Extraction des produits naturels des bourgeons

Extraction des produits naturels des bourgeons

Identification des composés isolés

 Acides phénoliques 

Le composé 1 a été isolé de la fraction 2F (pic A, figure 5) avec un rendement de 7,0 %. Ce composé a été identifié comme étant l’acide coumarique (figure 11), un acide phénolique commun dans le genre Populus. En RMN *H, les deux doublets d’une intégration de 2H (6,83 et 7,45 ppm) indiquent que le cycle aromatique est substitué en para. La constante de couplage des protons oléfïniques (,8 Hz) suggère que la liaison double est de géométrie trans.
Le composé 10 a été isolé de la fraction 1F5 (pic A, figure 7) avec un rendement de 52 %. L’analyse RMN a rapidement permis d’identifier l’acide cinnamique (figure 12). Le ratio m/z de 8 est conforme avec cette structure molécule. Ce composé a déjà été répertorié dans cette espèce .
Ces deux acides n’ont pas été isolés dans la même fraction en raison de la différence de polarité engendrée par la présence du groupement hydroxyle en position 4, l’acide cinnamique étant moins polaire.

Dihydrochalone 

Le composé 2 a été isolé de la fraction 2F (pic C, figure 5) avec un rendement de 8,3 %. L’analyse attentive du spectre RMN *H révèle la présence de 3 signaux correspondant à des protons aromatiques (6 protons), de deux signaux correspondant à des groupes méthylènes ainsi qu’à un signal correspondant à un groupe méthoxyle.L’inspection du spectre C en combinaison avec l’information obtenu des spectres *H et HSQC révèle la présence de carbones sur la molécule : un carbone méthoxyle, deux carbones méthylènes, 6 carbones aromatiques tertiaires, 6 carbones aromatiques quartenaires (dont quatre oxygénés) et un carbone cétonique. À ce stade, il est possible d’envisager que la structure du produit s’apparente à une dihydrochalcone. La position du groupement OCH3 a été déterminée à partir de la corrélation HMBC entre les protons du  groupe méthoxyle avec le carbone aromatique oxygéné en position 4. La molécule a été identifiée, il s’agit du 2′,4′,6’4rihydroxy-4-méthoxydihydrochalcone (figure ). Cette molécule a déjà été identifiée dans l’espèce .Le composé 3 a également été isolé de la fraction 2F (pic D, figure 5). Les données  spectrales de RMN du composé 3 montrent une grande similitude avec celles du composé 2 mise à part l’absence du signal correspondant au groupement méthoxyle en position 4. La molécule a donc été identifiée comme étant le 2’54\6′-trihydroxydihydrochalcone (figure ). Le composé 3 a déjà été identifié dans le Populus trichocarpa .Le composé 11 a été isolé de la fraction 1F5 (pic B, figure 7) avec un rendement de 26 %. La seule différence structurale de cette dihydrochalcone avec la molécule 2 provient du groupement méthoxyle dont les protons corrèlent en HMBC avec le carbone aromatique oxygéné situé en position 4′ plutôt qu’en 2\ Cette molécule, le 2’54?6′-trihydroxy-4′ méthoxydihydrochalcone (figure ), a également été répertoriée dans le peuplier baumier.Les composés 12 et ont été isolés de la fraction 1F2-3 avec des rendements respectifs de 8,5 % et de 6,6 %. Une comparaison des spectres RMN démontre que les molécules isolées sont toutes deux des dihydrochalcones quasi-identiques. Le groupement OCH3 en position 4′ des deux molécules est probablement responsable de la différence de polarité entre les dihydrochalcones isolées précédemment. Le composé 12 possède un deuxième groupement méthoxyle qui est assignable par RMN. En effet, l’intégration, le déplacement chimique et la multiplicité des protons (3,73 ppm [s], 3H et 3,75 ppm [s], 3H) indique clairement, pour les deux signaux, un carbone primaire lié à un oxygène. De plus, malgré l’excellente résolution de l’appareil, l’expérience HSQC ne permet pas d’assigner précisément les carbones correspondant aux hydrogènes mentionnés ci-dessous, leurs déplacements chimiques étant juxtaposés sur le spectre. Heureusement, comme les deux groupements en question sont identiques (OCH3), l’extrapolation des informations obtenu permet tout de même d’identifier la molécule. Le composé 12 a été identifié comme étant le 2’6′-dihydroxy-4,4′-diméthoxydihydrochacone (figure ) et le composé comme étant le 2’6′-dihydroxy-45-méthoxydihydrochacone (figure ). Ces deux molécules sont répertoriées dans le Populus balsamifera.
La dernière dihydrochalcone a été isolée de la fraction 3F2-2B (pic 4, figure 9) Le composé , le 2′,4′,6\4 -tétrahydroxydihydrochalcone (figure ), également connu sous le nom de phlorétine. Cette molécule est différente de ses homologues par ses quatre groupements fonctionnels qui sont tous des hydroxyles. La phlorétine est déjà répertoriée dans le peuplier baumier .

Balsacone 

Les composés 4, 5 et 6 ont été isolés de la fraction 2F (pic E-G, figure 5) avec des rendements respectifs de 3,7 %, 5,7 % et 3,0 %.L’analyse des spectres RMN (tableau 5) du composé 4 révèle que le squelette de base est similaire à une chalcone. On peut d’abord déceler la présence d’un premier cycle aromatique avec deux substituants situés en para (Cl à C6). En effet, les signaux de RMN *H en position 2 (7,05 ppm) et en position 3 (6,69 ppm) apparaissent sous la forme de doublets intégrants pour 2H et une corrélation COSY permet de confirmer qu’ils sont sur des carbones voisins. Le carbone C4, déterminé grâce à sa corrélation HMBC avec le proton C2, est un carbone quaternaire aromatique oxygéné (8 C = 6,5 ppm). Le proton en C2 montre aussi une corrélation HMBC avec un carbone aromatique quaternaire possédant un déplacement chimique de 4,0 ppm (Cl). Ce dernier est lié à une chaîne aliphatique constitué des protons a et p puisque le proton de C2 corrèle en HMBC avec le carbone Cp. Les carbones a et p sont voisins puisqu’ils corrèlent en COSY et sont des carbones secondaires selon l’analyse DEPT 5. Une fonction carbonyle termine cette chaîne selon le spectre en HMBC et ce carbonyle est relié au carbone a car le signal de ses protons est le plus déblindé (3,31 ppm). L’analyse du cycle centrale démontre qu’un seul des six carbones est lié à un hydrogène (C5’3 91,2 ppm). La position des différents signaux sur le cycle central ont été assignés grâce aux corrélations HMBC. Cl’ s’aligne faiblement aux signaux *H de Coc et C5′ ce qui confirme que la chaîne formée du carbonyle, des deux méthylènes et du cycle aromatique substitué on para est liée au cycle central sur le carbone Cl’. Le proton situé sur C5′ corrèle avec deux carbones aromatiques oxygénés (2,4 ppm, 5,1 ppm) qui se retrouve donc de part et d’autre de C5\ La corrélation de C9″ (3,36 ppm) avec le carbone à 5,1 ppm permet d’assigner ce signal à C4′ et parconséquent d’assigner le signal à 2,4 ppm à la position C6′. L’hydrogène en 9″ est len seul à entrer en interaction avec les carbones à 4,0 ppm (position C2′) et à 107,7 ppm (position C3′). La chaîne de carbone C9″ à C7″ est visible avec l’expérience COSY. Les signaux *H de C7″ et C8″ sont très déblindés et possèdent une fréquence de ,6 Hz, ce qui est caractéristique d’un alcène de type trans. La caractérisation du dernier cycle s’effectue de la même façon que le premier cycle. Les différences entre chaque balsacone sont au niveau de la nature des groupements fonctionnels en C4, C4′ et C6\ Ces fonctions sont des alcools, des hydrogènes ou des méthoxyles.

Table des matières

1. CHAPITRE 1- INTRODUCTION 1
1.1 Problématique
1.2 Revue de littérature
1.2.1 Populus balsamifera
1.2.2 Composition chimique
1.2.3 Activités biologiques
1.2.4 Propolis
1.2.5 Notions sur le développement de résistance bactérienne face aux antibiotiques utilisés en clinique et approche utilisée généralement pour la découverte de nouveaux antibiotiques 10
2. CHAPITRE 2 – MÉTHODOLOGIE 12
2.1 Échantillonnage et préparation de l’extrait
2.2 Fractionnement primaire de l’extrait
2.2.1 Fractionnement de 2F par HPLC
2.2.1.1 Purification de 2F-H
2.2.2 Fractionnement de IF
2.2.3 Fractionnement de 3F
2.2.3.1 Fractionnement de la fraction 3F2-2
2.3 Considérations générales
2.3.1 Analyses HPLC
2.3.2 Analyses RMN
2.4 Activité biologique
2.4.1 Condition de croissance des cultures cellulaires
2.4.2 Analyses cytotoxiques
2.4.3 Analyses antibactériennes
2.4.4 Tests d’activité sur SARM
2.4.5 Diffusion du disque
3. CHAPITRE 3 – RÉSULTATS ET DISCUSSION 
3.1 Extraction des produits naturels des bourgeons
3.2 Fractionnement de l’extrait brut et évaluation de l’activité biologique des fractions
3.2.1 Fractionnement de 2F par HPL
3.2.1.1 Fractionnement de 2FH
3.2.2 Fractionnement de IF
3.2.2.1 Fractionnement de 1F2
3.2.2.2 Fractionnement de 1F5 par HPLC.
3.2.3 Fractionnement de 3F
3.2.3.1 Fractionnement de 3F2
3.2.3.1.1 Fractionnement de 3F2-2
3.3 Identification des composés isolés
3.3.1 Acides phénoliques (1,10)
3.3.2 Dihydrochalone (2-3,11-,)
3.3.3 Balsacone (4, 5 et 6)
3.3.4 Composés 7-9..
3.3.5 Flavonoïdes (-)
3.3.6 Autres pics
3.4 Activités biologiques
3.4.1 Activités cytotoxiques…,
3.4.1.1 Composés 7, 8 et 9
3.4.1.2 Balsacones
3.4.1.3 Autres composés
3.4.2 Activités antibactériennes
3.4.2.1 Composés 7, 8 et 9
3.4.2.2 Balsacones
3.4.2.3 Autres composés
3.4.3. Activités antibactériennes sur SARM
4. CHAPITRE4-CONCLUSION
4.1 Conclusions générales
4.2 Perspectives futures
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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