Extraction de l’ADN
Extraction de l’ADN
Pour les prรฉlรจvements cryoprรฉservรฉs, lโextraction a รฉtรฉ rรฉalisรฉe ร lโaide du kit NucleoSpin Tissueยฎ (Macherey-Nagel, Dรผren, Germany). Lโextraction a comportรฉ quatre รฉtapes. La premiรจre รฉtape consistait en une lyse cellulaire avec digestion protรฉique. Lors de la deuxiรจme รฉtape, lโรฉchantillon a รฉtรฉ dรฉposรฉ sur colonne et absorbรฉ sur une membrane de silice.
La troisiรจme รฉtape visait ร รฉliminer les impuretรฉs. Enfin, lโADN a รฉtรฉ รฉluรฉ ร lโaide dโune solution pauvre en sels. La concentration dโADN obtenue a รฉtรฉ mesurรฉe ร lโaide du spectromรจtre Nanodrop ND-1000ยฎ (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). Pour les tissus fixรฉs au formol et inclus en paraffine (formalin-fixed paraffin-embedded ou FFPE), lโextraction a รฉtรฉ prรฉcรฉdรฉe dโune รฉtape de dรฉparaffinage ; les autres รฉtapes du processus รฉtaient les mรชmes que pour les tissus congelรฉs.
Sรฉquenรงage Sanger:
Le sรฉquenรงage Sanger a permis d’รฉtudier les gรจnes suivants : IDH1, IDH2, H3.1, H3.3, TERT et ACVR1.
Amplification par PCR
50ng dโADN ont รฉtรฉ ajoutรฉs au mix dโamplification, rรฉalisรฉ selon les recommandations du fabricant ร lโaide du kit FastStart PCR Masterยฎ (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). La rรฉaction dโamplification a รฉtรฉ rรฉalisรฉe sur le thermocycleur VeritiTMยฎ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Pour contrรดler lโefficacitรฉ de lโamplification, 5ฮผl du produit dโamplification ont รฉtรฉ dรฉposรฉs sur gel dโagarose 2% avec BET.
Sรฉquenรงage Sanger
2ฮผl du produit purifiรฉ de la PCR dโamplification ont รฉtรฉ ajoutรฉs au mix de rรฉaction de sรฉquence, rรฉalisรฉ ร lโaide du kit Premix BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencingยฎ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon les recommandations du fabricant. La rรฉaction de sรฉquence a รฉtรฉ rรฉalisรฉe sur un thermocycleur VeritiTMยฎ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon le schรฉma suivant : 1 minute ร 96ยฐC , puis 25 cycles de 10 secondes ร 95ยฐC, 5 secondes ร 50ยฐC et 4 minutes ร 60ยฐC, puis 4ยฐC en continu. Le sรฉquenรงage a รฉtรฉ exรฉcutรฉ sur le sรฉquenceur ABI Prism 3130ยฎ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les rรฉsultats ont รฉtรฉ interprรฉtรฉs ร lโaide du logiciel Sequencing Analysisยฎ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les primers utilisรฉs sont dรฉtaillรฉs dans le tableau A-I (Annexes).
Next Generation Sequencing
Le NGS a รฉtรฉ rรฉalisรฉ ร lโaide de la puce Ion AmpliSeqTM Comprehensive Cancer Panel (Ion Torrent, Life Technologies, Guilford, USA), ciblant les exons de 409 oncogรจnes et gรจnes suppresseurs de tumeurs. Il a รฉtรฉ fait sur la plateforme SNP-Transcriptome-Epigรฉnomique (STE, Pr Ph. Guardiola, Pรดle de Biologie, CHU Angers) sur 30 รฉchantillons de la cohorte. Ont รฉtรฉ analysรฉs le gรจne TP53 et dโautres gรจnes dโintรฉrรชt tels que ATRX, EGFR, EZH2, BRAF, CDKN2A, CDKN2B, CIC, PDGFRa et PTEN (en cours). Le NGS a รฉgalement permis dโanalyser le nombre de copies du gรจne EGFR (donc son statut amplifiรฉ ou non) pour certains รฉchantillons pour lesquels nous ne disposions pas de matรฉriel congelรฉ.
Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP array)
Une analyse pangรฉnomique par SNP array portant sur 23 prรฉlรจvements cryoprรฉservรฉs de notre cohorte a รฉtรฉ rรฉalisรฉe sur la plateforme STE (Pr Ph. Guardiola). Lโanalyse a รฉtรฉ effectuรฉe ร lโaide de puces CytoSNP-850K Infiniumยฎ HD Assay Super (Illumina, San Diego, CA, USA) comprenant 850 000 marqueurs rรฉpartis sur lโensemble du gรฉnome. Les lames ont รฉtรฉ scannรฉes ร lโaide du systรจme Illumina iScanยฎ. Lโanalyse des donnรฉes a รฉtรฉ effectuรฉe ร lโaide du logiciel GenomeStudioยฎ (Illumina, San Diego, CA, USA). Elle a permis de dรฉtecter les gains et pertes de matรฉriel chromosomique, tels quโun gain du chr 7, une perte des chrs 9p et 10 et une amplification du gรจne de lโEGFR.
Analyses statistiques:
Nous avons utilisรฉ le logiciel PRISM5 pour l’analyse statistique des donnรฉes de survie.Les courbes de survies sans progression et globale ont รฉtรฉ estimรฉes par la mรฉthode de Kaplan- Meier et comparรฉes ร lโaide du test Log-Rank. Un p < 0,05 a รฉtรฉ considรฉrรฉ comme significatif.
RESULTATS
Donnรฉes clinico-radiologiques
Lโensemble de la cohorte est prรฉsentรฉ dans les tableaux I (ci dessous) et A-II (Annexes). Cette cohorte comportait 32 hommes et 19 femmes. Lโรขge moyen au diagnostic รฉtait de 34,3 ans avec des extrรชmes de 21 et 40 ans. Quarante-neuf tumeurs รฉtaient de siรจge hรฉmisphรฉrique cรฉrรฉbral (96%) et deux รฉtaient dรฉveloppรฉes aux dรฉpens du TC (4%), chez des patients de 23 et 40 ans. Les tumeurs hรฉmisphรฉriques cรฉrรฉbrales รฉtaient volontiers antรฉrieures (40/51 cas, 78%), c’est-ร -dire frontales et/ou temporales et/ou insulaires. Chez les patients de moins de 30 ans, cette localisation antรฉrieure intรฉressait 92% des cas (11/12 cas).A partir des donnรฉes cliniques recueillies pour chaque patient, nous avons recensรฉ 12 GB II (12/51 cas, 23,5%). L’รขge moyen au diagnostic de ces GB II รฉtait de 30,8 ans ; il existait une prรฉdominance masculine (sexe ratio H/F : 3, 9/3). Toutes les tumeurs รฉtaient hรฉmisphรฉriques cรฉrรฉbrales, prรฉfรฉrentiellement de siรจge antรฉrieur (10/12 cas, 83%). Le temps de latence moyen entre le diagnostic de tumeur gliale de plus bas grade et celui de GB รฉtait de 40,8 mois.La cohorte comportait 39 GB I (39/51, 76,5%) avec une moyenne d’รขge au diagnostic de 35,3 ans, un sexe ratio de 1,43 (23H/16F) et une localisation hรฉmisphรฉrique trรจs majoritaire (37 GB hรฉmisphรฉriques (37/39, 95%) vs 2 GB du TC (5%)).Aucun patient nโavait dโantรฉcรฉdent personnel de cancer, cรฉrรฉbral ou autre. Il nโa pas รฉtรฉ recensรฉ de syndrome de prรฉdisposition familiale au cancer (syndromes de Li-Fraumeni, Lynch, Cowdenโฆ) dans notre cohorte. A noter cependant un antรฉcรฉdent de GB maternel chez un des patients (GB nยฐ51, diagnostic ร 38 ans).
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Table des matiรจres
LISTE DES ABREVIATIONS
PLAN
I. INTRODUCTIONย
II. MATERIEL ET METHODES
1. Prรฉlรจvements tumoraux
2. Sรฉlection du matรฉriel biologique
3. Etude immunohistochimique
3.1. Technique immunohistochimique
3.2. Interprรฉtation des immunomarquages
4.Extraction de l’ADN
5. Sรฉquenรงage Sanger
5.1. Amplification par PCR
5.2. Sรฉquenรงage Sanger
6. Next Generation Sequencing
7. Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP array)
8. Analyses statistiques
III- RESULTATS
1.Donnรฉes clinico-radiologiques
2. Altรฉrations gรฉnรฉtiques
2.1. IDH1/2
2.2. Histones H3.1 et H3.3
2.3. TP53
2.4. TERT
2.5. ACVR1
2.6. BRAF-V600E
3.Altรฉrations chromosomiquesย
4.Dรฉfinition de 4 groupes de GB du sujet jeune
IV- DISCUSSION
V- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
TAKE HOME MESSAGES
REFERENCES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
TABLE DES MATIERES
ANNEXES
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