Soutenance mémoire
Extraction des composés fluorescents
Les anthères sont ajoutées dans un erlenmeyer de 250 mL contenant 200 mL de méthanol. L’erlenmeyer est bouché à l’aide d’un coton et d’un film paraffine et la solution est mise sous agitation à température ambiante pendant plusieurs jours. Le coton alors obtenu après plusieurs jours en présence des vapeurs de la solution méthanolique possède une fluorescence intense. Il est utilisé dans le test N°3. La solution est ensuite versée dans un ballon monocole de 500 mL de façon délicate afin de ne pas introduite le matériel végétal solide. Un volume de 200 mL est à nouveau introduit dans l’erlenmeyer afin de réaliser une deuxième extraction. Trois extractions successives sont généralement nécessaires et la solution n’est plus fluorescente à partir de la quatrième extraction. Le méthanol est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif et l’opération est arrêtée quand un volume de 50 mL est atteint. La solution est prélevée à l’aide d’une seringue de 20 mL qui une fois remplie est surmontée d’un filtre circulaire de 0,45 µm. Le filtrat est introduit dans un ballon monocole de 50 mL puis le solvant est évaporé pour obtenir la masse de l’extrait sec.
Séparation des composées sur colonne chromatographique de silice
Le produit est dissout dans le méthanol et 1 g de silice (Merck 60-F) par gramme d’extrait sec est introduit dans le ballon. Après évaporation totale du solvant la silice imprégnée d’extrait est ajoutée à un gel de silice (80 à 100 g/g d’extrait sec) dans colonne chromatographique préremplie. L’éluant utilisé est constitué d’un mélange éthanol, acétate d’éthyle et éther de pétrole, dans les proportions respectives suivantes : 20%, 30% et 50%. La fraction fluorescente jaune/verte est suivie lors de son élution avec une lampe UV et elle est récoltée en une seule fois dans un ballon monocole de 500 mL pour ensuite être évaporée à l’évaporateur rotatif. Le produit sec est suspendu de nouveau dans quelques mL de méthanol et il est introduit dans un speed vacuum jusqu’à évaporation totale du solvant pour obtenir une masse de produits fluorescents purifiés prête pour de nouvelles purifications (CCM préparative ou HPLC) ou pour analyse RMN.
Chromatographie sur couche mince (CCM)
La fraction fluorescente est déposée sur une plaque de silice afin de réaliser cette fois une purification par chromatographie sur couche mince (CCM) préparative. La migration des produits sur la plaque de silice est réalisée avec différents éluants afin d’obtenir une séparation optimale. Les ratios des différents mélanges de solvants sont inspirés de la littérature (Bilia et al, 1994 ; Atta et al, 2011). Les bandes fluorescentes sont prélevées en grattant délicatement la silice. Cette dernière est mise en suspension dans le méthanol afin de solubiliser les produits élués. Après filtration à l’aide d’un filtre circulaire de 0,45 µm la solution est introduite dans un speed vacuum jusqu’à évaporation totale du solvant pour obtenir une masse de produits fluorescents purifiés. Trois plaques successives sont réalisées pour obtenir une masse de produits suffisante pour l’analyse RMN.
Analyses par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)
La purification de l’extrait après colonne chromatographique a été effectuée par Christophe Molinier et Christophe Long au centre de recherche et développement des laboratoires Pierre Fabre à Toulouse.
Hydrolyse par reflux acide
Une partie de la fraction fluorescence évaporée (100 mg) est introduite dans un ballon monocole de 10 mL surmonté d’un condenseur, contenant une solution de 5 mL d’acide chlorhydrique (HCl) à 2 M et de méthanol (50/50). Le mélange HCL/méthanol/produits est chauffé à reflux, sous agitation, pendant environ 3 h. La phase aqueuse est séparée de la phase organique dans une ampoule à décanter par extraction à acétate d’éthyle (10 mL). La phase organique est ensuite évaporée à l’évaporateur rotatif puis au speed vacuum.
Tests pH métriques
Un volume de 2 mL de la solution méthanolique d’extraction des anthères ou de la solution méthanolique résultant de la réaction d’hydrolyse est introduit dans des tubes à essais. Le pH est ajusté soit avec une solution d’acide chlorhydrique (1 M) soit avec une solution d’hydroxyde sodium (1 M) afin d’obtenir un gradient de pH allant de 1 à 13. Le pH est mesuré par lecture colorimétrique à l’aide d’un papier filtre. Les mesures n’ont pas été corrigées.
RMN (Résonance Magnétique nucléaire)
Les analyses RMN des produits purifiés après colonne chromatographique et après CCM préparative sont effectuées à l’aide d’un spectromètre Varian 400 MHz. Le solvant d’analyse utilisé est le méthanol deutéré.
Partie photophysique
Analyses photophysiques
Les analyses photophysiques sont réalisées par Rémi Métivier au laboratoire de Photophysique et Photochimie Supramoléculaires et Macromoléculaires (PPSM), CNRSUMR 8531, ENS Cachan. Les spectres d’excitation et d’émission corrigés des anthères solides et des solutions ont été obtenus à l’aide d’un spectromètre Horiba Fluorolog® -3. Les rendements quantiques des anthères solides ont été réalisés en utilisant une sphère d’intégration tandis que les spectres d’excitation et d’émission ont été réalisés en utilisant un dispositif « front-face ». Les rendements quantiques en solution sont mesurés en utilisant le sulfate de quinine comme référence dont le rendement quantique dans le méthanol est de 54%. Les extraits à tester et la référence sont dilués dans le méthanol de façon obtenir un rendement absorption proche de 10%.
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Table des matières
INTRODUCTION
MATÉRIEL ET MÉTHODE
Sites et méthode d’échantillonnage
Modèles d’étude
Élevage
Test de choix
Analyses statistiques
Préparation des anthères
Extraction des composés fluorescents
Séparation des composées sur colonne chromatographique de silice
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Analyses par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)
Hydrolyse par reflux acide
Tests pH métriques
RMN (Résonance Magnétique nucléaire)
Analyses photophysiques
RESULTATS
Elevage
Tests comportementaux
Rendements d’extraction
Purification
Hydrolyse
CCM
RMN
Préparation des anthères
Spectres d’émissions
DISCUSSION
Elevage
Test comportementaux
Phytochimie / Photophysique
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
