Soutenance mémoire
Extraction des cellules musculaires
Partie expérimentale: Cardiomyoplastie cellulaire sans culture dans un modèle ovin:
Le concept de transplantation de cellules myogéniques dans le myocarde, ou cardiomyoplastie cellulaire, repose sur la contribution de cellules exogènes pour suppléer aux cardiomyocytes disparus ou altérés afin de restaurer la fonction cardiaque.Un ensemble de preuves montre que la cardiomyoplastie cellulaire peut améliorer la fonction cardiaque aussi bien dans les pathologies ischémiques du cœur que lors de cardiomyopathie dilatée sur de nombreux modèles animaux.
La plupart des équipes de recherche ont présenté la cardiomyoplastie cellulaire autologue selon un processus en 3 phases: biopsie, culture cellulaire in vitro/expansion et implantation chirurgicale ou par cathétérisme.En considérant le bénéfice potentiel de l’utilisation de cellules musculaires non cultivées (gain de temps, faible coût, réduction des risques de contamination), l’équipe du CERA a exploré la possibilité de greffer des cellules non cultivées au sein du myocarde ovin.
Animaux, matériel et méthodes
– Modèle animal:
L’étude a été approuvée par le Comité Institutionnel d’Ethique pour la Recherche Animale, et tous les animaux ont reçu des soins en conformité avec le « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » rédigé par the Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, et publié par the National Academy Press, révisé en 1996.
L’implantation intramyocardique autologue de cellules de muscle squelettique a été réalisée sur 8 moutons Ile-de-France sains âgés d’un an et pesant entre 63 et 67kg (Lycée Agricole et Viticole, Crézancy, France).
Trois autres animaux ont reçu l’excipient uniquement (implantations témoins).
– Biopsie de muscle squelettique:
Sous anesthésie générale, une biopsie de muscle squelettique (approximativement 10g) a été réalisée stérilement à partir du biceps fémoral du postérieur gauche sur chaque mouton. Le tissu prélevé a été conservé dans un milieu DMEM (Duldecco’s Modified Eagle Medium, avec Glutamax I, pyruvate de sodium, 4500mg/l de glucose, pyridoxine, GIBCO) à température ambiante jusqu’à ce que les digestions mécanique et enzymatique aient débuté. Le site opératoire a été refermé plan par plan de manière classique.
Les animaux ont récupéré durant approximativement 3 heures avant d’être réanesthésiés lorsque la préparation cellulaire était prête à être implantée.
– Extraction des cellules musculaires:
Les fragments prélevés de muscle squelettique ont été pesés puis lavés dans le milieu DMEM. Le tissu adipeux et les fascias ont été retirés et le muscle émincé très finement aux ciseaux. Les morceaux de muscle ont alors été centrifugés dans le DMEM à 300tours/minute durant 2 minutes et le surnageant a été éliminé. Afin d’extraire les cellules satellites, les fragments de muscle ont été incubés à 37°C sous agitation, dans 10ml de DMEM complémenté avec 0,4% (w/v) de collagénase brute (type IA, SIGMA).
Après 20 minutes de traitement par la collagénase, les fragments ont à nouveau été centrifugés à 300 tours/minute pendant 2 minutes. Le surnageant contenant les cellules isolées a été conservé dans du DMEM complémenté de 20% (vol/vol) de sérum de veau foetal; le culot de centrifugation a alors été soumis à 4 nouveaux cycles de digestion comme décrits précédemment 102.
Les cellules extraites ont alors été filtrées au travers d’un filtre cellulaire de nylon à 250μm (VWR Polylabo Strasbourg, France).
– Marquage cellulaire:
Pour le marquage nucléaire, les cellules ont été mises en suspension dans 10ml de DMEM sans sérum contenant 25μg/ml de 4’-6‘-diamidino-2-phenylindole (DAPI-SIGMA) durant 10 minutes. Les cellules ont été rincées 4 fois dans du DMEM afin d’éliminer le DAPI non fixé. Nous avons tiré avantage du marquage DAPI pour estimer le nombre de cellules mononucléées dans la préparation, à l’aide d’un hémocytomètre sous microscopie à fluorescence.
La préparation cellulaire a alors été remise en suspension dans 1,2ml de DMEM sans sérum et conservé à 4°C jusqu’à la transplantation.
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Table des matières
I- Introduction
1- Insuffisance cardiaque dans les pays développés
2- Options thérapeutiques
3- Cardiomyoplastie cellulaire
3.1- Introduction
3.2- Etat de la question: points clés et littérature
3.3- Conclusion – perspectives
II- Bibliographie : La cardiomyoplastie cellulaire: expérimentation animale
1- Présentation
2- Glossaire
3- Revue de la littérature
III- Expérimentation: Cardiomyoplastie cellulaire sans culture dans un modèle ovin
1- Animaux, matériel et méthodes
1.1- Modèle animal
1.2- Biopsie de muscle squelettique
1.3- Extraction des cellules musculaires
1.4- Marquage cellulaire
1.5- Implantation cellulaire dans le myocarde
1.6- Culture cellulaire témoin
1.7- Etude histologique
2- Résultats
3- Discussion
4- Conclusion
Références bibliographiques
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