Extraction de phéromones à partir de la GOVI et des capsules d’œufs

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Comportement

Les Céphalopodes sont connus pour être les représentants les plus évolués parmi les Mollusques, à la sociabilité complexe et stéréotypée. Ainsi, le poulpe Octopus tetricus est capable de vivre en solitaire ou en communauté de 10 à 15 individus, en aménageant un lieu de vie commun, en chassant les congénères indésirables. Les sites sont caractérisés par des excavations formant des fosses, et des couches de coquilles de pétoncle (Mimachlamys asperrima) recouvrant la surface de ces zones (Scheel et al., 2017).
Les seiches sont migratrices, elles n’aménagent donc pas leur habitat mais se regroupent en période de reproduction dans des endroits bien précis sur les côtes, c’est d’ailleurs le seul moment où elles manifestent des signes sociaux (Hanlon and Messenger, 1996). Leurs comportements sociaux dans ces zones sont stéréotypés. Ils s’illustrent par des postures et des mouvements de bras, ainsi que par la modification des patterns (Hanlon and Messenger, 1988). Chez les seiches, il y a des individus dominants (généralement les plus gros) et des dominés (Adamo and Hanlon, 1996; Boal, 1996).
Aucun comportement de cour n’a été observé chez les seiches en captivité. Lorsqu’un mâle convoite une femelle, il nage vers elle, couronne de tentacules ouverte, et s’y agrippe pour s’accoupler immédiatement (Hanlon et al., 1999). Il peut en revanche y avoir une forme d’intimidation via les patterns de face (anneau sombre autour de l’œil et pupille dilatée) (Adamo and Hanlon, 1996) et des combats entre les mâles pour le droit à s’accoupler (Allen et al., 2017). De plus, il semble que les femelles aient des préférences pour certains mâles, qui ne sont pas forcément les dominants mais plutôt pour leurs aptitudes à s’accoupler. Ainsi, elles préféreront les mâles qui se sont accouplés récemment (Boal, 1997).
La « compétition du sperme » est aussi un aspect important dans le comportement de reproduction (Hanlon et al., 1999). Le mâle cherche en effet à favoriser sa semence. Avant l’accouplement, le mâle nettoie la poche copulatrice de la femelle afin d’éliminer les spermatophores rivaux éventuellement présents. Après l’accouplement, le mâle garde et protège la femelle en ponte des concurrents sexuels pour éviter tout accouplement. Il arbore un pattern zébré fortement contrasté appelé « Intense Zebra Display » (Adamo and Hanlon, 1996; Tinbergen, 1939), se place parallèlement à la femelle et déploie son quatrième bras en direction du rival (Hanlon and Messenger, 1996).
Chez certaines espèces de calmars, un comportement similaire est observé. Les mâles les plus gros et les plus agressifs s’accouplent et gardent les femelles (Cummins et al., 2011). Cependant certains individus appelés « sneaker », ou « sournois », réussissent à s’accoupler avec une femelle surveillée, en jouant de vitesse (Hanlon and Messenger, 1996).
La modification de la couleur du corps, ou homochromie est une caractéristique des Céphalopodes. Ainsi cette capacité à se fondre dans le décor en fait de véritables experts en camouflage. Par exemple, la seiche est capable de s’ensabler partiellement dans le substrat, du sable généralement, et d’adopter une couleur mimétique pour chasser à l’affût ou tout simplement pour se reposer à l’abri des prédateurs.
La prédation est aussi à l’origine de comportements stéréotypés. Les stratégies de capture varient en fonction du type de proie et surtout du rapport de taille entre la seiche et la proie (Duval et al., 1984). Ainsi une capture par coiffage avec les bras est plus adaptée à la capture d’une proie de grande taille, tandis qu’une capture avec les tentacules préhensiles sera utilisée pour une proie de petite taille, crevettes ou petits poissons par exemple.

Peptides et polypeptides régulant la ponte A. Introduction

Comme précisé précédemment, chez la seiche, la ponte est sous le contrôle d’au moins trois types de régulateurs peptidiques : des neuropeptides associés à la perception des paramètres environnementaux, des peptides régulateurs ovariens assurant la régulation paracrine du tractus génital, et des phéromones sexuelles impliquées d’une part dans la régulation de la ponte et probablement dans la concentration des géniteurs sur les aires de ponte côtières.

Les neuropeptides

Présentation générale

Les neuropeptides sont de courtes chaines d’acides aminés produites par le tissu nerveux et qui participent à la régulation de nombreux processus physiologiques tels que la reproduction, la digestion, la nutrition, la circulation, l’excrétion et les processus comportementaux (Nässel and Larhammar, 2013). Ils sont issus de la maturation d’un précurseur protéique, le prepropeptide, qui peut porter plusieurs neuropeptides différents, présents sous la forme de plusieurs copies ou en un seul exemplaire.
Le prepropeptide d’un neuropeptide possède une séquence signale à l’extrémité N-terminale. Cette séquence signale (ou peptide signal) qui permet l’adressage du complexe ARNm/ribosomes vers les membranes des citernes du réticulum endoplasmique granuleux (REG) est clivée par une peptidase membranaire dès son entrée dans la lumière du REG.
Les séquences des neuropeptides sont généralement encadrées par des sites de clivage mono, di ou tribasiques sauf si la séquence est accolée au peptide signal tel que l’on peut l’observer pour les ocytocines/vasopressines, le GnRH, les neuropeptides Y, etc. ou si au contraire elle est positionnée en C-terminal comme les Bursicons, les CCAPs, les NKY ou l’urotensine II.
Les neuropeptides sont libérés par des endopeptidases, les prohormones convertases, présentes dans la lumière de l’appareil de Golgi. De nombreux neuropeptides subissent des modifications post-traductionnelles pour acquérir une structure biologiquement active, que ce soient la formation de ponts disulfures, la mise en place d’une amidation C-terminale, ou la cyclisation d’une glutamine N-terminale en acide pyroglutamique (De Haes et al., 2015).
Les neuropeptides sont exprimés et sécrétés afin de répondre à un stimulus qui peut être une modification environnementale ou une stimulation mécanique, par exemple. Ils se lient à un récepteur membranaire couplé à une protéine G, déclenchant ainsi une cascade de réactions intracellulaires aboutissant à la modulation de l’activité des cellules cible.

Les neuropeptides chez les Mollusques

La régulation neuroendocrine de la ponte a bien été décrite chez les Mollusques Gastéropodes hermaphrodites, notamment chez la lymnée Lymnea stagnalis et chez l’aplysie Aplysia californica, respectivement pulmoné et opistobranche. Ces Gastéropodes montrent par ailleurs des comportements stéréotypés et bien décrits lors de l’accouplement et de la ponte (Morishita et al., 2010) tels que l’inhibition de la locomotion et des ondulations de la tête (Arch and Smock, 1977; Ferguson et al., 1989).
Chez l’aplysie, le contrôle de la ponte est régulé par une neurohormone : l’ELH (Egg Laying Hormone) (Chiu et al., 1979). L’ELH est un neuropeptide amidé possédant 36 résidus (Figure 9). Elle déclenche la ponte si elle est injectée à des animaux matures (Bernheim and Mayeri, 1995), in vitro elle déclenche, de façon dose-dépendante, l’émission d’œufs par l’ovotestis isolé à partir de 8.10-10 M (Barry S. Rothman et al., 1983). Enfin, elle excite le neurone R15 situé dans le ganglion abdominal (Branton et al., 1978), il en résulte la libération du peptide R15α1, qui module le transport de l’ovocyte par le biais du péristaltisme du grand canal hermaphrodite (Alevizos et al., 1991).
peptide signal, surlignés en rouge : les sites de clivage mono-, di-, tri-, et tetrabasiques, surligné en orange : les BCPs, surlignés en bleu : l’ELH, en bleu-vert : l’amidation C-terminale de l’ELH, en vert : l’AP. (B) : Organisation du précurseur de l’ELH.
D’autres peptides sont également présents sur le précurseur de l’ELH (Figure 9) : les Bag Cell Peptides (BCPs) et l’Acidic Peptide (AP) (B S Rothman et al., 1983; Scheller et al., 1983).
Les BCPs sont au nombre de 5 : α-, β-, γ-, δ-, et ε-BCP (B S Rothman et al., 1983; Scheller et al., 1983). Les BCPs agissent sur le tractus génital et sur le système nerveux, ils permettent ainsi de moduler la ponte ainsi que le comportement associé de l’animal tel que la cessation de la locomotion, l’inhibition de l’alimentation et des ondulations de la tête. Les α- et β-BCP, ainsi que le γ-BCP sont impliqués dans l’auto-stimulation des bag cells, qui prolongent la décharge de ces dernières en conduisant à une libération massive d’ELH et de BCPs (Brown and Mayeri, 1989; Kauer et al., 1987). Le δ-BCP stimule le flux de Ca2+ dans les mitochondries des cellules sécrétrices de la glande de l’albumine, induisant la stimulation et/ou la synthèse de liquide périvitellin par la glande (Nagle et al., 1990). Aucune fonction biologique n’est attribuée à l’ε-BCP ni à l’AP. Ce dernier est situé à l’extrémité C-terminale du précurseur de l’ELH (Figure 9), son nom vient de la richesse en acides aminés acides. (Mayeri et al., 1985; Scheller et al., 1983).
L’ELH est libérée en réponse à des stimuli externes (température et probablement des phéromones sexuelles) perçus par les neurones périphériques et a des stimuli internes (état de maturité de l’animal) (Blankenship and Haskins, 1979; Haskins and Blankenship, 1979; Morishita et al., 2010). Le gène codant pour l’ELH est exprimé dans le SNC par les bag cells (Kupfermann and Kandel, 1970). Les bag cells sont une paire de clusters neuronaux localisés sur les connectifs pleuro-abdominaux de l’animal, à proximité du ganglion abdominal (Figure 10). Hors période de ponte, les bag cells sont électriquement silencieuses. Chez l’aplysie, la décharge de ces bag cells déclenche la ponte. (Kupfermann, 1967; Kupfermann and Kandel, 1970; Strumwasser et al., 1969). L’expression du gène de l’ELH par les bag cells conduit à la libération de l’hormone (Chiu et al., 1979), des BCPs et de l’AP (Scheller et al., 1983). Les BCPs vont prolonger la décharge par l’autoexcitation des bag cells (Brown and Mayeri, 1989; Kauer et al., 1987).
L’excitabilité des bag cells est elle-même régulée par le SNC. Le ganglion pleural droit et le ganglion cérébroïde de l’aplysie contiennent des neurones exprimant le gène de l’ELH : les ELH and BCP containing Cells (EBC) (Chiu and Strumwasser, 1981)(Chiu and Strumwasser, 1984; Painter et al., 1989; Pulst et al., 1988). L’excitation de ces neurones par l’ELH ou les BCPs induit la décharge des bag cells, et par conséquent la libération d’ELH et des BCPs par ces dernières (Brown and Mayeri, 1989). Les bag cells sont entourées de terminaisons nerveuses contenant de la sérotonine (McPherson and Blankenship, 1991) et du FMRFa (Fisher et al., 1993). Ces messagers issus du SNC permettent de stopper la décharge des bag cells et donc de mettre fin au processus de ponte. Il s’agit là d’un rétrocontrôle négatif du SNC sur les bag cells.
La glande atriale exprime également des messagers qui interviennent sur le système nerveux, les peptides A et B et les califines. Les peptides A et B sont des peptides amidés de 34 résidus exprimés par la glande atriale (Figure 11) (Heller et al., 1980). Ces peptides ont une extrémité C-terminale très similaire à celle de l’α-BCP (Figure 12) et déclenchent l’excitabilité des EBC (Sherry D Painter et al., 1988). Les Califines sont exprimées et secrétées en grande quantité au niveau de la glande atriale (Nagle et al., 1986; Rothman et al., 1986).
Au nombre de trois, notées A, B, et C, elles sont formées d’une sous unité commune de 18 acides aminés, reliée par un pont disulfure à une grande sous unité de 36 acides aminés. Cette grande sous unité est fortement homologue à l’ELH (78 à 83%), c’est d’ailleurs cette sous unité Califine A, et (B) : du peptide B et de la Califine B. (C) : Organisation générale des précurseurs des peptides A et B. Surligné en jaune : peptide signal, surlignés en rouge : les sites de clivage mono et dibasiques, surlignées en bleu-vert : les glycines C- terminales correspondant aux amidations, surlignés en orange : les peptides A et B, surlignées en bleu foncé : les grandes sous- unités des Califines, surlignées en bleu clair : les petites sous unité des Califines. Peptides en gras et cystéines soulignées qui est responsable de l’activité biologique des Califines. Les Califines sont codées par les précurseurs des peptides A et B (Figure 11). Il n’y a pas de précurseur identifié pour la Califine C, bien que son existence ait été démontrée (Rothman et al., 1986). Injectées à des animaux sexuellement matures, les Califines déclenchent un comportement de ponte. Ex vivo, les Califines A et C à 670 nM provoquent une excitation prolongée ciblée des neurones dans la région du quadrant gauche (LUQ : Left Quadrant Upper) du ganglion abdominal. Bien que la Califine B n’ait pas été testée, une activité semblable aux autres Califines est suspectée du fait de la forte homologie de séquence.
Chez l’huitre creuse Crasostrea gigas, une EST (CU997912) codant pour l’ELH est décrite pour la première fois par Veenstra (Veenstra, 2010). Deux ELH de 36 acides aminés, CgELH1 et CgELH2 sont présentes sur le précurseur de 166 acides aminés. Les extrémités N- et C-terminales sont les domaines les plus conservés entre les différentes espèces de mollusques, laissant supposer un rôle important dans les interactions avec le récepteur (Stewart et al., 2014). Cette hypothèse est renforcée par une étude réalisée chez l’aplysie qui montre que la modification ou la suppression des extrémités d’une ELH synthétique provoque la diminution de l’activité biologique (Strumwasser et al., 1987).
Chez la seiche, seules trois familles de neuropeptides sont décrites pour leur implication dans la régulation de la ponte : les APGWamide-RPs, les FMRFamide related peptides (FaRPs), la Sepiatocine, et la pro-Sepiatocine (Henry et al., 2013, 1999, 1997; Zatylny-Gaudin et al., 2010). Le tétrapeptide APGWa est un neuropeptide identifié pour la première fois chez le Gastéropode Fusinus ferrugineus pour son rôle dans le blocage de la libération de la sérotonine, inhibant ainsi la contraction du muscle rétracteur du pénis et induisant par conséquent l’érection (Kuroki et al, 1990). Chez la seiche, la forme clivée GWamide de ce neuropeptide est identifiée et caractérisée pour la première fois au niveau des lobes optiques (Henry et al, 1997). Ce dipeptide inhibe les contractions de l’oviducte, bloquant le transit de l’ovocyte dans le tractus génital si l’animal ne s’est pas accouplé. Chez la seiche, le précurseur protéique de l’APGWa contient quatorze copies du tétrapeptide (Figure 13), ce dernier est clivé en GWa au niveau du système nerveux central par une dipeptidyl aminopeptidase (DPAP). Il a été démontré expérimentalement que la forme clivée est mille fois plus active que la forme native. Enfin, l’activité de ce neuropeptide est très dépendante de la période du cycle. Il exerce une activité chez les femelles dès l’initiation de la biosynthèse des matériaux capsulaires et des protéines du vitellus dans le tractus génital, c’est-à-dire en vitellogénèse.
Les FaRPs forment une famille de neuropeptides présente chez les protostomiens et appartenant
à la grande famille des RFamide, distribués dans l’ensemble du règne animal (Zatylny-Gaudin and Favrel, 2014). Chez les Mollusques, les FaRPs sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques tels que l’activité cardiaque (Painter and Greenberg, 1982; Price and Greenberg, 1977), la nutrition (Dockray, 2004) ou la reproduction (Di Cristo et al., 2003; Henry et al., 1999). Chez la seiche, ces neuropeptides sont exprimés au niveau des lobes optiques (Henry et al., 1999) et ont également été détectés dans l’aire neurohémale et dans l’hémolymphe (Zatylny-Gaudin et al., 2016), ce qui démontre leur statut de neurohormones. Le précurseur des FaRPs (Loi and Tublitz, 1997) (Figure 14) code pour onze copies du tétrapeptide FMRFamide, et une copie des peptides FLRFamide, FIRFamide et ALSGDAFLRFamide.

Les régulateurs ovariens

Régulation paracrine chez les Mollusques

Chez l’huitre creuse Crassostrea gigas, le PIESVD est le premier peptide régulateur ovarien à avoir été identifié (Bernay et al., 2006b). Ce régulateur agit spécifiquement sur les femelles matures en modulant l’activité du muscle adducteur dont les contractions participent à l’émission des gamètes dans le milieu pendant la période de reproduction. Des travaux récents montrent que ce peptide est clivé à partir d’une protéine vitelline (Joël Henry, communication personnelle).

Régulation paracrine chez la seiche

La 5-Hydroxytryptamine (5-HT) est le premier régulateur ovarien identifié chez la seiche (Zatylny et al., 2000a). Isolée à partir d’ovocytes matures, elle contribue à leur stockage dans le cœlome génital avant l’accouplement et cible l’oviducte proximal dont elle inhibe, de façon dose dépendante, les contractions (diminution de l’amplitude et de la fréquence). Ce régulateur est synthétisé par l’ovocyte dès le début de la vitellogénèse (stade IVa) jusqu’au stade mature (stade V), où la concentration est maximale.
Le tétrapeptide ILME (Zatylny et al., 2000b) a été identifié à partir d’un extrait peptidique d’œufs, il est aussi présent au niveau des follicules vitellogéniques et des ovocytes lisses. Il est détecté dans l’eau d’incubation des œufs et des ovocytes matures, ce qui fait qu’il est également considéré comme une phéromone aquatique. L’ILME déclenche la cyclisation des contractions de l’appareil génital femelle à partir de 10-14 M. Ce peptide augmente le tonus et la fréquence des contractions des GNP, responsables de la sécrétion de la capsule externe de l’œuf. Il cible spécifiquement le tractus génital et les GNP, et n’a pas d’effet sur d’autres organes contractiles tels que l’œsophage, par exemple.
La SepOvotropine (Zatylny et al., 2000c) a été identifiée à partir de follicules vitellogéniques et est également présente dans les ovocytes matures et dans les œufs. Ce peptide module les contractions du tractus génital des femelles matures à partir de 10-19 M.
À 10-10 M la SepOvotropine déclenche la cyclisation des contractions de l’oviducte distal. Bien que n’étant pas impliqué dans la motilité du tractus génital, le SepSAP (pour Sepia Sperm Attracting Peptide, (Zatylny et al., 2002)) n’en n’est pas moins impliqué dans la ponte. Cet hexapeptide amidé en C-terminal est exprimé par les follicules vitellogéniques et est libéré par les ovocytes encapsulés lors de la ponte. Actif dès 10-17 M, il facilite la rencontre des gamètes en exerçant un effet attractant sur les spermatozoïdes, permettant sans doute une sélection des gamètes les plus compétentes pour la fertilisation.
Le Sepia Capsule Releasing Peptide, ou SepCRP, est exprimé pendant la vitellogénèse dans les follicules ovariens (Bernay et al., 2004). Il cible spécifiquement l’oviducte et la GNP dont il inhibe les contractions. Tout comme la 5-HT, il serait impliqué dans le stockage des ovocytes avant l’accouplement. Sept autres peptides apparentés à ce premier SepCRP ont été identifiés par la suite (Bernay et al., 2005). Ces peptides conservent une activité similaire.
Les Ovarian Jelly Peptides ou OJPs présentent des similitudes avec les SepCRPs : même localisation, activité semblable sur les mêmes organes cibles, et séquence qui conserve un domaine (DEV(K) (Bernay et al., 2006a). Le nom de cette famille de peptides régulateurs ovariens provient de leur propriété gélifiante en solution aqueuse. Enfin, la Sepovotropine, les SepCRPs et les OJPs sont issus du clivage d’une protéine vitelline très abondante dans les follicules ovariens vitellogéniques et les ovocytes matures (Joël Henry, communication personnelle).

Les phéromones sexuelles

Présentation générale

Une phéromone se définit comme une substance de nature biochimique variable (peptide, protéine, lipide, ester, etc…), sécrétée dans l’environnement par un individu d’une espèce donnée, et qui est reçue par un individu de la même espèce chez qui elle déclenche une réaction spécifique, tel un comportement morphologique ou une réaction stéréotypée. Contrairement à d’autres formes de communication chimique, une phéromone implique une notion de volonté de la part de l’émetteur et du receveur.
Les phéromones ont pour particularité de déclencher une réaction à très faible concentration, et peuvent agir en mélange sous forme de bouquet dont la composition qualitative et quantitative module la spécificité du message.
La nature chimique des phéromones est variable selon l’organisme, le rôle et le mode de transport : les phéromones de faible poids moléculaire (esters, alcools, aromatiques…) sont plutôt volatiles et donc facilement transportables par voie aérienne. De par leur nature il s’agit surtout de phéromones de communication à longue distance comme par exemple le bombykol libéré par la femelle Bombyx mori (Butenandt et al., 1961). Les phéromones de masse moléculaire plus élevée (protéines, stéroïdes, hydrocarbures cuticulaires…) sont présentes chez les organismes vivant en groupe et dont les signaux sont échangés à faible distance ou par contact. Ces phéromones de contact sont effectives lors de la manipulation (d’œufs par exemple). Les phéromones protéïques, polypeptidiques et peptidiques peuvent être modifiées pour limiter leur dégradation dans le milieu (amidation C-terminale, ponts disulfures intra-chaine des protéines et N-glycosylations).
Il existe deux classes de phéromones, définies selon les travaux de Wilson (Wilson, 1963). Les phéromones incitatrices qui déclenchent une modification instantanée et réversible du comportement du receveur (migration, attitude agressive, attitude copulatrice…). On retrouve dans cette classe les phéromones d’identité, sexuelles, d’alarme, de piste, d’agrégation, territoriales, et d’espacement. La seconde classe est celle des phéromones modificatrices qui déclenchent des changements morphologiques ou physiologiques sur les individus. Cette classe est largement représentée chez les insectes sociaux avec les phéromones de caste et de grégarisation.

Les phéromones sexuelles

Les phéromones sexuelles sont dites incitatrices : elles visent à modifier instantanément et temporairement le comportement de l’individu receveur. Ces phéromones peuvent avoir un effet attractant, telle que l’attractine chez l’aplysie (Painter et al., 2003) ou la darcine chez la souris (Roberts et al., 2010). Elles peuvent jouer un rôle dans la régulation de la ponte, comme le tétrapeptide ILME chez la seiche (Zatylny et al., 2000b), ou encore dans la sélection des géniteurs comme la Loligo-β-sémino-protéine (Loligo-β-MSP) chez le calmar Loligo pealeii (Cummins et al., 2011).

Phéromones sexuelles chez les Insectes

Le bombykol est la première phéromone sexuelle identifiée chez le Bombyx du murier (Butenandt et al., 1961). Il s’agit d’une phéromone volatile (alcool) secrétée par la femelle pour attirer le mâle. Le bombykol déclenche une action à très faible concentration : il a été démontré qu’une seule molécule de bombykol suffit à déclencher un potentiel d’action chez le mâle.
Chez la drosophile, trois phéromones sexuelles ont été identifiées (Gomez-diaz and Benton, 2013). La 11-cis-vaccentyl acetate (cVA) est une phéromone lipidique volatile produite par la drosophile mâle, connue pour inhiber les comportements de cour des autres mâles (Bartelt et al., 1985) et favoriser l’accouplement avec les femelles (Kurtovic et al., 2007). De plus, elle agit aussi comme phéromone d’agrégation. Cette phéromone est détectée par le récepteur Or67d exprimé dans les antennes des mâles et des femelles (Ha and Smith, 2006; Kurtovic et al., 2007). Les deux autres phéromones sont des hydrocarbures cuticulaires qui agissent par contact et qui sont produites de manière sexe-spécifique : la 7,11-heptacosadiene (7,11-HD) est produite par les femelles et agit comme un aphrodisiaque chez les mâles, tandis que la phéromone mâle 7-tricosene a un effet antagoniste (Benton, 2007; Kurtovic et al., 2007).

Phéromones sexuelles chez les Mammifères

Chez les Mammifères, plusieurs phéromones sexuelles ont été identifiées. Elles agissent notamment sur le comportement des géniteurs. Elles sont reconnues par l’organe voméro-nasal (ou organe de Jacobson) situé entre le palais et les fosses nasales et spécialisé dans la détection des phéromones, ou par l’épithélium olfactif principal situé dans la cavité nasale. Ces phéromones sont libérées et associées à l’urine ou aux sécrétions lacrymales.
Chez la souris, la phéromone ESP1 (pour Excorine-Gland-Secreting peptide 1) est un peptide de 7 kDa exclusivement produit par le mâle (Yoshinaga et al., 2013). Ce peptide est secrété par les glandes lacrymales extraorbitales et est reconnu par le récepteur Vmn2r116 (aussi connu sous le nom de V2Rp5) exprimé dans l’organe voméro-nasal des mâles et des femelles (Haga et al., 2010).
L’activité d’ESP1 sur le comportement de la souris est sexe dépendante : ainsi chez la femelle, ESP1 déclenche un comportement de lordose (reflexe copulatoire de courbure de la colonne vertébrale favorisant la pénétration). Chez la souris mâle, EPS1 agit en synergie avec l’urine de mâles non familiers et déclenche un comportement agressif (Hattori et al., 2016). La Darcine (ou Major Urinary Protein 20, Mup20) est une petite protéine de 18893 Da présente dans l’urine des souris mâle (Roberts et al., 2010). Elle déclenche l’attraction des femelles pour un mâle émetteur spécifique. Enfin, les composés volatiles tels que le DHB (3,4-dehydro-exo-brevicomin) et la SBT (2-sec-butyl-4,5-dihydrothiazole), sont également retrouvés dans l’urine des mâles et agissent seuls ou en combinaison. Ils sont impliqués dans l’attraction des femelles, dans l’agression entre mâles, et induisent l’œstrus (Dulac and Torello, 2003).

Phéromones sexuelles chez les Mollusques non Céphalopodes

Chez les Mollusques autres que les Céphalopodes, la communication visuelle est limitée par le faible développement des yeux et par la turbidité du milieu. La communication chimique joue donc un rôle important pour permettre le regroupement de géniteurs, la reconnaissance des partenaires sexuels ou encore la synchronisation de l’émission de gamètes. Par ailleurs, le caractère sessile de certains Mollusques tels que certains bivalves nécessite la synchronisation de l’émission des gamètes afin de permettre un taux de fécondation suffisant. La libération de messagers chimiques synchronisant l’émission des gamètes mâles et femelles est une nécessité. Les études sur les phéromones initiées chez la seiche se sont appuyées sur les travaux réalisés chez l’aplysie, un Gastéropode marin. Aplysia californica et Sepia officinalis partagent des caractéristiques communes d’un point de vue comportemental et sont de fait très proches au niveau phylogénétique.
Ces deux mollusques ont un comportement comparable au moment de la période de reproduction, caractérisée par des concentrations très importantes de géniteurs sur les aires de pontes côtières. Par ailleurs, leurs migrations sont horizontales et verticales, et annuelles. Enfin, les regroupements de géniteurs facilitent les accouplements et se traduisent par de fortes densités d’œufs dans des zones côtières très localisées.
Chez le genre Aplysia, un bouquet de phéromones composé de quatre peptides et polypeptides (Cummins et al., 2005; Cummins et al., 2004; Painter et al., 1998) a été identifié et caractérisé (Figure 16). Ce bouquet a un effet attractant sur les géniteurs et est libéré par les œufs et les individus sexuellement matures. L’expression de ces phéromones est localisée au niveau de la glande de l’albumine, homologue fonctionnel de la glande de l’oviducte (sécrétion de la capsule interne) et des glandes nidamentaires principales (sécrétion de la capsule externe) de la seiche.

Phéromones sexuelles chez les Céphalopodes

L’utilisation des œufs comme vecteur de phéromones sexuelles est également décrite chez les Céphalopodes. Chez Loligo pealeii, il a été démontré que les mâles sont attirés par les grappes d’œufs et que, après les avoir manipulés, ils deviennent agressifs envers leur congénères masculins (King et al., 2003). Cet état d’agressivité est attribué à une phéromone sexuelle : la Loligo-β-microseminoprotéine (Cummins et al., 2011), apparentée aux microséminoprotéines de vertébrés. Cette phéromone est synthétisée et secrétée au niveau de l’épithélium cilié de la glande nidamentaire et des cellules sécrétrices des glandes nidamentaires accessoires. Elle agit en tandem avec les stimuli visuels induits par les pontes : les expériences de King et al. (2003) démontrent le rôle des pontes dans l’attraction visuelle des mâles avec finalement une agressivité induite par la manipulation des œufs. L’état d’agressivité est temporaire et la manipulation régulière des pontes est nécessaire pour maintenir cet état.
Un tel comportement agressif est interprété comme une stratégie de reproduction visant à sélectionner les géniteurs mâles les plus vigoureux, mais aussi les plus aptes à garder les femelles pour les empêcher de s’accoupler avec les autres mâles (Hanlon et al., 1997).
Chez la seiche, il existe peu de données concernant les phéromones. Avant 2012, seul le peptide ILME (Zatylny et al., 2000b) avait été identifié. Ce dernier, libéré par les pontes, facilite la libération d’ovocytes dans la cavité palléale en modulant les contractions de l’oviducte, et stimule la sécrétion des produits capsulaires.
En 2012, dans le cadre de sa thèse, Jérémy Enault identifie trois précurseurs protéiques structuralement apparentés et exprimés par la glande de l’oviducte (GOVI) : SPα, SPα’, et SPβ (Enault et al., 2012).
Ces travaux ont démontré l’existence d’un premier mode de maturation basé sur des clivages de type prohormone convertase au niveau de sites dibasiques (Figure 17), permettant ainsi la libération potentielle de douze peptides et polypeptides. Une étude fonctionnelle a permis de démontrer des activités in vitro ciblées sur les organes impliqués dans l’accouplement et la ponte (peptides α3 et β2). En effet, le peptide β2 déclenche une augmentation de l’amplitude des contractions du pénis ainsi que la stimulation suivi de l’augmentation du tonus basal de l’oviducte et des GNP. En parallèle ce peptide déclenche des contractions au niveau de la branchie qui pourraient induire un mécanisme d’hyperventilation lorsque les géniteurs sont à proximité des œufs afin d’accroître l’imprégnation. Le peptide α3 déclenche contractions de forte amplitude du pénis. Ces résultats expérimentaux tendent à confirmer le rôle des phéromones sexuelles dans la stimulation de l’accouplement.

Approches expérimentales

Antérieurement, la recherche de régulateurs était basée sur le screening de molécules issus d’un extrait peptidique utlisant un test biologique. Pour l’identification de neuropeptides, l’extrait de système nerveux central était soumis à un fractionnement en chromatographie liquide haute performance (HPLC). L’activité des fractions purifiées étaient testée sur un bio-essai ex vivo. Lorsqu’une activité était observée, la fraction active était soumise à une série de purifications successives afin d’obtenir un produit actif pur, condition nécessaire à un séquençage par la dégradation N-terminale d’Edman. Cette approche technique a longtemps été la seule à permettre la caractérisation de peptides régulateurs. Elle permettait d’établir un lien immédiat entre le composé purifié et la fonction biologique.
Désormais, la construction de transcriptomes peut être réalisée relativement rapidement à partir de quelques milligrammes de tissu. Par une approche in silico ciblée, il est alors possible d’identifier spécifiquement les régulateurs d’intérêt en utilisant des critères structuraux : présence d’un peptide signal, types de modifications post traductionnelles, répétition de séquences, etc. L’existence des peptides prédits grâce aux banques données est ensuite vérifiée par le biais d’une analyse peptidomique. Cette approche permet d’une part de déterminer la séquence primaire des produits d’expression matures, mais aussi de réaliser une cartographie tissulaire qui pourra être complétée par une approche immunocytochimique au niveau cellulaire. Ces étapes de caractérisation structurale et de localisation tissulaire sont généralement suivies par une caractérisation fonctionnelle. Cette dernière nécessite de disposer d’un test biologique robuste et d’une molécule synthétique mimétique du régulateur étudié, qui permettront de vérifier l’existence d’une relation dose/activité. (Figure 18).
Lorsque les peptides/polypeptides régulateurs d’intérêt possèdent moins de 60-70 acides aminés, la synthèse chimique sur support solide constitue un moyen rapide de produire une molécule mimétique. Au-delà d’une soixantaine d’acides aminés, la production en système recombinant est plus adaptée, même si certains prestataires proposent des synthèses de composés de plus de 100 acides aminés.
L’approche expérimentale développée dans ce manuscrit repose sur l’exploitation, par des approches in silico et peptidomiques, de bases de données transcriptomiques produites chez la seiche. La multiplicité des transcriptomes produits à partir de différents organes provenant des deux sexes, ainsi que les données d’expression, ont permis de sélectionner quelques familles de neuropeptides susceptibles d’être impliquées dans la régulation de la ponte, qu’il s’agisse de l’ovulation, du transport des ovocytes dans les voies génitales femelles ou de la sécrétion des produits capsulaires par les glandes annexes.

Prélèvements de matériel biologique

Les animaux sont anesthésiés puis prélevés et euthanasiés selon le protocole en vigueur (Gonçalves et al., 2012). Les organes disséqués sont immédiatement congelés dans de l’azote liquide et conservés à -80°C en attendant leur traitement. Les organes destinés aux études fonctionnelles sont mis en balnéation dans une solution de perfusion (Instant Océan® 30g/L, glucose 1mM) et utilisés dans les plus brefs délais. Les organes destinés à l’immunocytochimie sont immédiatement placés dans du Davidson (eau de mer naturelle filtrée : 30%, éthanol 95% : 30%, formaldéhyde 37% : 20%, glycérol 10% : 10% et acide acétique : 10%). Enfin, les pontes fraiches (de moins de 24h) sont collectées pour la recherche de phéromones sexuelles au niveau de la capsule.

Approche transcriptomique

Extraction d’ARN

Pour chaque échantillon 100µg de tissu en poudre sont homogénéisés dans 1 ml de TRI-Reagent froid à partir de 5 individus. Après une centrifugation 10 minutes à 12000g le surnageant contenant les protéines, ADN et ARN, est incubé 5 minutes à température ambiante. 100 µL BCP sont ajoutés. Après 20 minutes de centrifugation à 12000g la phase aqueuse supérieure contenant les ARN est transférée dans un tube RNase Free. Les ARN sont précipités par l’ajout de 500 µL d’isopropanol, suivie de 10 minutes d’incubation à température ambiante, puis d’une centrifugation 10 minutes à 12000g. Le culot contenant les ARN est lavé dans de l’éthanol 70% puis centrifuger 30 secondes à 7500g. Les ARN sont finalement repris dans 20µl d’eau stérile, leur concentration et leur qualité en terme de pureté sont déterminées par une mesure au NanoDrop®. Les ratios 260/280 et 260/230 permettent d’évaluer respectivement d’une part les contaminations protéiques et la présence de phénol et d’autre part la présence de solvants, de sels et de molécules organiques. Si la qualité des ARN n’est pas jugée satisfaisante, ces derniers sont précipités une seconde fois dans l’isopropanol ou en présence d’acétate de sodium 3M pH5. La concentration des ARN est finalement ajustée à 2µg/µL et 10 µL de cette solution sont déposés dans des tubes RNA Stable (SIGMA) et séchés au speed-vac en évitant tout échauffement du tube.

Séquençage et création d’une banque de transcrits

Les échantillons d’ARN conditionnés comme décrit précédemment sont séquencés en prestation par la plateforme Génome Québec (http://www.genomequebec.com/ressources-et-plateformes-technologiques.html) sur un séquenceur Illumina HiSeq4000 en paired end 2 x 100pb.
L’analyse bioinformatique est effectuée par la plateforme de bioinformatique ABIMS (Analyse and Bioinformatics for Marine Science, Roscoff, France) sur des données de séquençage d’ARN provenant du pavillon de l’oviducte et de l’organe olfactif. L’objectif est d’obtenir des transcriptomes de références annotés. L’ensemble des données brutes est filtré et nettoyé à l’aide de Trimmomatic v (0.36) (Bolger et al., 2014), en utilisant les paramètres suivants: ILLUMINACLIP: adapter.fa: 2: 30: 10, LEADING: 5, TRAILING: 5, FENETRE COULISSANTE: 4: 5, MINLEN: 25. La qualité de séquence globale est vérifiée à l’aide de FastQC (v 0.11.5) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc). L’assemblage global est réalisé avec Trinity 2.4.0. (Grabherr et al., 2013), un package dédié à l’assemblage transcriptomique de novo. Une étape de normalisation est réalisée selon la couverture en kmer (kmer de 25 nt, couverture maximale de 30) proposée par le package Trinity.
Les contigs inconsistants générés par Trinity sont supprimés après un remapping des reads en utilisant Bowtie (v 1.1.2) (Langmead et al., 2009), et l’estimation de l’abondance relative en utilisant RSEM (v 1.2.22) (Li and Dewey, 2011) pour obtenir les valeurs FPKM (Les deux logiciels ont été lancés via les wrappers perl fournis par le package Trinity). Seuls les transcrits ayant au moins une valeur FPKM supérieure à 1 et les isoformes correspondant à plus de 1% du nombre total de gènes sont conservés. L’annotation des séquences de contig est réalisée en utilisant le pipeline Trinotate (http://trinotate.github.io), comme décrit dans (Haas et al., 2013).
Les séquences sont blastées contre la base de données NCBI nr (version 193) avec les paramètres de configuration suivants : max BLAST hits 20, min Expect Value 10-3, et contre la base de données Ensembl du protéome humain (version 82) (BLASTX). Seuls les résultats avec des valeurs E <0,001 sont conservés. La prédiction de peptides est réalisée en utilisant le logiciel TranDecoder (Haas et al., 2013).
La recherche de similarité (blastp des peptides prédits par Transdecoder) est effectuée contre la base de données uniprot-swissprot (version 2017-01). La prédiction du peptide signal est réalisée en utilisant l’utilitaire signal P v4.1 (Petersen et al., 2011). La détection des domaines transmembranaires est réalisée en utilisant TMHMM v2.0c (Krogh et al., 2001). La recherche de domaine protéique est effectuée en utilisant hmmscan de la suite hmmer v.3.1b1 par rapport à la base de données Pfam-A (Finn et al., 2014). Enfin, l’annotation fonctionnelle du transcriptome est réalisée en utilisant le pipeline Trinotate.

Analyses in silico

Les analyses in silico sont principalement réalisées avec le logiciel Peptraq. Il s’agit d’un logiciel développé en interne permettant de trier les transcrits, les précurseurs protéiques ou les produits de clivage à partir de fichiers au format fasta ou .txt, sur la base de multiples critères structuraux tel que la composition en acides aminés, la présence de motifs particuliers ou de pattern de cystéines, l’abondance de certains acides aminés, la charge électrique, etc. et au niveau de l’annotation en utilisant des mots clés.
Les prédictions des domaines transmembranaires des protéines sont réalisées avec les utilitaires HMMTOP (www.enzim.hu), TMHMM, version 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) et I-TASSER (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER). Les séquences signales sont prédites avec SignalP Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) et PrediSi (www.predisi.de). Les calculs de masse moléculaire (MW) sont réalisés avec Protein Prospector (prospector.ucsf.edu).
Les séquences sont alignées avec Clustal Omega (www.ebi.ac.uk) et CLC Main Workbench 6.7.1. Les blasts ciblés sur l’espèce Loligo pealeii sont réalisés sur le site dédié ivory.idyll.org/blog/2014-loligo-transcriptome-data.html, quant aux autres blasts, ils sont réalisés sur le site blast.ncbi.nlm.nih.gov.

Approche peptidomique

Extractions

Extraction de neuropeptides

Les organes conservés à -80°C sont préalablement broyés au mortier dans de l’azote liquide. Afin d’optimiser l’étape d’extraction, deux types de milieu d’extraction sont utilisés, à raison de 10 ml de milieu pour 1g de poudre d’organe.
La première extraction est réalisée dans une solution aqueuse d’acide trifluoroacétique 0.1% (TFA) contenant 50mM de dithiothréitol (DTT) en agitation à 4°C pendant 1h.
La seconde extraction est réalisée dans une solution aqueuse contenant 90% de méthanol qualité HPLC acidifiée à 1% avec de l’acide acétique qualité HPLC maintenue en agitation à 4°C pendant 30 minutes.
Après l’extraction, la phase insoluble est éliminée par centrifugation à 30000g pendant 30 minutes à 4°C. Les surnageants sont concentrés et dessalés sur micro-colonne Sep-Pak C18 (Waters) puis séchés. Pour la seconde extraction faisant intervenir un pourcentage élevé de méthanol, le surnageant est préalablement séché et repris dans du TFA 0.1% avant d’être concentré sur micro-colonne.

Extraction de phéromones à partir de la GOVI et des capsules d’œufs

Les capsules internes et externes sont prélevées à partir d’œufs frais et sont congelées et stokées
à -80°C. Les tissus (GOVI et capsules) sont broyés dans l’azote liquide et les peptides sont extrais 1h à 4°C dans un tampon acide (TFA 0.1% ou HFBA (acide heptafluorobutyrique) 0.1%) contenant 50 mM de DTT. 10 ml de milieu sont utilisés pour 1g de poudre de tissu. Après l’extraction, la phase insoluble est éliminée par centrifugation à 30000g pendant 30 minutes à 4°C. Les surnageants sont  concentrés et dessalés sur micro-colonne Sep-Pak C18 puis séchés.

Extraction de phéromones à partir d’eau d’incubation d’œufs

Les œufs fraichement pondus (de moins de 24h) déposés par des femelles maintenues en captivité dans les bassins de la station marine de Luc sur mer sont placés en balnéation dans de l’eau de mer artificielle (Instant Ocean®, 30g/l) préalablement filtrée sur cartouche C18 (Sep-Pak Vac 35cc 10g, Waters). Chaque balnéation est composée de 300 œufs disposés dans 500 ml d’eau de mer artificielle. Après 24h d’incubation, le milieu est prélevé, filtré sur papier Whatman et dilué avec de l’eau ultra pure (un quart du volume initial) pour abaisser la salinité. Cette eau est acidifiée à 0.1% avec du TFA et concentrée sur cartouche C18. L’éluat est finalement aliquoté, séché au speed-vac et conservé à -20°C jusqu’à utilisation.

Purification

Chromatographie Liquide Haute performance en phase inverse (rpHPLC) a. Purification de phéromones du milieu d’incubation des œufs

Les échantillons provenant du milieu d’incubation des œufs sont séparées en deux étapes. Pour la première étape de séparation, les aliquots sont repris dans du TFA 0.1% et centrifugés trois minutes à 17000g. Le système utilisé est une colonne C18 (Nucleodur® EC 250/4 100-10 C18ec) associée à une chaine HPLC Shimadzu® (Pompe LC20AB, détecteur FRC-10A, analyseur CBM20A), et thermorégulée à 40°C (Four CTO-10AS VP). Le volume d’échantillon injecté est de 500µl. Les composés sont séparés selon un gradient d’acétonitrile (ACN) de 0.33%/min. Le débit est fixé à 1mL/min et la détection à 214 nm correspond à la longueur d’onde de la liaison peptidique. Les fractions sont collectées minute par minute et sont séchées au speed-vac. La seconde étape de séparation est réalisée avec la colonne de première étape sans changer de contre ions, avec un gradient quasiment isocratique variant de 39.2 à 40.8% d’ACN en 50 minutes. La chaine HPLC utilisée est une Varian® 9012/9050 et les paramètres de collecte et d’acquisition restent les mêmes que pour la première étape. Les fractions collectées sont poolées selon leur temps de rétention, puis séchées et stockées à -20°C.

Purification de capsules internes et externes

Les extraits capsulaires sont repris dans 200 µl de TFA 0.1%. Les phéromones sont purifiées sur colonne C8 (Nucleodur® EC250/4 100-5 C8ec) reliée à la chaine HPLC Varian®. Le volume d’injection est de 185 µl et les composés sont séparés selon un gradient d’ACN de 0.33%/min après une phase isocratique de 15 minutes à 0% d’ACN. Pendant la phase isocratique, le débit est réglé à 0.2 ml/min et passe à 1 ml/min lors de la phase de séparation. Les fractions sont collectées toutes les deux minutes, puis sont séchées et stockées à -20°C.

Purification de phéromones de GOVI

Les extraits glandulaires sont repris dans 200 µl de TFA 0.1%. Les phéromones sont purifiées sur colonne C8 (Nucleodur® EC250/4 100-5 C8ec) ou C18 (Nucleodur® EC 250/4 100-10 C18ec) reliée à la chaine HPLC Varian®. Le volume d’injection est de 180 µl et les composés sont séparés selon un gradient d’ACN de 0.33%/min après une phase isocratique de 15 minutes à 0% d’ACN. Pendant la phase isocratique, le débit est réglé à 0.2 ml/min et passe à 1 ml/min lors de la phase de séparation. Les fractions sont collectées toutes les deux minutes, puis sont séchées et stockées à -20°C.

Nano-LC-MALDI-TOF/TOF

Les neuropeptides de la partie distale des GNP et du pavillon de l’oviducte sont séparés en Nano-LC avant d’être analysés en spectrométrie de masse. Les extraits tissulaires sont réduits dans 100 mM de DTT pendant 1h à 55°C et alkylés dans 50 mM d’iodoacétamide à 55°C pendant 45 minutes. Les échantillons sont reconcentrés et dessalés sur C18 OMIX-tips (10µl, Agilent) et l’étape de chromatographie est menée sur un système Nano-LC (Prominence, Shimadzu). Les peptides sont concentrés sur une pré-colonne C18 (Zorbax, 5×0.3mm, 5µm, Agilent) et séparés sur une colonne C18 (Zorbax, 150×0.075mm, 0.3µm, Agilent). Les paramètres de séparation sont résumés en figure 19. L’éluat est homogénéisé avec de la matrice CHCA (α-cyano-4 hyroxycinnamic acid) et le mélange est déposé sur une cible MALDI 384 spots à raison d’une fraction toutes les 20 secondes. Les spots sont analysés en spectrométrie de masse MS/MS (voir plus bas).

Réduction, alkylation et digestion trypsique

Les fractions à traiter sont préalablement reprises dans 15µl de bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3) 25 mM. La réduction des ponts disulfures dure 5 minutes à 95°C après l’ajout de 1,5 µl de DTT 100 mM/ NH4HCO3 25 mM. La réduction des ponts disulfures permet de linéariser les protéines afin d’optimiser la digestion trypsique. Les cystéines sont alkylées pendant 20 minutes à l’obscurité dans après addition de 3µl de iodoacétamide 50mM/ NH4HCO3 25 mM. L’alkylation des résidus cystéines permet de bloquer la (re)formation des ponts disulfures après la réduction des groupements thiol.
La digestion trypsique permet de cliver la liaison peptidique située en C-terminal des arginines (R) et des lysines (K). Cette étape de digestion a pour but de permettre l’identification en MS/MS des polypeptides et/ou protéines présents dans l’échantillon. Un microlitre de trypsine à 0,1 µg/µl (dilué dans du NH4HCO3 25 mM) est ajouté au milieu réactionnel. La digestion demande une nuit à 37°C. Les fractions digérées sont finalement séchées et conservées à température ambiante.

Table des matières

Introduction générale
I. Contexte, problématique et objectifs
II. Le modèle Sepia officinalis
A. Généralités
B. Anatomie
1. Anatomie générale
2. Le système nerveux central
3. L’appareil reproducteur
a. Les organes génitaux femelles
b. Les organes génitaux mâles
4. L’appareil circulatoire
5. L’organe olfactif
C. Cycle de vie de la seiche de Manche
D. Reproduction
1. L’ovogénèse
2. L’accouplement
3. La ponte
E. Comportement
III. Peptides et polypeptides régulant la ponte
A. Introduction
B. Les neuropeptides
1. Présentation générale
2. Les neuropeptides chez les Mollusques
C. Les régulateurs ovariens
1. Régulation paracrine chez les Mollusques
2. Régulation paracrine chez la seiche
D. Les phéromones sexuelles
1. Présentation générale
2. Les phéromones sexuelles
3. Phéromones sexuelles chez les Insectes
4. Phéromones sexuelles chez les Mammifères
6. Phéromones sexuelles chez les Céphalopodes
IV. Approches expérimentales
Matériels et méthodes
I. Matériel Biologique
A. Animaux
B. Prélèvements de matériel biologique
II. Approche transcriptomique
A. Extraction d’ARN
B. Séquençage et création d’une banque de transcrits
C. Analyses in silico
III. Approche peptidomique
A. Extractions
1. Extraction de neuropeptides
2. Extraction de phéromones à partir de la GOVI et des capsules d’œufs
3. Extraction de phéromones à partir d’eau d’incubation d’œufs
B. Purification
1. Chromatographie Liquide Haute performance en phase inverse (rpHPLC)
a. Purification de phéromones du milieu d’incubation des œufs
b. Purification de capsules internes et externes
c. Purification de phéromones de GOVI
2. Nano-LC-MALDI-TOF/TOF
C. Réduction, alkylation et digestion trypsique
D. Spectrométrie de masse
E. Séquençage d’Edman
IV. Production de la phéromone β en système recombinant
A. Transformation bactérienne
B. Contrôle de l’intégration du plasmide par PCR
C. Production en système recombinant
D. Extraction et purification de la phéromone β recombinante
E. Dosage Bradford et gel SDS-PAGE
1. Dosage Bradford
2. Gel SDS-PAGE
V. Cartographie tissulaire en immunocytochimie
B. Immunocytochimie
C. Contre-coloration au Trichrome de Prenant-Gabe
D. Observations microscopiques
VI. Synthèse peptidique
VII. Caractérisation fonctionnelle
A. Analyses ex vivo
B. Tests comportementaux
VIII. Analyses structurales en RMN et CD
Partie I : Caractérisation structurale et fonctionnelle de deux familles de neuropeptides impliquées dans le contrôle de la ponte
I. Introduction
II. Crustacean Cardioactive Peptides
III. Neuropeptides FLGamides
IV. Conclusion
Partie II : Caractérisation de phéromones sexuelles et production en système recombinant
I. Introduction
A. Phéromones sexuelles, ponte et reproduction
B. Phéromones sexuelles chez le genre Aplysia
C. Phéromones sexuelles chez Sepia officinalis
D. Objectifs
II. Résultats et discussion
A. Caractérisation structurale des précurseurs SP
1. À partir de la glande de l’oviducte
2. À partir des capsules d’œufs
3. À partir de l’eau d’incubation des œufs
4. À partir de l’eau d’incubation des œufs fractionnée en rpHPLC
B. Recherche de récepteurs candidats à la liaison des phéromones sexuelles
C. Production de la phéromone β et tests fonctionnels
III. Conclusions et perspectives
Conclusion générale et perspectives
Références bibliographiques

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