réalisées sur les pétales de fleurs, l’extraction éthanolique à chaud a été retenue pour la suite des manipulations car l’extrait brut correspondant est le plus actif sur les microorganismes. L’EB a été dialysé contre de l’ED. Le dialysat (Ed) et l’adialysat (Ead) issus de ce fractionnement ont montré des activités biologiques mais l’Ed s’est avéré le plus actif surtoutsur les bactéries. Le rendement de ce dernier par rapport l’EB est de 91,66%, et le rendement en toxines de 1,46%. Ce rendement en toxines est inférieur à celui de l’extrait purifié des feuilles de Dombeya macrantha qui est de 4,185% (MARINA, 2015) mais supérieur à celui de l’extrait antibactérien des feuilles de Psoropermum androsaemifolium qui est de 0,59% (RAHERIMANAMPAMONJY, 2010). L’Ead a un très faible rendement, 6,25% par rapport à l’EB et 0,1% par rapport à la poudre végétale. Toutefois, lors de l’étude microbiologique, il s’est montré actif sur une souche bactérienne (Staphylococcus pneumoniae). Il serait donc intéressant de le purifier car son faible rendement pourrait indiquer qu’il aurait peu de contaminants.Lors de la CCM, il été remarqué que dans l’Ed et l’EB, certaines molécules ont migré mais d’autres sont restées sur l’origine. Ces dernières n’auraient donc pas une affinité pour le système de solvants utilisé. Aucune migration n’a été observée avec l’Ead, il serait probablement constitué de molécules n’ayant pas d’affinités pour le système de solvants B/A/E (40/20/20, P/P/P). Les principes actifs des pétales de fleurs de Dombeya macrantha sont thermostables. Les opérations de congélation et de décongélation répétées n’affectent pas la toxicité des extraits. Ils sont en outre solubles dans les solvants polaires tels que l’eau, le méthanol et l’éthanol. D’après le criblage phytochimique, la poudre des pétales de fleurs et l’EB montrent qu’ils sont composés essentiellement de flavonoïdes, de leucoanthocyanes, des stérols insaturés, de polyphénols et de triterpènes. Les polyphénols et les triterpènes ont été éliminés lors de l’étape de dialyse car l’Ed ne contient plus que des flavonoïdes, des leucoanthocyanes et des stérols insaturés. D’après la littérature, ces composés seraient doués d’activité antimicrobienne (BRUNETON, 1993). Par comparaison, l’extrait purifié des feuilles de Dombeya macrantha (MARINA, 2015) a une composition légèrement différente car il renferme des alcaloïdes, des tanins et polyphénols et des stérols insaturés. En résumé, les pétales de fleurs de Dombeya macrantha contiendraient des principes actifs qui pourraient être des flavonoïdes, des leucoanthocyanes ou des stérols insaturés
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
En conclusion, nos travaux sur les fleurs de Dombeya macrantha, bien qu’ils soient préliminaires, nous ont permis de :
mettre en évidence une activité toxique des pétales de fleurs sur divers organismes, animaux à sang chaud, animaux à sang froid et microorganismes ;
mettre au point une technique d’extraction et de purification des principes toxiques ;
déterminer la nature chimique, les propriétés physico-chimiques et biologiques des principes toxiques ;
L’ensemble de ces travaux permet de conclure que notre extrait pourrait être exploité comme un antibiotique et un antioxydant non létal pour les Mammifères. Pour perfectionner et approfondir ces travaux préliminaires, nous envisageons dans l’avenir de :
améliorer les techniques d’extraction et purification en vue d’obtenir un meilleur rendement ;
isoler les principes actifs afin de mieux étudier leur propriétés physico-chimiques, leur nature et leur structure chimique et les comparer à ceux des feuilles ;
élargir le champ d’investigation sur d’autres organismes vivants animaux, végétaux et une plus grande variété de microorganismes pour bien étudier les propriétés biologiques ;
pousser les travaux sur l’activité antioxydante afin de déterminer l’EC50.
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Table des matières
REMERCIEMENTS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ABREVIATIONS
GLOSSAIRE
1 INTRODUCTION GENERALE
2 SYNTHESE BIBILIOGRAPHIQUE
II.1. GENERALITES SUR LA FAMILLE DES MALVACEAE
II.2. GENERALITES SUR LES Dombeya
II.2.1. Utilisations des Dombeya
II.3. DONNEES SUR Dombeya macrantha
II.3.1. Position systématique
II.3.2. Description botanique
II.3.3. Répartition géographique
II.3.4. Utilisation empirique
Première partie ETUDE CHIMIQUE
1 INTRODUCTION
2 MATERIELS ET METHODES
2.1 MATERIELS
2.1.1 Matériel végétal
Récolte et préparation du matériel végétal
2.1.2 Produits chimiques
2.2 METHODES
2.2.1 Méthodes d’extraction
2.2.1.1 Extraction à froid
2.2.1.2 Extraction à chaud
2.2.2 Méthode de purification
2.2.2.1 Dialyse
2.2.3 Méthode de concentration
2.2.3.1 Calcul des rendements
2.2.4 Méthodes analytiques5
2.2.4.1 Chromatographie sur couche mince
2.2.5 Méthodes de criblage phytochimique
2.2.5.1 Préparation des extraits
2.2.5.2 Méthodes de détection
3 RESULTATS
3.1 EXTRAITS OBTENUS
3.1.1 Extraits bruts à froid
3.1.1.1 Extraits brut aqueux
3.1.1.2 Extrait brut hydroéthanolique
3.1.2 Extraits à chaud
3.1.2.1 Extraits brut aqueux
3.1.2.2 Extrait brut éthanolique
3.2 PURIFICATION DE L’extrait brut Ethanolique
3.3 Rendements
3.4 ANALYSE DES EXTRAITS
3.5 CARACTERISATION CHIMIQUE
3.5.1 Propriétés physico-chimiques
3.5.2 Nature chimique
4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Deuxième partie ETUDE TOXICOLOGIQUE
1 INTRODUCTION
2 Matériels et méthodes
2.1 Matériels
2.1.1 Les animaux d’expérimentation
2.1.1.1 Les animaux à sang chaud
2.1.1.2 Les animaux à sang froid
2.1.2 Matériels de microbiologie
2.1.2.1 Les microorganismes
2.1.2.2 Milieux de culture
2.1.2.3 Les disques d’antibiogramme
2.2 Méthodes
2.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang chaud : les souris
2.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang froid : les larves de moustique
2.2.3 Méthodes d’étude des effets sur les microorganismes
2.2.3.1 Stérilisation des matériels
2.2.3.2 Etude de l’activité antibactérienne
2.2.4 Tests d’activité antioxydante (test au DPPH)
2.2.4.1 Définitions
2.2.4.2 Mode opératoire
3 RESULTATS
3.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX
3.1.1 Effets des extraits sur les souris
3.1.2 Effets des extraits sur les larves de moustique
3.1.3 Effets des extraits sur les microorganismes
3.1.3.1 Test d’antibiogramme : Extraits bruts
3.1.3.2 CMI et CMB de l’extrait brut éthanolique à chaud
3.1.3.3 Test d’antibiogramme du dialysat, de l’adialysat et de l’extrait brut éthanolique
3.1.4 Activité antioxydante
4 DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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