IBTSS-05-OMM
Extraction de l’ADN
INTRODUCTION
Le diabète de type 1 représente 5 % à 10 % des cas de diabète observés dans le monde, bien loin derrière le diabète de type 2(non insulinodépendant). L’organisation mondiale de la santé (OMS) estime à 180 millions le nombre total de diabétiques dans le monde et 10 à 15 millions souffrant du diabète de type 1.
La pathologie du diabète vient en deuxième position du classement des maladies chroniques derrière l’hypertension, en Algérie, selon la 3éme étude nationale 2006. Le nombre de personnes atteintes de diabète est en progression, passant de 0,3% chez les sujets âgés de moins de 35 ans à 4,1% chez les 35 à 59 ans et 12,5% chez les plus de 60 ans [Ministère de la Santé, de la Population et de la Réforme Hospitalière Algérie 2009].
La prévalence totale, des diabétiques en Algérie est passée d’un million de personnes en 1993, à plus de 2 500 000 personnes en 2007, soit 10% de la population [OMS].
L’incidence du diabète de type 1 avant 15 ans est en progression ; dans la région de Constantine, l’incidence passe de 9,1 en 1997 à 12,3 pour 100 000 en 2002 [Belhadj M.et al 2005]. Dans la région de Tlemcen (Ouest Algérien) sur un échantillon la prévalence du diabète de type 2 (initialement appelé diabète non insulinodépendant : DNID) est de 10,5 % et celle du diabète de type 1 (appelé insulinodépendant : DID) de 3,7 %.
La prévalence globale du diabète à Tlemcen est alors de 14,2 %, les hommes 20,4 % étant plus touchés que les femmes 10,7 %. Cette prévalence globale est de 15,3 % en milieu urbain et de 12,9 % en milieu rural. Plus de 50 % des diabétiques ont au moins un membre de leur famille atteint de la maladie [Salah Zaoui et al 2007]. A Sétif et à Mostaganem la prévalence (tous les cas, nouveaux ou non, à un moment donné) augmente avec l’âge. La prévalence des tranches d’âge de 25 à 64 ans dans ces deux régions et par décennie est de 4,9 %, 4,8 %, 7,9 % et 8 % respectivement. Le diabète est donc près de deux fois plus fréquent après 45 ans d’après ces études L’incidence du DT1 dans différents groupes ethniques est extrêmement variable, suggérant aussi bien la participation de déterminants génétiques que des éléments de l’environnement [Y. Park et al 2000].
Synthèse Bibliographique
Différents aspect d’insulite peuvent être observés :
Infiltrat péri-insulaire par des macrophages (possible stade précoce) infiltrat lymphocytaire péri-insulaire (péri-insulite) ou pénétrant les ilots La destruction des cellules Semble rapidement complète chez le petit enfant, alors que 40% des sujets de plus de 15 ans conservent à long terme des cellules β qui échappent à l’infiltrat inflammatoire [GUY GORCHOV, THOMAS PAPO 2000].
Classification étiologique des diabètes type 1
La classification étiologique des diabètes sucrés a été proposée par l’ADA (l’Association Américaine du Diabète) et l’OMS. Cette classification actualise en fonction des données scientifiques récentes, celle du National Diabetes Data Group [National Diabetes Data Group 1979].
Les termes de diabète de type 1 (chiffres arabes) remplacent le terme DID :
Le diabète de type 1 correspond à la destruction des cellules β aboutissant habituellement à une carence absolue d’insuline.
Synthèse Bibliographique
La greffe du pancréas implique d’implanter un pancréas sain (un qui peut produire de l’insuline) chez une personne qui a le diabète. Puisque le pancréas exécute des fonctions nécessaires dans le procédé de digestion, le pancréas indigène du destinataire est laissé en place, et le pancréas donné joint dans un endroit différent. En cas du rejet du nouveau pancréas, le destinataire ne pourrait pas continuer à survivre sans pancréas indigène en place.
Le pancréas sain provient d’un donateur qui vient juste de mourir ou peut être une partie du pancréas d’un donateur vivant [Larsen Jl 2004]. Les greffes entières de pancréas des donateurs vivants ne sont pas encore possibles parce que le pancréas est un organe nécessaire pour la digestion. Actuellement, des greffes de pancréas sont réalisées chez les personnes avec du diabète insulinodépendant qui ont des complications graves.
Gène de l’insuline : le locus IDDM2
En 1974, les scientifiques ont découvert que des variantes particulières des gènes du CMH étaient fortement associées au diabète de type 1 ; les personnes qui héritent des variantes DR3 et DR4 sont exposées à un risque de développer un diabète 10 à 20 fois supérieur par rapport à d’autres personnes, par contre, ceux qui héritent de la variante DR2 bénéficient d’une forte protection [Merriman 2004]. La contribution génétique la plus importante au risque de diabète de type 1 est codée dans le complexe HLA sur le chromosome 6 sur le bras court [Concannon P. 1998].
Mais de nombreux facteurs montrent que le caractère génétique du diabète de type 1 n’est pas uniquement lié à ce système. En 1984, une association génétique entre le diabète de type 1 et une région polymorphe localisée à l’extrémité 5’du gène de l’insuline a été rapportée pour la première fois dans une étude cas-témoins [Bell et al 1984].
Aspects immunologiques du diabète de type1 (DT1)
Le diabète de type 1 est causé par la destruction auto-immune spécifique et progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans alors que les autres types de cellules dans l’îlot (alpha, delta et PP) sont épargnés. Les auto-antigènes du diabète de type 1A peuvent être divisés en sous-groupes en fonction de leurs distributions tissulaires : antigènes des cellules bêta-spécifiques comme l’insuline, les dérivés de l’insuline, et IGRP (Islet-specific Glucose-6-phosphatase catalytic subunit Related Peptide); antigènes neuroendocrine comme carboxypeptidase H, insulinome antigène associé (IA-2), l’acide glutamique décarboxylase (GAD65), et E carboxypeptidase; et ceux exprimés de façon ubiquitaire comme la protéine de choc thermique 60 (un auto-antigène putatif du diabète de type 1).
MATERIELS ET METHODES
Phase d’extraction
Ajouter 1 ml de phénol et 1 ml de chloroforme-alcool isoamylique, agiter manuellement pendant 5 min, puis centrifuger 7 min à 2500 rpm. Prendre la phase aqueuse et ajouter 2 ml de chloroforme/alcool isoamylique, et agiter manuellement pendant 5 min, puis centrifuger 7 min à 2500 rpm.
Phase de précipitation
Récupérer soigneusement la phase aqueuse contenant l’ADN et la transférer dans un nouveau tube, puis ajouter 625μl d’acétate d’ammonium 10M. Mélanger brièvement par vortex, puis ajouter 6 ml d’éthanol à 96% froid. On voit apparaitre la méduse d’ADN.
Conservation de l’ADN
Centrifuger pendant 30 min à 4000 rpm, et éliminer le surnageant, l’ADN se trouve alors dans le culot. Ensuite laver par 6 ml d’éthanol à 70% tout en agitant, puis centrifuger à 4000 rpm pendant 30 min. Eliminer le surnageant et incuber à 56°C pendant 1 heure pour éliminer toute trace d’alcool. A la fin, resuspendre l’ADN dans du TE 10 /1.
CONCLUSION
Le diabète constitue une des maladies les plus répandues dans le monde et la deuxième en Algérie et ses symptômes apparaissent chez les individus longtemps après le déclenchement des causes. Cet aspect de la maladie entraine une détérioration rapide de la santé des patients et la nécessité de l’administration de l’insuline. Les études effectuées sur le plan moléculaire tentent de trouver des gènes de susceptibilité à cette maladie ce qui permettra un diagnostic et une identification précoce des individus à risque.
Nous avons réalisé notre étude sur un échantillon de 106 personnes dont 47 femmes et 59 hommes. Parmi les femmes 28 sont atteintes de diabète de type 1 et chez les hommes 25.
Nous pouvons conclure que l’analyse statistique, par le test khi deux, de notre échantillon montre qu’il n’y a aucun effet de la consanguinité ni de l’indice de masse corporelle ni l’effet du sexe sur le déclenchement du diabète de type 1.
En effet la littérature mentionne que les causes exactes de l’apparition du diabète de type 1 demeurent inconnues. Des facteurs environnementaux pourraient être impliqués.
Cependant certains gènes de susceptibilité ont été décrits. Ces derniers diffèrent d’une population à une autre.
L’analyse moléculaire est la solution ultime pour la révélation des gènes susceptibles du DT1. Pour cela dans notre travail nous avons réalisé des extractions d’ADN puis des amplifications des gènes CTLA-4 et INS-VNTR.
Les extractions d’ADN ont été réalisées selon deux méthodes, sur un certain nombre d’échantillons, en vu d’une comparaison (extraction au phénol-chloroforme ou au NaCl). La première méthode est celle qui nous a donné satisfaction (volume de sang très petit, économique en produits et permet d’obtenir de l’ADN à un haut degré de pureté) et pour cela nous l’avons adopté pour l’ensemble des échantillons et la suite de notre étude.
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Table des matières
INTRODUCTION
Objectif
Chapitre I -Synthèse Bibliographique
1.1- Aspect clinique
1.1.1-Anatomie et physiologie du pancréas
1.1.2- Anatomie pathologique : l’insulite
1.1.3- Classification étiologique du diabète de type 1 (DT1)
a) diabète de type 1 auto-immun
b) diabète de type 1 idiopathique
1.1.4- Symptômes
1.1.5- Diagnostic et évolution
1.1.6- Traitement
1.1.6.1-Traitement par insuline
1.1.6. 2- Thérapie cellulaire
1.1.6.3- Immunothérapie
1.1.6.4- Greffe du pancréas
1.1.7- Complications
1.1.8- Prévention et conseils
1.2-Aspect génétique
1.2.1-Évaluation fonctionnelle des gènes candidats de la susceptibilité au DT1
1.2.2- Locus de susceptibilité héritée pour le DT1
1.2.3- Gène de l’insuline : le locus IDDM2
INS-VNTR
1.2.3.1- Mécanisme biologique de l’action du locus IDDM2
1.2.4- Gène CTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)
1.2.4.1- Rôle de la molécule CTLA4
Processus de présentation de l’antigène aux cellules T par les molécules HLA classe II
1.2.4.2-les polymorphismes du CTLA-4 dans le DT1
Résumé de la signification génétique et fonctionnelle des SNP dans le gène CTLA4
1.3- Aspects immunologiques du DT1
1.3.1-Mécanisme de la réaction auto-immune dans le DT1
Pathogénie de la destruction des îlots de Langerhans
1.3.2 – les auto-anticorps dans la prédiction du DT1
1.3.3 -Marqueurs immunologiques du DT1
1.3.3.1- Anticorps anti-Cytoplasme des Ilôts (ICA)
1.3.3.2- Auto-anticorps anti-insuline (IAA)
1.3.3.3- Auto-anticorps anti-acide-glutamique decarboxylase (GADA)
1.4-Facteurs de risques environnementaux du DT1
1.4.1-L’environnement prénatal
1.4.2- Le facteur de risque alimentaire
1.4.2.1- L’allaitement maternel
1.4.2.2- Le lait de vache
1.4.2.3- La vitamine D
1.4.3- Les infections
1.4.3.1- Les infections virales
1.4.4 – Les toxines
1.4.5-Les variations saisonnières du DT1
1.4.6-Les autres causes
SOMMAIRE
Chapitre 2 -MATERIEL ET METHODES
2.1 -Echantillonnage
2.2 – Analyses des échantillons
2. 3- Prélèvement du sang
2. 4- Mesure de l’indice de masse corporelle (IMC)
2.5- Extraction de l’ADN à partir du sang total
2.5.1- Méthode d’extraction au NaCl
2.5.2- Méthode d’extraction au phénol-chloroforme
2.6- Contrôle de la qualité de l’ADN
2.6.1- Pureté de l’ADN
2.7- La PCR (Polymérase Chain Reaction)
2.7.1- Principe
2.7.2- Échantillon
2.7.3- Matériels nécessaires pour la PCR
a.Biologique
b.Non biologique
2.7.4- Protocole de l’amplification
2.7.5- Procédure de la PCR
2.7.5- Avant la réalisation
Programme PCR pour le SNP +49 du gène CTLA4
Programme PCR pour le SNP -23 Hph1 du gène INS-VNTR
Programme PCR pour le gène HLA-DMB
2.8- Electrophorèses sur gel d’agarose
2.8.1- Principe
2.8.2- Procédure de l’électrophorèse sur gel d’agarose
2.8.2.1-Préparation du gel d’agarose
2.8.2.2-Dépôt des produits d’amplification. Observation du gel sous UV
2.8.4-Avertissement
Chapitre 3 -RESULTATS ET DISCUSSION
3. 1-Analyses statistiques
3.1.1- Effet du sexe dans le déclenchement du DT1
Distribution des diabétiques de type 1 et des témoins en fonction du sexe
Nombre et fréquences de nos échantillons
3.1.2- Effet de la consanguinité sur le déclenchement du DT1
Distribution des individus selon la consanguinité chez les DT1 et les témoins
Fréquence de la consanguinité
3.1.3 Effet de l’IMC sur l’apparition du DT1
Distribution de l’IMC dans notre échantillon
Moyenne générale de la distribution de l’IMC
3.2-Analyse moléculaire
3.2.1 – Extraction de l’ADN
Electrophorèse après extraction au phénol
3.2.2- Concentration et pureté de l’ADN
3.2.3- La PCR
Les données génotypiques
Electrophorèse après amplification du SNP -23Hph1 du gène INS-VNTR à Tm 55°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54,5°C
SOMMAIRE
Electrophorèse après amplification du gène INS-VNTR à Tm 53°C
Electrophorèse après amplification du gène HLA-DMB à Tm 62°C
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
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