EXTRAITS DE GRAINES DE Ravenala madagascariensis Sonn. (STRELITZIACEAE)

Description de la famille des STRELITZIACEAE

                          La famille est composée de trois genres et sept espèces : Strelitzia (5 espèces), Ravenala (une espèce) et Phenakospermum (une espèce). Ces trois genres se trouvent respectivement en Afrique du sud, à Madagascar et en Amérique du sud. Les caractères les plus remarquables de la famille des STRELITZIACEAE consistent d’abord en la présence d’un tronc ligneux. Ensuite, le périanthe est constitué de trois sépales libres, les pétales sont au nombre de trois dont deux fusionnent et enveloppent les cinq (ou six chez Ravenala) étamines fertiles. Enfin, les fruits ligneux capsulaires sont  loculicides (KRESS, 1990). La famille des STRELITZIACEAE est considérée comme étant la plus primitive des huit familles qui constituent l’ordre des ZINGIBERALES. En effet, la présence du stipe constitue un caractère primitif.

Description botanique de Ravenala madagascariensis Sonn. (CABANIS et CHABOUIS, 1970)

                     Ravenala madagascariensis Sonn. (figure 1, p. 8) est une plante à port de bananier pourvue d’un immense éventail de feuilles. En général, cette espèce est composée :
• d’un stipe droit, simple cylindrique (10 – 15 m de haut), portant les cicatrices des feuilles ;
• de 15 à 25 feuilles terminales alternes, comprimées imbriquées, formant un parfait éventail ;
• d’un pétiole engainant, jaunâtre, formant une longue hampe courbée gracieusement ;
• d’un limbe vert tendre à la naissance, devenant grisâtre argenté, simple, entier, lancéolé, aussi long que le pétiole, à ourlet rouge constitué de cellules géantes, visibles à la loupe, présentant de petites étoiles blanchâtres, gras et cireux au toucher.
La nervation est pennée, les nervures secondaires parallèles entre elles, formant un angle constant avec la nervure principale. Les limbes âgés sont lacérés par le vent suivant les nervures secondaires et cette multitude de franges vibre au moindre souffle. L’appareil reproducteur est composé d’une inflorescence axillaire, comprimée. Il y a 4 à 8 inflorescences par arbre, s’épanouissant à partir de la base. Chaque inflorescence se compose de 6 bractées vertes puis jaunes engainantes, densément imbriquées, étalées sur un même plan et presque perpendiculaires à l’axe. Chaque bractée abrite une série de petites bractées blanches groupées en fuseau. Des fleurs blanches dépassent et s’épanouissent successivement de l’attache vers le sommet de la bractée. La floraison a lieu essentiellement pendant la saison chaude. Après la fécondation, les parties supérieures de la fleur tombent par gélification d’une bande située juste au-dessus de l’ovaire. Le fruit est une petite banane jaunâtre, fibreuse, sèche et déhiscente. A maturité, c’est une capsule s’ouvrant par trois fentes. Elle contient des graines à tégument rougeâtre, enveloppées d’un arille bleu électrique. L’arille est le tégument issu de l’ovule, se développant près du hile et enveloppant la graine.

Réactions de détection des familles chimiques (BRUNETON, 1993; MOGODE, 2005)

                    La détection des familles constitue le screening ou criblage phytochimique. C’est une étude basée :
• soit sur la formation de complexes insolubles : réactions de précipitation ;
• soit sur la formation de complexes colorés : réactions de coloration.
La coloration observée est due généralement à la formation de liaisons conjuguées ou l’apparition d’une insaturation dans une molécule, sous l’effet d’un réactif approprié. Différents extraits préparés selon les méthodes décrites ci-dessous sont utilisés pour les tests de détection des diverses familles de substances.
Préparation des différents extraits
a) Extrait aqueux : Un gramme de poudre de graines ou de résidu d’évaporation à sec d’extrait à tester est délayé dans 20 ml d’eau distillée. Le mélange obtenu est chauffé jusqu’à ébullition puis laissé refroidir. Le décocté est filtré et le filtrat ainsi obtenu constitue l’extrait aqueux
b) Extrait hydroéthanolique : La poudre ou le résidu d’évaporation à sec de l’extrait pesant 1 g est mise en suspension dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75%. Le mélange est laissé macérer pendant une nuit à +4°C, puis filtré. Le filtrat ainsi obtenu correspond à l’extrait hydroéthanolique.
c) Extrait chloroformique : Un gramme de poudre ou de résidu d’évaporation à sec est délayé dans 10 ml de chloroforme. L’ensemble est laissé macérer pendant une nuit, puis filtré après agitation. Le filtrat constitue la solution chloroformique.
d) Extrait acide : La poudre ou le résidu d’évaporation à sec pesant 1 g est laissée macérer pendant une nuit dans 10 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N. Le liquide obtenu après filtration du macérat constitue l’extrait acide.
Réactions caractéristiques (CORDELL, 1981 ; HEMINGWAY et KARCHESY, 1989 ; BRUNETON, 1993 ; RANARIVELO, 2006)
a) Détection des alcaloïdes: Les alcaloïdes sont des substances azotées, surtout d’origine végétale, rarement d’origine animale (on connaît les alcaloïdes des peaux des grenouilles du genre Mantella, de la famille des Dendrobatideae). Tous les alcaloïdes présentent des propriétés alcalines plus ou moins marquées et forment des sels avec les acides (sulfates, chlorhydrates,…). Ils peuvent aussi précipiter les hydrates de métaux lourds tels que le bismuth, le mercure, le tungstène, l’iode, leur permettant ainsi d’adopter une structure d’ammonium quaternaire. Tests : Quatre tubes à essai sont nécessaires pour la manipulation. Ils contiennent chacun 0,5 ml d’extrait acide. Les trois premiers sont utilisés respectivement pour les tests de Mayer, de Dragendorff et de Wagner, le quatrième tube sert de témoin.
Protocole expérimental :
Test de Mayer : le premier tube contenant l’extrait acide est additionné de 4 à 5 gouttes de réactif de Mayer. La présence d’alcaloïdes dans l’extrait est démontrée par l’apparition d’un précipité ou d’une floculation après addition du réactif.
Test de Dragendorff : dans le deuxième tube, 4 à 5 gouttes de réactif de Dragendorff sont ajoutées dans l’extrait à tester. La présence d’alcaloïdes dans l’extrait est révélée par l’apparition d’un précipité ou d’une floculation.
Test de Wagner : La formation d’un précipité dans le troisième tube montre la présence d’alcaloïdes dans l’extrait, après ajout de 4 à 5 gouttes de réactif de Wagner.
Test de confirmation : Pour confirmer la présence des alcaloïdes dans l’extrait, un test de confirmation à l’éthanol est nécessaire. Ainsi, les réactions de détection des alcaloïdes sont dites positives, si et seulement si le précipité formé dans chaque tube est soluble dans l’éthanol 80% de volume 0,5 ml.
b) Détection des flavonoïdes : Les flavonoïdes sont largement distribués dans le règne végétal : chez les Bryophytes, les Ptéridophytes ou les organes jeunes des Angiospermes où ils sont très abondants
Test à la cyanidine : Les composés flavoniques sont réduits en présence d’un acide concentré et de magnésium. Après élimination d’une molécule d’eau, le produit de réduction conduit à des anthocyanidines de couleur rouge.
Protocole expérimental : L’extrait hydroéthanolique est réparti dans 4 tubes à essai. Le premier sert de témoin et les 3 autres sont utilisés pour les 3 tests (test de Wilstater, test de Wilstater modifié, test de Bate-Smith):
• test de Wilstater : 0,5 ml de HCl 12,07 N et deux ou trois tournures de magnésium sont ajoutés dans 1 ml d’extrait hydroéthanolique. Le changement de coloration est observé : virage au rouge pour les flavones, virage au rouge pourpre pour les flavonols, rouge violacé pour les flavanones et flavanols ;
• test de Wilstater modifié : le protocole expérimental est le même mais avec ajout de 1 ml d’eau distillée et 1 ml d’alcool isoamylique. C’est la coloration de la phase supérieure qui est alors notée : rouge pour les flavones, rouge pourpre pour les flavonols, rouge violacé pour les flavanones et flavanols ;
• test de Bate-Smith : dans le quatrième tube, 0,5 ml de HCl 12,07 N est ajouté. La solution est chauffée dans un bain-marie à 100°C pendant 30 min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge ou rouge-violacé marque la présence de leucoanthocyanes.
c) Détection des tanins : Ce sont des composés phénoliques hydrosolubles ayant un poids moléculaire situé entre 500 et 3000 et la propriété de précipiter les protéines comme la gélatine. On distingue deux types de tanins :
• tanins hydrolysables : polyesters de glucose et d’acide phénolique. Ils sont caractéristiques des Dicotylédones. Exemple : tanin gallique, pentagalloylglucose ;
• tanins non hydrolysables (ou proanthocyanidols condensés) : ce sont des polymères d’unités flavanniques le plus souvent liées entre elles par des liaisons C4-C8. Ils sont surtout présents chez les Ptéridophytes et les Gymnospermes. Pour les tests de caractérisation, l’extrait aqueux est utilisé. Il est réparti dans 4 tubes à essai dont le quatrième sert de témoin.
Tube n°1 : 5 gouttes de gélatine 1% sont ajoutées à 0,5 ml d’extrait aqueux. L’apparition d’une floculation blanche indique la présence de tanins.
Tube n°2 : l’extrait aqueux de volume 0,5 ml est testé avec 5 gouttes de gélatine salée. La formation d’un précipité dénote la présence de tanins.
Tube n°3 : 5 gouttes d’une solution méthanolique de FeCl3 sont ajoutées à 0,5 ml d’extrait aqueux. Une coloration :
• bleu-vert ou vert-noir est due aux tanins du type catéchols ;
• noir-bleuâtre signifie qu’il y a présence de tanins de type pyrogallols ;
• une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration verte ou bleu-noir avec FeCl3 est due à la présence d’autres types de composés phénoliques.
d) Criblage des triterpènes et stéroïdes : Les triterpènes sont des composés formés de 6 unités isoprène (C5H8); ils sont très répandus, notamment dans les résines et se trouvent à l’état libre, estérifiés ou sous forme hétérosidiques. Les stéroïdes sont des triterpènes tétracycliques qui ont perdu au moins trois radicaux méthyles. Ils ont un squelette « cyclopentanoperhydrophénanthrène », avec une chaîne latérale fixée en C17. Les stérols sont des alcools secondaires, dérivés du cholestanol (5- -cholestane, 3- -ol). Les stéroïdes se trouvent chez les végétaux : sous forme d’esters (les stérides) ou combinés à des sucres sous formes d’hétérosides. Les génines rencontrées dans les stéroïdeshétérosidiques sont caractérisées par des hydroxyles en 3 et 14. Les cardénolides et bufadiénolides sont des stéroïdes lactoniques, le cycle lactonique insaturé étant fixé en C17 (hétérosides cardiotoniques). Protocole expérimental : L’extrait utilisé est l’extrait chloroformique, qui est réparti dans 4 tubes à essai, le quatrième tube servant de témoin.
• Tube n°1 : test de Salkowski: le tube est incliné à 45°, puis 1 à 2 ml d’acide sulfurique (H2SO4) 4 N est ajouté. Le changement de coloration est noté immédiatement. Le mélange est légèrement agité et le changement graduel de coloration est noté : une coloration rouge indique la présence de stérols insaturés ;
• Tube n°2 : test de Liebermann-Burchard : à 1 ml d’extrait chloroformique, sont ajoutées 4 gouttes d’anhydride acétique et 1 ml de H2SO4 4N. Après 1 h, il apparaît à l’interface un anneau rouge-violet en présence de triterpènes tandis que la phase supérieure vire au bleu-vert en présence de stéroïdes.
• Tube n°3 : test de Badjet-Kedde : quelques grains d’acide picrique sont ajoutés. L’apparition d’une coloration orange est due aux stéroïdes lactoniques.
e) Détection des désoxyoses (Test de Keller-Kiliani) : A 0,5 ml d’extrait aqueux sont ajoutés successivement 0,5 ml de chlorure ferrique 10% et 0,5 ml d’acide acétique glacial. Le tube est incliné à 45°, puis on y verse 0,5 ml de H2SO4 4 N concentré. La formation d’un anneau pourpre à l’interface est caractéristique de la présence de désoxyoses.
f) Détection des saponosides : Ce sont des hétérosides à génine stéroïdique ou triterpénoïdique. Les sapogénines stéroïdiques sont généralement caractéristiques des Monocotylédones tandis que les sapogénines triterpéniques sont largement distribuées chez des Dicotylédones. Ils sont caractérisés par des propriétés physiques et physiologiques telles que:
• le pouvoir moussant en solution aqueuse, dû à la fois à la partie osidique hydrosoluble et à la génine hydrophobe ;
• l’effet hémolytique ;
• la toxicité pour les animaux à sang froid.
Test de mousse : un volume de 1 ml d’extrait aqueux est utilisé, le tube contenant l’extrait est agité vigoureusement pendant 30 s de manière à faire apparaître une mousse. Le tube est alors placé verticalement pendant 30 min. Au bout de cette période, si la mousse mesure 3 cm ou plus, le test s’avère positif.
g) Détection des irridoïdes : A 0,5ml d’extrait aqueux sont ajoutées quelques gouttes de HCl 12,07 N. Le mélange est porté au bain-marie bouillant pendant 30 min. La formation d’un précipité ou d’une coloration vert foncé ou bleu foncé traduit la présence d’irridoïdes.
h) Détection des anthraquinones (Test de BORNSTRÄGER) : Un millilitre de benzène est ajouté à 0,5 ml d’extrait aqueux. Après agitation, le mélange est laissé au repos. Puis, l’extrait benzénique est transféré dans un tube à essai et additionné de 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25%. Le mélange est agité. Une coloration rouge de la phase alcaline indique la présence d’anthraquinones.

Technique de diffusion en milieu solide (CHABERT, 1985)

                  En milieu solide, la CMI correspond à la plus faible concentration de l’extrait qui provoque l’apparition d’un halo d’inhibition. Le mode opératoire est le même que celui décrit au paragraphe 2.1.2.2. (p. 35). Mais ici, les disques stériles d’antibiogramme sont imprégnés des différentes concentrations d’extraits à tester, à raison de 10 µl par disque, pour pouvoir estimer la CMI. L’activité antibactérienne a été déterminée en mesurant, à l’aide d’une règle transparente, le diamètre de la zone d’inhibition provoquée par les différentes concentrations des extraits à étudier autour des disques. La CMI correspond à la plus faible concentration de l’extrait donnant un halo dont le diamètre est supérieur ou égal à 7 mm.

DISCUSSION ET CONCLUSION

                     Les résultats obtenus dans l’étude biologique montrent que les extraits acétate d’éthyle, méthanol et aqueux des graines de Ravenala madagascariensis Sonn. venant de l’Est et de l’Ouest ont des effets antibactériens. De plus, l’extrait méthanol s’est avéré faiblement toxique sur souris et possède une activité antioxydante intéressante. Sur la souris, l’administration par voie ip de l’extrait méthanol ou de l’extrait aqueux à une dose élevée (1,2 g/kg de poids) provoque des symptômes d’intoxication caractérisés essentiellement par une diminution de l’activité motrice, puis une immobilité suivie de la mort. L’ensemble de ces réactions permet de supposer une atteinte du système nerveux par les principes toxiques. Les souris arrivent à se remettre des effets de l’extrait hexane et acétate d’éthyle même s’ils présentent quelques symptômes d’intoxication. Des activités antibactériennes ont été mises en évidence pour les différents extraits de Ravenala madagascariensis. Elles sont en général similaires pour la plante de l’Est et la plante de l’Ouest. Les extraits acétate d’éthyle ont présenté une activité antibactérienne avec des diamètres des zones d’inhibition atteigant 25 mm. L’activité la plus élevée de ces extraits a été remarquée vis-à-vis de la souche Vibrio fischeri (GRAM-). La valeur moyenne de l’auréole d’inhibition était de 22 mm. Alors que contre la souche Bacillus cereus (GRAM+), la zone d’inhibition était de 16 mm en moyenne. La CMI de l’extrait acétate d’éthyle des graines de l’Est sur milieu solide est estimée entre 1,56 mg/ml à 0,78 mg/ml sur Vibrio fischeri et entre 12,5 mg/ml à 6,25 mg/ml sur Bacillus cereus. Parmi les 17 fractions issues de la chromatographie flash sur colonne sèche de cet extrait, seules les fractions 1 à 6 sont actives sur Vibrio fischeri et les fractions 1 à 4 sur Bacillus cereus. Ce qui permet de dire que les principes responsables de l’activité antibactérienne sont contenus dans ces fractions et que la chromatographie a permis d’éliminer les contaminants dans les autres fractions. Aucun des extraits testés n’a montré d’effet sur Pseudomonas aeruginosa, Salmonella antarctica et Salmonella typhimurium. Ces souches possèdent un potentiel de résistance très élevé contre nos extraits. Les extraits hexane se sont montrés inactifs sur toutes les souches de bactéries testées. Les extraits méthanol et aqueux ont montré des activités faibles par rapport aux extraits acétate d’éthyle. Des zones d’inhibition ont été enregistrées mais de diamètre inférieur à 17 mm avec : Staphylococcus aureus (12 mm), Escherichia coli (11 mm), Vibrio harveyi (14 mm), Vibrio fischeri (16 mm), Bacillus cereus (12 mm) et Bacillus megaterium (10 mm). L’étude du pouvoir antioxydant de l’extrait méthanol par la méthode de DPPH a permis de montrer ses puissantes propriétés à piéger les radicaux libres avec une EC50 de 8,24 µg/ml. Par comparaison, L’EC50 de l’extrait flavonoïdique de Lavandula stoechas (LAMIACEAE) est de 5,29 µg/ml et celui de Smyrnium olusatrum (APIACEAE) est de 9,68 µg/ml, ces extraits étant classés comme bons antioxydants (MOUAMEDI, 2006). En effet, les bons antioxydants mentionnés ont généralement un EC50 inférieure à 10 µg/ml (CAMARASA et coll., 1982 ; BIARA et coll., 2001 ; AQUINO et coll., 2001 ; AQUINO et coll., 2002 ; CHEN et coll., 2002 ; FLENGLIN et coll., 2003 ; FISH et coll., 2003 ; ODABASOGLU et coll., 2004). Néanmoins, cette activité est inférieure à celle de la molécule de référence utilisée qui est l’acide ascorbique dont l’EC50 est de 2,39 µg/ml. En résumé, l’extrait hexane ne possède pas une activité biologique appréciable ; l’extrait acétate d’éthyle est plus antibactérien que toxique ; l’extrait méthanol, présente une forte activité antioxydante ; l’extrait aqueux possède une faible activité antibactérienne. Tous ces extraits montrent une faible toxicité sur souris.

Table des matières

DEDICACE
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Matériels
II.1.1. La plante
II.1.1.1. Position systématique
II.1.1.2. Description de la famille des STRELITZIACEAE
II.1.1.3. Description botanique de Ravenala madagascariensis
II.1.1.4. Répartition géographique
II.1.1.5. Utilisations
II.1.1.5.1. En médecine traditionnelle
II.1.1.5.2. En alimentation
II.1.1.5.3. Autres utilisations
II.1.1.6. Date et lieu de récolte
II.1.1.7. Préparation et conservation du matériel végétal
II.1.2. Les produits chimiques
II.2. Méthodes
II.2.1. Méthodes d’extraction
II.2.1.1. Epuisement par le n-hexane
II.2.1.2. Epuisement par l’acétate d’éthyle
II.2.1.3. Epuisement par le méthanol
II.2.1.4. Epuisement par l’eau distillée
II.2.2. Chromatographie flash sur colonne sèche
II.2.2.1. Principe
II.2.2.2. Préparation de la colonne
II.2.3. Méthode de concentration
II.2.4. Méthodes d’analyse
II.2.4.1. Réactions de détection des familles chimiques
II.2.4.1.1. Préparation des différents extraits
a) Extrait aqueux
b) Extrait hydroéthanolique
c) Extrait chloroformique
d) Extrait acide
II.2.4.1.2. Réactions caractéristiques
a) Criblage des alcaloïdes
b) Détection des flavonoïdes
c) Détection des tanins
d) Détection des triterpènes et stéroïdes
e) Détection des désoxyoses
f) Détection des saponosides
g) Détection des irridoïdes
h) Détection des anthraquinones
II.2.4.2. Chromatographie sur couche mince
II.2.4.2.1. Principe
II.2.4.2.2. Mode opératoire
a) Préparation de la cuve
b) Préparation de la plaque et dépôt des échantillons
c) Développement
d) Révélation
III. RESULTATS
III.1. Extraction
III.2. Fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle
III.3. Criblage phytochimique
III.4. Analyse des extraits
III.4.1. Analyse des différents extraits issus de l’extraction à partir des deux sortes de graines
III.4.2. Analyse des différentes fractions obtenues par chromatographie flash sur colonne sèche de l’extrait acétate d’éthyle des graines de l’Est
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
DEUXIEME PARTIE : ETUDE BIOLOGIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Matériels
II.1.1. Les animaux d’expérimentation
II.1.2. Les souches bactériennes utilisées
II.1.3. Les milieux de culture
II.1.3.1. Milieux liquides
II.1.3.1.1. Bouillon nutritif
II.1.3.1.2. Milieu ZOBELL
II.1.3.2. Milieux solides
II.1.3.2.1. Milieu MARINE AGAR
II.1.3.2.2. Milieu de MUELLER-HINTON
II.1.4. Les disques pour antibiogramme
II.1.5. Les antibiotiques de référence
II.2. Méthodes
II.2.1. Méthode d’estimation de la toxicité aiguë sur souris
II.2.1.1. Principe
II.2.1.2. Mode opératoire
II.2.1.2.1. Préparation des différents extraits
II.2.1.2.2. Administration des extraits
II.2.2. Méthodes microbiologiques
II.2.2.1. Entretien, isolement et conservation des souches
II.2.2.2. Etude de la sensibilité des souches vis-à-vis des différents extraits
II.2.2.2.1. Principe
II.2.2.2.2. Mode opératoire
a) Préparation de l’inoculum
b) Ensemencement
c) Dépôt des extraits
d) Incubation
d) Lecture des résultats
II.2.2.3. Concentration minimale inhibitrice
II.2.2.3.1. Technique de diffusion en milieu solide
II.2.2.3.2. Technique de dilution en milieu liquide
a) Méthode macroscopique
b) Méthode spectroscopique
II.2.3. Méthode d’étude de l’activité antioxydante
II.2.3.1. Principe
II.2.3.2. Préparation de la solution de DPPH
II.2.3.3. Préparation de l’extrait à tester
II.2.3.4. Mode opératoire
II.2.3.5. Expression des résultats
III. Résultats
III.1. Effets des extraits sur souris
III.2. Effets des extraits sur les microorganismes
III.2.1. Evaluation de l’activité antibactérienne des différents extraits
III.2.2. Evaluation de l’activité antibactérienne des différentes fractions issues de la chromatographie flash sur colonne sèche
III.2.3. CMI sur milieu solide
III.2.4. CMI en milieu liquide
III.3. Activité antioxydante
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES D’AVENIR
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME
ABSTRACT

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