Extraction des acides nucléiques

Spécificité, inclusivité, et répétabilité

Les résultats obtenus pour l’évaluation complète des méthodes (pour déterminer la spécificité, l’inclusivité, let a répétabilité) sont synthétisés dans le tableau ci après. Le statut de l’échantillon correspond au résultat attendu, le chiffre 1 correspond à un résultat positif et le chiffre 0 correspond à un résultat négatif. (NT= non testé) Les PCR « Wang et al, 2015 » ciblant le gène de la Spiraline et la PCR « Wang et al, 2015 » ciblant le virus intégré ne semblent pas inclusives pour deux souches californiennes (Np et Op). Les Ct obtenus pour ces deux échantillons avec la PCR « DVP LSV UBVO » sont tardifs (entre 38.16 et 39.19), preuve que les extraits d’ADN ne sont pas très concentrés. Il ne s’agirait donc pas d’un problème d’inclusivité mais d’un problème de sensibilité analytique. En effet ce sont les deux méthodes les moins sensibles, la concentration d’ADN devait donc être en dessous de leur seuil de détection. De plus, la PCR « Wang et al, 2015 » ciblant le gène du virus intégré n’est pas 100% spécifique, elle donne un résultat positif pour deux spiroplasmes, Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii (cf. annexe 3).

Cependant comme ces deux spiroplasmes sont deux pathogènes des plantes et cette méthode étant destinée à un usage en quarantaine, ce défaut de spécificité n’est pas nature à écarter l’usage de cette méthode comme méthode de première intention. La PCR « Yokomi et al, 2008 » ciblant le gène putatif de l’adhésine P58 est 100% inclusive, elle obtient une spécificité de 99% avec un 1% correspondant à un pathogène des plantes [9] (Spiroplasma phoeniceum), cependant comme dit précédemment ce défaut de spécificité n’est pas nature à écarter l’usage de cette méthode comme méthode de première intention. La PCR « DVP LSV UBVO » ciblant le gène putatif de l’adhésine P58 donne un résultat positif sur un échantillon non cible (Fortunella japonica), elle ne semble donc pas totalement spécifique. Etant donné les Ct obtenus et l’allure parfois atypique des courbes d’amplification avec la méthode (figure10), la déviation positive observée pour l’échantillon Zn est plus certainement liée à un problème de stabilité de la sonde Taqman® (bruit de fond du début) qu’à un problème de spécificité de la sonde par rapport à cette matrice. Cette méthode n’est donc pas adaptée pour une utilisation en routine.

Les résultats obtenus pour les échantillons allant de An à Fn ont parfois produit des résultats positifs, il s’agit d’ADN de bactéries du genre Spiroplasma (cf. tableaux 1 et 2), il y avait donc soit un problème de spécificité des méthodes vis-à-vis de ces échantillons soit un problème de contamination des échantillons par Spiroplasma citri. Une PCR conventionnelle a donc été réalisée pour pouvoir faire un séquençage sur les produits d’amplification afin de déterminer s’il s’agissait d’une contamination ou non. Après analyse du séquençage, il s’est avéré que les échantillons avaient été contaminés par Spiroplasma citri. Ces échantillons ont donc été retirés de l’étude (ils ne sont donc pas dans le tableau des résultats) et remplacés par de nouveaux échantillons (Bnbis, Cnbis, Dnbis et Enbis) qui ne sont pas contaminés (cf. tableau 2).

Voici l’exemple de l’analyse du séquençage de l’échantillon Cn : Les extraits ADN ont été amplifiés au LSV selon la méthode de Yokomi et al, 2008 ciblant le gène putatif de l’adhésine P58. Les amplifiât et les amorces ayant servis à l’amplification sont ensuite transmis à un prestataire de service qui réalisent un séquençage direct sur amplifiât. Le LSV reçoit les séquences produites (chromatogrammes et séquences) et les analyses. Le séquençage a été réalisé dans les deux sens, c’est-à-dire avec l’amorce « forward » et avec l’amorce « reverse », nous avons donc obtenu deux séquences. Les séquences sont analysées puis corrigées pour enlever les morceaux non interprétables et source d’erreur.

Conclusion / discussion

La caractérisation des méthodes permet de montrer que les performances de la méthode de « Yokomi et al, 2008» ciblant le gène putatif de l’adhésine P58 sont meilleures que les trois autres PCR en temps réel. En effet, cette méthode est la plus sensible, critère important, car la plupart du temps les plantes en quarantaine sont asymptomatiques. Elle arrive à détecter l’ensemble des isolats testés, elle possède une inclusivité de 100%. Cependant, elle n’est pas totalement spécifique à Spiroplasma citri, elle détecte également Spiroplasma phoeniceum. Cependant comme ce spiroplasme est un pathogène des plantes et cette méthode étant destinée à un usage en quarantaine, ce défaut de spécificité n’est pas nature à écarter l’usage de cette méthode comme méthode de première intention. De plus, Spiroplasma phoeniceum n’a été retrouvé que sur pervenche en Syrie (Saillard et al, 1987), donc si un résultat positif sort sur rutacée il y a peu de risque que cela soit ce spiroplasme. La méthode « Wang et al, 2015 » ciblant le virus intégré pourrait être utilisée en méthode de confirmation d’un premier résultat positif car cette méthode a une spécificité de 100% pour Spiroplasma citri. Il serait intéressant de caractériser les méthodes de PCR en point final, celle-ci pourrait également servir de méthode de confirmation si l’unité de quarantaine obtient un résultat positif. Il faudrait, dans l’idéal, une méthode de PCR conventionnelle ciblant une autre zone du génome de Spiroplasma citri, car cela conforterait encore plus le résultat positif obtenu.

Il serait également possible d’isoler la bactérie dans un cas de résultat de PCR positif à des fins de confirmation. La PCR ne permet pas de dire si la bactérie est viable dans la plante, elle ne permet que de déceler la présence d’ADN. Ainsi la culture pourrait être une bonne solution pour déterminer la viabilité du micro-organisme dans la plante. La méthode suggérée pour la détection de Spiroplasma citri n’est pas encore totalement caractérisée. En effet la méthode destinée à l’unité de quarantaine doit être reproductible pour garantir une concordance des résultats dans des conditions d’utilisation pouvant différer (suivi métrologique des équipements et matériels, marques de réactifs ou consommables, …).

La reproductibilité est l’étroitesse d’accord entre des résultats d’essais individuels effectués sur un matériau d’essai identique en utilisant la même méthode et obtenus par des opérateurs de différents laboratoires utilisant un équipement différent. La méthode étant destinée à une autre unité du LSV, un EILV (essai inter laboratoire de validation) doit être organisé. Sur le plan personnel, ce stage m’a permis de me familiariser avec les démarches à entreprendre afin de caractériser une méthode. J’ai pu approfondir mes connaissances en biologie moléculaire. Ce stage au Laboratoire de la santé des végétaux à répondu à mes attentes et m’a permis de découvrir un nouvel environnement professionnel, j’ai pu découvrir le travail en laboratoire mais aussi le travail au bureau où j’ai pu travailler mes capacités de synthèse lors de la rédaction de ce rapport.

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela rapport gratuit propose le téléchargement des modèles gratuits de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

PRESENTATION DE LA STRUCTURE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
Echantillons d’ADN
Extraction des acides nucléiques
PCR conventionnelle
3.1. Principe
3.2. Méthodes utilisées
PCR en temps réel
4.1. Principe
4.2. Méthodes utilisées
Méthodologie de caractérisation
5.1. Déroulement
5.2. Critères de caractérisation
RESULTATS
Essais préliminaires
1.1. Première approche
1.2. Premier aperçu de l’inclusivité et de la sensibilité analytique
Evaluation complète
2.1. Sensibilité analytique
2.2. Spécificité, inclusivité, et répétabilité
CONCLUSION / DISCUSSION
BIBLIOGRAPHIES
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLE DES TABLEAUX