Extraction d’ARN viral chez les moustiques

Virus de la Fièvre de la Vallée du Rift

Classification du virus

Deux vétérinaires, Daubney et Hudson, et un médecin, Garnham, décrivent en 1931 l’affection des moutons d’une ferme située au Lac Naivasha au Kenya. Ces mêmes auteurs identifient le virus responsable sous le nom de virus de la Fièvre de la Vallée du Rift. En 1948, Smithburn, Haddow et Gilbert isolent le virus à partir d’un moustique de la forêt Semliki en Ouganda, établissant ainsi son appartenance au groupe des arbovirus (cité par Teou 1991).
Famille : Bunyaviridae
Genre : Phlebovirus
Les Bunyavirus regroupent environ 100 virus. Ils ont une taille moyenne de 90-120 nm de diamètre avec des nucléocapsides tubulaires à polarité négative parfois ambisens (phlebovirus) et à ARN segmenté simple brin.

Structure du virus

L’agent pathogène de la FVR est un virus à ARN négatif simple brin tri-segmenté. Il a une symétrie hélicoïdale de 80 à 120nm de diamètre. Le génome viral est composé de trois segments d’ARN de tailles différentes dénommés S, M et L pour Small, Medium et Large respectivement. Chaque ARN se trouve sous forme de ribonucléoprotéine (RNP) de forme circulaire, où sont associées de nombreuses copies de la protéine N et quelques copies de la protéine L qui a une activité d’ARN-polymérase ARN-dépendante. Les séquences aux extrémités 3’ et 5’ sont complémentaires et peuvent s’apparier de façon stable en « queue de poêle » et sont communes à tous les Phlebovirus. Le segment L code pour la polymérase L, le segment M pour une polyprotéine qui subit un clivage co-traductionnel pour donner les deux protéines d’enveloppe (Gc et Gn) ainsi que deux protéines non structurales. Le segment S, par la stratégie ambisens code pour la nucléoprotéine N dans le sens antigénomique et pour une protéine non structurale (NSs) dans le sens génomique. Le virus est enveloppé par deux glycoprotéines Gc et Gn de 65 et 56kDA respectivement. Ces glycoprotéines sont responsables de la fixation du virus à la surface des cellules. Elles sont aussi le support de l’activité hémagglutinante et la cible de la réponse immunitaire humorale. La longueur totale du segment M est de 3884 nucléotides correspondant à un poids moléculaire de 1.38×105 DA.
Il est composé de 27.3 % d’A (Alanine), 25.4 % de G (guanine), 27,2 de % d’U (uracile) et 20,1 % de C (cytosine) (Collett et al., 1985). La longueur du segment S est de 1690 nucléotides et celle du segment L est de 6404 nucléotide. Les Figures 3 et 4 montrent le schéma du virus et le mode de réplication de chaque segment.

Propriétés physico-chimiques

Le virus est stable dans le sérum et peut être récupéré après plusieurs mois de conservation à 4°C ou après 3 heures à 56°C. Il survit dans les aérosols à 23°C avec une humidité de 50-85%. Il peut être maintenu dans l’organisme de certains arthropodes vecteurs (œufs pour les Aedes) et peut résister à un contact avec le phénol à 4°C pendant six mois. Il est plus stable à des températures inférieur à -60°C. Il résiste aux pH basiques mais il est inactivé à pH inférieur à 6,2. Il est inactivé par les solvants lipides, éther et chloroforme et par les solutions fortes d’hypochlorite de sodium ou de calcium. Dans ce cas, le chlore résiduel doit dépasser 5 000 ppm (WOAH, 2009).

Pathologie

Suite à la piqûre d’un moustique infecté, le virus suit la voie lymphatique dans le vertébré et se réplique dans les ganglions lymphatiques entrainant une virémie primaire. Ensuite, il est entrainé avec la circulation sanguine et rejoint les organes cibles : le foie, la rate. Le virus a été aussi retrouvé dans le cerveau d’animaux morts suite à des encéphalites. Les caractéristiques pathologiques de la FVR chez le bétail et les humains peuvent varier considérablement. En effet, une leucopénie est souvent observée au cours des 3 ou 4 premiers jours d’infection. Pendant les phases aiguës, les taux d’enzymes sériques sont souvent modifiés, ce qui indique la destruction des hépatocytes. L’infection des animaux gravides se traduit souvent par l’avortement du fœtus. En effet, d’après Greboval, chez les femelles en gestation, le virus présente un tropisme pour les cotylédons placentaires qu’il colonise par voie sanguine (Greboval, 2004). La mort du fœtus est due à son infection généralisée par le virus et non à une placentite (Greboval, 2004). L’avortement fait suite à un pic hyperthermique chez la femelle en gestation. Cependant, aucune corrélation n’a été observée pour l’homme infecté par le virus de la FVR et la survenue d’avortement (Smith et al., 2010, disponible en ligne sur : www.elsevier.com/locate/yviro)

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Table des matières

I – INTRODUCTION
II – LA Fièvre de la Vallée du Rift : APERÇU BIBLIOGRAPHIQUE
II-1 HISTORIQUE DE LA MALADIE FVR ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE
II.2 – EPIDEMIOLOGIE
II.2.1 – Virus de la Fièvre de la Vallée du Rift
II.2.1.1 – Classification du virus
II.2.1.2 – Structure du virus
II.2.1.3 – Propriétés physico-chimiques
II.2.1.4 – Pathologie
II.2.2 – Hôtes
II.2.3 – Réservoirs
II.2.4 – Vecteurs
II.2.4.1 – Compétence et capacité vectorielle
II.2.4.2 – Réplication du virus dans le moustique .
III – ZONES D’ETUDES
III.1 – Mampikony
III.2 – Toliary
IV- MATERIELS ET METHODES
IV.1 – ETUDES ENTOMOLOGIQUES
IV.1.1 – Capture des moustiques
IV.1.1.1 – Capture des adultes
IV.1.1.1.1 – Piège lumineux
IV.1.1.1.2 – Double moustiquaire
IV.1.1.1.3 – Capture des moustiques au repos pendant le jour
IV.1.1.1.3.1 – Capture avec le Puits de Muirhead Thomson (PMT)
IV.1.1.1.3.2 – Capture avec le Back pack
IV.1.1.2 – Collecte des larves
IV.1.1.3 – Périodes de capture et effort de piégeage
IV.1.2 – Identification des moustiques
IV.1.3 – Conservation des moustiques
IV.2 – ETUDES VIROLOGIQUES
IV.2.1 – Principe de la RT-PCR
IV.2.2 – Broyage
IV.2.2.1 – Solutions de broyage
IV.2.2.2 – Déroulement du broyage
IV.2.3 – Extraction d’ARN viral chez les moustiques
IV.2.3.1 – Préparation des solutions d’extraction
IV.2.3.2 – Déroulement de l’extraction
IV.2.3.2.1 – Phase de lyse
IV.2.3.2.2 – Phase de fixation
IV.2.3.2.3 – Phase de lavage
IV.2.3.2.4 – Phase d’élution
IV.2.4 – Amplification par RT-PCR
IV.2.4.1 – Préparation de mix réactionnels
IV.2.4.2 – Condition de la qRT- PCR
V.3 – ANALYSES DES DONNEES
V.3.1 – Etudes de l’indice de similarité de Jaccard (Jaccard, 1901)
V.3.2 – Etudes statistiques
VI – RESULTATS
VI.1 – RESULTATS ENTOMOLOGIQUES
VI.1.1 – Richesse spécifique et abondance des moustiques par site
VI.1.2 – Indice de similarité de Jaccard (J) entre les deux zones
VI.1.3 – Abondance de moustiques par espèce selon les saisons
VI.1.4 – Nombre de moustiques adultes par type de piège
VI.1.5 – Préférence trophique des moustiques
VI.1.6 – Densité des espèces abondantes dans les DM en fonction des animaux appâts
VI.2 – DETECTION VIRALE
VII – DISCUSSION
VII.1 – ABONDANCE DES MOUSTIQUES
– Selon les zones d’études
– Selon les saisons
VII.2 – RELATION ENTRE LES HOTES VERTEBRES ET LES MOUSTIQUES
– Attractivité des hôtes vertébrés
– Rapport entre la densité des vecteurs et le taux de séroprévalence
VII.3 – AUTRES MODES D’INFECTION DES MOUSTIQUES
IX – CONCLUSION
X – REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
XI – WEBOGRAPHIE 4