Extraction de l’ADN

Extraction de l’ADN

Extraction de l’ADN

Pour les prélèvements cryopréservés, l’extraction a été réalisée à l’aide du kit NucleoSpin Tissue® (Macherey-Nagel, Düren, Germany). L’extraction a comporté quatre étapes. La première étape consistait en une lyse cellulaire avec digestion protéique. Lors de la deuxième étape, l’échantillon a été déposé sur colonne et absorbé sur une membrane de silice.
La troisième étape visait à éliminer les impuretés. Enfin, l’ADN a été élué à l’aide d’une solution pauvre en sels. La concentration d’ADN obtenue a été mesurée à l’aide du spectromètre Nanodrop ND-1000® (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). Pour les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (formalin-fixed paraffin-embedded ou FFPE), l’extraction a été précédée d’une étape de déparaffinage ; les autres étapes du processus étaient les mêmes que pour les tissus congelés.
Séquençage Sanger:
Le séquençage Sanger a permis d’étudier les gènes suivants : IDH1, IDH2, H3.1, H3.3, TERT et ACVR1.

Amplification par PCR
50ng d’ADN ont été ajoutés au mix d’amplification, réalisé selon les recommandations du fabricant à l’aide du kit FastStart PCR Master® (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). La réaction d’amplification a été réalisée sur le thermocycleur VeritiTM® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Pour contrôler l’efficacité de l’amplification, 5μl du produit d’amplification ont été déposés sur gel d’agarose 2% avec BET.

Séquençage Sanger
2μl du produit purifié de la PCR d’amplification ont été ajoutés au mix de réaction de séquence, réalisé à l’aide du kit Premix BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon les recommandations du fabricant. La réaction de séquence a été réalisée sur un thermocycleur VeritiTM® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) selon le schéma suivant : 1 minute à 96°C , puis 25 cycles de 10 secondes à 95°C, 5 secondes à 50°C et 4 minutes à 60°C, puis 4°C en continu. Le séquençage a été exécuté sur le séquenceur ABI Prism 3130® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les résultats ont été interprétés à l’aide du logiciel Sequencing Analysis® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les primers utilisés sont détaillés dans le tableau A-I (Annexes).

Next Generation Sequencing
Le NGS a été réalisé à l’aide de la puce Ion AmpliSeqTM Comprehensive Cancer Panel (Ion Torrent, Life Technologies, Guilford, USA), ciblant les exons de 409 oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs. Il a été fait sur la plateforme SNP-Transcriptome-Epigénomique (STE, Pr Ph. Guardiola, Pôle de Biologie, CHU Angers) sur 30 échantillons de la cohorte. Ont été analysés le gène TP53 et d’autres gènes d’intérêt tels que ATRX, EGFR, EZH2, BRAF, CDKN2A, CDKN2B, CIC, PDGFRa et PTEN (en cours). Le NGS a également permis d’analyser le nombre de copies du gène EGFR (donc son statut amplifié ou non) pour certains échantillons pour lesquels nous ne disposions pas de matériel congelé.

Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP array)
Une analyse pangénomique par SNP array portant sur 23 prélèvements cryopréservés de notre cohorte a été réalisée sur la plateforme STE (Pr Ph. Guardiola). L’analyse a été effectuée à l’aide de puces CytoSNP-850K Infinium® HD Assay Super (Illumina, San Diego, CA, USA) comprenant 850 000 marqueurs répartis sur l’ensemble du génome. Les lames ont été scannées à l’aide du système Illumina iScan®. L’analyse des données a été effectuée à l’aide du logiciel GenomeStudio® (Illumina, San Diego, CA, USA). Elle a permis de détecter les gains et pertes de matériel chromosomique, tels qu’un gain du chr 7, une perte des chrs 9p et 10 et une amplification du gène de l’EGFR.

Analyses statistiques:
Nous avons utilisé le logiciel PRISM5 pour l’analyse statistique des données de survie.Les courbes de survies sans progression et globale ont été estimées par la méthode de Kaplan- Meier et comparées à l’aide du test Log-Rank. Un p < 0,05 a été considéré comme significatif.

RESULTATS

Données clinico-radiologiques
L’ensemble de la cohorte est présenté dans les tableaux I (ci dessous) et A-II (Annexes). Cette cohorte comportait 32 hommes et 19 femmes. L’âge moyen au diagnostic était de 34,3 ans avec des extrêmes de 21 et 40 ans. Quarante-neuf tumeurs étaient de siège hémisphérique cérébral (96%) et deux étaient développées aux dépens du TC (4%), chez des patients de 23 et 40 ans. Les tumeurs hémisphériques cérébrales étaient volontiers antérieures (40/51 cas, 78%), c’est-à-dire frontales et/ou temporales et/ou insulaires. Chez les patients de moins de 30 ans, cette localisation antérieure intéressait 92% des cas (11/12 cas).A partir des données cliniques recueillies pour chaque patient, nous avons recensé 12 GB II (12/51 cas, 23,5%). L’âge moyen au diagnostic de ces GB II était de 30,8 ans ; il existait une prédominance masculine (sexe ratio H/F : 3, 9/3). Toutes les tumeurs étaient hémisphériques cérébrales, préférentiellement de siège antérieur (10/12 cas, 83%). Le temps de latence moyen entre le diagnostic de tumeur gliale de plus bas grade et celui de GB était de 40,8 mois.La cohorte comportait 39 GB I (39/51, 76,5%) avec une moyenne d’âge au diagnostic de 35,3 ans, un sexe ratio de 1,43 (23H/16F) et une localisation hémisphérique très majoritaire (37 GB hémisphériques (37/39, 95%) vs 2 GB du TC (5%)).Aucun patient n’avait d’antécédent personnel de cancer, cérébral ou autre. Il n’a pas été recensé de syndrome de prédisposition familiale au cancer (syndromes de Li-Fraumeni, Lynch, Cowden…) dans notre cohorte. A noter cependant un antécédent de GB maternel chez un des patients (GB n°51, diagnostic à 38 ans).

Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
PLAN
I. INTRODUCTION 
II. MATERIEL ET METHODES
1. Prélèvements tumoraux
2. Sélection du matériel biologique
3. Etude immunohistochimique
3.1. Technique immunohistochimique
3.2. Interprétation des immunomarquages
4.Extraction de l’ADN
5. Séquençage Sanger
5.1. Amplification par PCR
5.2. Séquençage Sanger
6. Next Generation Sequencing
7. Single Nucleotide Polymorphism Array (SNP array)
8. Analyses statistiques
III- RESULTATS
1.Données clinico-radiologiques
2. Altérations génétiques
2.1. IDH1/2
2.2. Histones H3.1 et H3.3
2.3. TP53
2.4. TERT
2.5. ACVR1
2.6. BRAF-V600E
3.Altérations chromosomiques 
4.Définition de 4 groupes de GB du sujet jeune
IV- DISCUSSION
V- CONCLUSION ET PERSPECTIVES
TAKE HOME MESSAGES
REFERENCES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
TABLE DES MATIERES
ANNEXES

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