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Sélectivité de substrat.
Même si les lipases acceptent une large gamme de substrats, leur intérêt réside essentiellement dans leur sélectivité. Ainsi, on distingue différents types de sélectivité des lipases vis-à-vis de leurs substrats :
– La sélectivité vis-à-vis des acides gras, en particulier la longueur de la chaine carbonée et la présence ainsi que la position de substitutions ou d’insaturations, appelée typosélectivité. Les lipases catalysent préférentiellement l’hydrolyse d’esters à longues chaînes carbonées (C > 10, tels que l’acide oléique C18 :1) alors que les estérases ont une activité plus importante sur les esters à chaînes courtes (C < 10, tels que la tributyrine C4). La présence d’insaturations sur la chaîne carbonée ainsi que leur position va influencer les conformations que le substrat pourra adopter et donc la forme présentée à l’enzyme. Cette sélectivité pour la longueur des groupements acyle ainsi que leur forme dépend fortement de la topologie et de la plasticité du site actif de la lipase. La typosélectivité inclut également la préférence pour les mono-, di- ou triglycérides.
– La sélectivité vis-à-vis de la position hydrolysée préférentiellement dans les triacylglycérols ou encore appelée régiosélectivité. En effet, les lipases peuvent présenter une spécificité différente en fonction de la position de la liaison ester sur le squelette du glycérol. On distingue les positions sn1 et sn3 correspondant à des fonctions alcool primaire de la position sn2 correspondant à un alcool secondaire. Si la plupart des lipases microbiennes ont une spécificité sn1 – sn3, seules quelques-unes ont une spécificité sn2 telle que la lipase de Staphylococcus aureus (Horchani et al. 2010). Ici encore, la taille et l’architecture du site actif accueillant le substrat jouent un rôle déterminant dans la régiosélectivité. La structure de la lipase de Burkholderia cepacia a été résolue par cristallographie en présence d’un analogue de triglycéride permettant ainsi d’identifier trois poches pouvant accommoder les trois acides gras en position sn1, sn2 et sn3 (Figure 3) (PDB ID : 5LIP) (Lang et al. 1998, Jaeger et al. 1999).
– Enfin, la sélectivité vis-à-vis d’un couple d’énantiomères, appelée énantiosélectivité. Les énantiomères sont des isomères images l’un de l’autre dans un miroir mais non superposables. Cette propriété particulière appelée chiralité est souvent due à la présence d’un carbone asymétrique dans la molécule, c’est-à-dire un carbone tétraédrique ayant quatre substituants différents. Si les énantiomères présentent des propriétés physico-chimiques proches, voire identiques, telles que la solubilité, le point de fusion ou le point d’ébullition, il n’en est pas de même pour les propriétés biologiques. Ainsi, si un
énantiomère peut présenter une activité biologique recherchée, le second énantiomère peut être dépourvu de cette activité biologique, voire même avoir d’autres activités biologiques complètement différentes. Ce phénomène est à la base de nombreux effets indésirables des molécules thérapeutiques (Soykova Pachnerova 1963). Par conséquent, la résolution de mélange racémique présente un grand intérêt pour l’industrie pharmaceutique. Toutefois, l’explication de la spécificité d’une lipase pour un énantiomère reste difficile à mettre en évidence et plusieurs approches complémentaires telles que la cristallographie (Colton et al. 2011), le docking moléculaire (Berglund et al. 1999), la dynamique moléculaire (Guieysse et al. 2003), la modélisation d’intermédiaires réactionnels (Norin et al. 1994) ou l’étude de la géométrie du site actif et des trajectoires du substrat (Cortes et al. 2005) sont souvent nécessaires pour élucider les facteurs moléculaires jouant un rôle clé.
Mécanisme catalytique.
Le mécanisme catalytique des lipases fait intervenir une triade catalytique, constituée de trois acides aminés, un aspartate, une histidine et une sérine ainsi qu’un trou oxyanion constitué par les groupes amides NH de la chaine principale de deux résidus (Figure 4) (Cygler et al. 1994). Le mécanisme catalytique peut être divisé en deux étapes successives. La première étape d’acylation débute par un transfert de proton entre les trois résidus de la triade catalytique de la sérine vers l’aspartate par l’intermédiaire de l’histidine. L’oxygène activé de la chaine latérale de la sérine va alors attaquer le groupe carbonyle de l’ester pour former un intermédiaire tétraédrique appelé oxyanion. Cet intermédiaire est stabilisé par un réseau de liaisons hydrogènes incluant les résidus du trou oxyanion qui équilibrent les charges négatives de l’oxygène de l’intermédiaire tétraédrique. Un réarrangement électronique au niveau de l’intermédiaire réactionnel va libérer le groupement alcoolique de l’ester tandis que le carbone du groupement carboxylique va rester lié de façon covalente à l’oxygène de la sérine formant ainsi l’acyl-enzyme.
La seconde étape de déacylation débute par une attaque nucléophile sur le groupement carbonyle pour former un second intermédiaire réactionnel stabilisé par un réseau de liaisons hydrogènes de la manière identique à la première étape. Le réarrangement électronique de l’intermédiaire réactionnel permet la régénération de la fonction hydroxyle de la sérine catalytique et la libération de la partie acide de l’ester. En fonction de la nature du groupement effectuant l’attaque nucléophile lors de la seconde étape, la réaction peut être une hydrolyse s’il s’agit d’une molécule d’eau ou d’une alcoolyse dans le cas d’un alcool.
Dans des conditions thermodynamiques favorables tel qu’un milieu présentant une faible activité de l’eau, le mécanisme inverse peut être utilisé pour synthétiser un ester à partir d’un alcool et d’un acide en libérant une molécule d’eau. Ce mécanisme catalytique ne permet toutefois pas de rendre compte de toutes les réactions catalysées par les lipases telles que typiquement les réactions d’acidolyse.
Structure générale
De nombreuses lipases ont été caractérisées structuralement principalement par cristallographie. En comparant ces différentes structures cristallisées avec ou sans ligand, plusieurs éléments structuraux communs ont pu être mis en évidence.
Le repliement/
Les éléments de structures secondaires des lipases s’agencent pour adopter un motif de structure tertiaire appelé le repliement/. Ce motif n’est pas propre aux lipases et est partagé par de nombreuses autres hydrolases telles que des sérine-protéases, des cystéine-protéases ou les subtilisines (Ollis et al. 1992). Ce motif se compose d’un feuillet central mixte, formé par 7 brins parallèles et 1 brin antiparallèle, et de 6 hélices positionnées de part et d’autre du feuillet central connectant les brins1 à8 (Figure 5) (Jaeger et al. 1999).
De nombreuses variations de ce repliement/ sont retrouvées parmi les structures des différentes familles de lipases, principalement concernant le nombre d’hélices et de brins, la longueur des boucles ou encore l‘architecture du site actif liant le substrat (Ollis et al. 1992, Schrag et al. 1997a, Pleiss et al. 1998).
La triade catalytique.
Les acides aminés de la triade catalytique catalysent la réaction et constituent par conséquent un élément très conservé dans les structures des lipases. Cette triade est constituée d’une sérine, un acide aspartique ou glutamique et une histidine (Brady et al. 1990) comme dans les sérine-protéase avec toutefois un ordre différent dans la séquence primaire qui reflète la différence de repliement avec les sérine-protéases du clan PA de la classification MEROPS (Rawlings et al. 2014). Les résidus de la triade catalytique sont placés à proximité immédiate dans l’espace par le repliement/. La sérine et l’aspartate / glutamate sont localisés en fin des brins5 et7, respectivement, alors que l’histidine est localisée dans la boucle suivant le brin8. La sérine catalytique fait partie d’une séquence consensus G – X – S – X – G située dans un «-turn » appelé coude nucléophile (Ollis et al. 1992). Cette séquence est remplacée par la séquence G – D – S – L dans une sous-famille de lipases identifiée en 2004 (Akoh et al. 2004).
L’acide glutamique va jouer le rôle de résidu acide et l’histidine, le rôle de résidu basique alors que la sérine sera le résidu nucléophile. Ainsi l’aspartate va former une liaison hydrogène avec le groupe imidazole de l’histidine permettant à celle-ci d’adopter une orientation favorable en direction de l’oxygène de la sérine (Figure 6). De plus, l’interaction avec l’aspartate va modifier le pKa du groupement imidazole de l’histidine. Durant l’étape de catalyse, le groupement imidazole de l’histidine rend l’oxygène de la sérine plus nucléophile et permet l’attaque du carbonyle du substrat. La conservation de l’aspartate / glutamate souligne l’importance de l’interaction avec l’histidine pour que cette dernière puisse jouer son rôle d’accepteur de proton (Dodson et al. 1998).
Le trou oxyanion
L’intermédiaire tétraédrique formé au cours des étapes d’acylation et de déacylation intervenant dans la catalyse se retrouve stabilisé par les résidus du trou oxyanion. La charge négative portée par l’oxygène de l’intermédiaire réactionnel est plus particulièrement stabilisée par deux liaisons hydrogènes impliquant des groupements amides du squelette peptidique.
Le premier résidu du trou oxyanion est localisé dans la boucle suivant le brin3. Deux types de trous oxyanion ont été identifiés chez les lipases en fonction de la topologie de ces résidus. Dans le premier type de trou oxyanion, appelé type GX, la stabilisation du résidu du trou oxyanion se fait par une interaction entre sa chaine latérale et un résidu d’amarrage. Par contre, dans le deuxième type, appelé type GGGX, la stabilisation du résidu du trou oxyanion se fait par l’interaction entre la chaine latérale du résidu X et la chaine latérale d’une alanine (Figure 7) (Pleiss et al. 2000). Les lipases de type fongiques telles que celle de Yarrowia lipolytica ont un trou oxyanion de type GX avec une sérine ou une thréonine pour le résidu X. Le type de trou oxyanion semble être corrélé avec la spécificité pour le substrat. Ainsi les lipases avec un trou oxyanion de type GX hydrolysent préférentiellement les substrats avec des longueurs de chaines carbonées moyennes à longues alors que le trou oxyanion de type GGGX est retrouvé dans des lipases ayant une spécificité pour des substrats avec des longueurs de chaines carbonées courtes ou des estérases. Un troisième type de trou oxyanion, dénommé type Y, a été identifié mais ce type regroupe essentiellement des peptidases et des esterases (Widmann et al. 2010). Dans ce type Y, le trou oxyanion n’est pas formé par un groupement amide du squelette peptidique mais par le groupement hydroxyle de la chaine latérale d’une tyrosine (Fischer et al. 2006).
Le second résidu du trou oxyanion suit directement la sérine catalytique dans la séquence consensus G – X – S – X – G et est par conséquent localisé dans le coude nucléophile, après le brin5.
Le trou oxyanion peut être préformé dans la conformation inactive dite « fermée » de la lipase comme dans le cas de la lipase de Candida rugosa (Grochulski et al. 1994b), ou ne se former que lorsque la lipase adopte une conformation active dite « ouverte » suite à un changement conformationnel d’un volet amphiphile présent dans le site actif comme dans le cas de la lipase de Burkholderia cepacia (Schrag et al. 1997b).
Le volet amphiphile ou « lid »
La détermination des premières structures de lipases par cristallographie, a révélé la présence d’un volet amphiphile fréquemment rencontré chez les lipases et constitué d’une ou plusieurs hélices présentant une longueur et une complexité variables selon l’enzyme considérée. La résolution de structure de lipases cristallisées en présence d’inhibiteurs mimant le substrat dans le site actif a permis de mettre en évidence plusieurs conformations intermédiaires de ce volet, aussi appelé « lid » (Figure 8) (Brzozowski et al. 1991, Derewenda et al. 1992b, Grochulski et al. 1993, Grochulski et al. 1994a). En conformation qualifiée de « ouverte », la surface hydrophobe exposée est augmentée et le site catalytique devient accessible au substrat (Brady et al. 1990, Winkler et al. 1990, Derewenda et al. 1992a).
Le passage d’une conformation fermée à une conformation ouverte a fourni une possible explication mécanistique au phénomène d’activation interfaciale mentionné précédemment. Ainsi, en l’absence d’interface hydrophobe, la conformation fermée est prédominante expliquant la faible activité catalytique observée. Lorsque la concentration en substrat est augmentée, et passe au-dessus de la concentration micellaire critique, la formation d’une interface hydrophobe par le substrat insoluble permet une transition de la lipase vers une conformation ouverte ayant une activité catalytique accrue.
Néanmoins ce mécanisme reste mal compris. Ainsi la découverte de lipases présentant un volet amphiphile mais ne présentant pas ce phénomène d’activation interfaciale telle que la lipase de Pseudomonas aeruginosa (Jaeger et al. 1993) ou encore d’enzymes lipolytiques autres que les lipases ne possédant pas de volet amphiphile mais présentant un phénomène d’activation interfaciale telle que la phospholipase A2 pancréatique, (Pieterson et al. 1974), suggère un lien complexe entre l’activité et les états conformationnels du lid.
Par ailleurs, certaines lipases ont pu être cristallisées en l’absence d’inhibiteur suicide sous forme ouverte, telle que la lipase de Burkholderia cepacia (PDB ID : 2LIP, 3LIP) (Schrag et al. 1997b), ou partiellement ouverte telle que la lipase de Rhizopus delemar (PDB ID : 1TIC) (Derewenda et al. 1994) et celle de Thermomyces lanuginosa (PDB ID : 1DT3, 1DT5, 1DTE) (Brzozowski et al. 2000). La stabilisation de structures ouvertes ou partiellement ouverte du lid en l’absence de ligand suggère donc une dynamique plus complexe et il est probable que la nature des acides aminés constituant le lid ainsi que sa longueur jouent un rôle clef dans sa mobilité conformationnelle et influent donc grandement sur l’activité et la spécificité vis-à-vis du substrat (Brocca et al. 2003, Skjot et al. 2009).
Plusieurs techniques ont été utilisées pour explorer la dynamique et les changements conformationnels des lipases. On peut ainsi citer la fluorescence (Luthi-Peng et al. 1992, Yapoudjian et al. 2002), la diffraction des neutrons (Hermoso et al. 1997), la diffusion des neutrons aux petits angles (Pignol et al. 2000), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (Noinville et al. 2002) ou la résonance paramagnétique électronique (RPE) (Belle et al. 2007). Cette dernière technique a permis d’obtenir des informations particulièrement intéressantes sur la dynamique du lid de la lipase pancréatique humaine (HPL). L’introduction d’une cystéine par mutation d’un acide aminé du lid (D249C) a permis de fixer une sonde paramagnétique sur le lid de la HPL. De façon intéressante, le passage d’une conformation fermée à une conformation ouverte s’est accompagné d’une restriction de la mobilité de la sonde. Cela a permis de discriminer entre les états ouvert et fermé et d’étudier l’influence de la présence de sels biliaire, le sodium taurodeoxycholate (NaTDC), et de la colipase sur l’équilibre conformationnel du lid de la HPL entre les états fermé et ouvert. La présence de NaTDC au-delà de 1 mM déplace l’équilibre en faveur de la conformation ouverte, cet effet étant accentué par la présence de la colipase. Toutefois, la colipase seule ne modifie pas l’équilibre conformationnel. La colipase aurait donc un effet stabilisateur sur l’ouverture du lid par le NaTDC. De plus, une dilution de la concentration en NaTDC a entrainé un retour de l’équilibre en faveur de la conformation fermée malgré la présence de la colipase, retour qui a été inhibé par l’ajout d’un inhibiteur suicide se liant à la sérine catalytique et immobilisant les résidus du trou oxyanion. Ainsi, cette étude a démontré le rôle déterminant joué par les sels biliaires dans l’ouverture du lid de la HPL.
La RPE a également permis de mesurer les distances entre la cystéine 249, située dans le lid du variant D249C, et la cystéine C181, située dans une boucle en face du lid, pour les conformations fermée et ouverte en solution par « Double Electron – Electron Resonance » (DEER) (Ranaldi et al. 2010). Ainsi à l’aide de deux sondes paramagnétiques, des distances de 19 Å et 42 Å ont été estimées pour les conformations fermée et ouverte, respectivement. Ces distances mesurées en solution sont identiques à celles retrouvées dans les structures cristallographiques de HPL en conformations fermée (PDB ID : 1N8S) et ouverte (PDB ID : 1lPB), supportant l’hypothèse que ces conformations déterminées par cristallographie existent en solution.
En l’absence de techniques biophysiques permettant d’appréhender les échelles de temps auxquelles se produisent les changements conformationnels des domaines protéiques, la dynamique moléculaire est une bonne alternative puisqu’elle permet de simuler les réarrangements conformationnels se produisant au cours du temps et d’accéder à une description atomistique. Un exemple en est donné pour la lipase de Burkholderia cepacia (BCL). Seule la structure cristallographique ouverte de cette lipase est disponible, que ce soit avec ou sans inhibiteur / substrat (Kim et al. 1997, Schrag et al. 1997b, Lang et al. 1998, Luic et al. 2001, Mezzetti et al. 2005, Luic et al. 2008). Le lid de BCL est constitué des résidus 118 – 159 et est formé par les hélices4 et5 reliées par une boucle. A partir de la forme ouverte, une simulation de dynamique moléculaire de 20 ns en solvant aqueux a permis de passer à une forme fermée alors que la même simulation en solvant apolaire, l’octane, ou en présence d’une interface hydrophobe, eau / octane, n’a pas permis d’atteindre cette conformation fermée (Barbe et al. 2009). Une seconde simulation à partir de la conformation fermée placée en solvant apolaire, l’octane, a permis de repasser à une conformation ouverte du lid de BCL. En plus de souligner le rôle crucial de l’environnement sur la dynamique du lid de BCL, cette simulation a également mis à jour les détails du mécanisme de fermeture et d’ouverture du lid. Ainsi des simulations de dynamique moléculaire restreinte ont montré l’importance des résidus 214 – 261. Ces résidus forment
notamment l’hélice9 qui fait face au lid. Alors que des restreintes des mouvements du squelette peptidique et des chaines latérales de ces résidus bloquent le lid dans une conformation semi-fermée, la mobilité des chaines latérales seules suffit pour passer à une conformation pleinement fermée. Le même phénomène est observé lors de l’ouverture du lid lors de simulations de dynamique moléculaire restreinte à partir de la forme fermée en solvant apolaire. L’importance de la nature des résidus constituant le lid a aussi été mise en évidence en remplaçant un acide aminé apolaire, la valine V138, par un résidu apolaire de faible taille, une alanine, ou un résidu polaire, une sérine. Ces changements ont conduit à une impossibilité du lid à repasser en conformation fermée en solvant aqueux. Un phénomène analogue a été observé pour la mutation de la phénylalanine F142 en sérine. Cette mutation F142S empêche la fermeture du lid en le stabilisant dans une conformation intermédiaire. Cette étude de BCL par dynamique moléculaire illustre la complexité de la dynamique du lid en montrant l’implication du solvant, des interactions inter-domaines et de la composition du lid dans cette dynamique. Une étude semblable par dynamique moléculaire du lid de BCL a permis de retrouver le rôle crucial joué par l’environnement sur la conformation du lid de BCL (Trodler et al. 2009).
Topologie du site actif
Le site actif se situe au sommet du feuillet central. La topologie du site de fixation de la partie acyle du substrat varie entre les lipases et détermine la spécificité vis-à-vis de la longueur de chaîne du substrat, du nombre d’insaturations ou de leur position. Il est possible de classifier les lipases en trois catégories en fonction de la topologie du site de liaison au substrat (Figure 9) (Pleiss et al. 1998).
– site en forme de crevasse située près de la surface avec la sérine catalytique située au fond de la crevasse (exemple de la lipase de Rhizomucor miehei)
– site en forme d’entonnoir avec la sérine catalytique située au fond de l’entonnoir (exemples des lipases de Candida antarctica (lipase B) et Burkholderia cepacia)
– site en forme de tunnel avec la sérine catalytique située près de l’ouverture du tunnel (exemple de la lipase de Candida rugosa)
Notre enzyme modèle : Lip2 de Yarrowia lipolytica.
Découverte de Lip2
La lipase lip2 de Yarrowia lipolytica a été découverte en 2000 (Pignede et al. 2000a, Pignede et al. 2000b). Lip2 est une lipase extracellulaire sécrétée et elle est responsable de la majorité de l’activité lipolytique de la levure Yarrowia lipolytica. La forme mature de Lip2 est une glycoprotéine de 38 kDa et de 301 acides aminés et est encodée par le gène LIP2 (Pignede et al. 2000a). Ainsi, ce gène encode un polypeptide de 334 acides aminés dont les 33 premiers constituent un signal peptide appelé le PrePro permettant la sécrétion de l’enzyme dans le milieu extracellulaire. Ce signal peptide est composé d’une courte séquence « Pre » de 13 acides aminés suivis par quatre dipeptides X-Ala ou X-Pro et d’une séquence « Pro » de 10 acides aminés se terminant par un motif de clivage Lysine – Arginine. Ce motif est le substrat d’une endoprotéase KEX2 encodée par le gène XPR6 (Enderlin et al. 1994).
Quatre différents isoformes de Lip2 ayant des poids moléculaires entre 36 et 38 kDa ont été découverts (Aloulou et al. 2007b). Deux glycosylation majeures, ont été identifiées pour l’isoforme principal de Lip2, Man8GlcNAc2 et Man9GlcNAc2 en position N134 et N113, constituées de-D-mannose (Man) et de N-acétyl--D-glucosamine (GlcNAc) (Jolivet et al. 2007). Toutefois ces glycosylations ne sont pas nécessaires à la sécrétion, au repliement ou à l’activité bien qu’il ne soit pas exclu qu’elles puissent moduler les phénomènes d’activation interfaciale ou d’adsorption de l’enzyme (Aloulou et al. 2007b, Jolivet et al. 2007, Yu et al. 2007, Aloulou et al. 2013).
Structure de Lip2
La structure de lip2 a été résolue en conformation fermée en 2010 (PDB ID : 3O0D) par cristallographie à une résolution de 1.7 Å (Bordes et al. 2010, Aloulou et al. 2013). Lip2 adopte le repliement en/ avec 5 hélices distribuées de part et d’autre d’un feuillet central constitué de 9 brins (Figure 10).
Par alignement de séquences homologues, les résidus D230 – H289 – S162 et L163 – T88 ont été identifiés comme constituant la triade catalytique et le trou oxyanion, respectivement. Toutefois, lors de la superposition avec des structures de lipases homologues résolues en conformation fermée, si les résidus D230 – H289 – S162 et L163 se superposent correctement avec les acides aminés correspondant dans les autres structures, la position de T88 diffère considérablement de S82 pour Rhizomucor miehei,
S83 pour Thermomyces lanuginosa et T83 pour Rhizopus niveus (Figure 11A) (PDB ID : 3TGL, 1DT3 et 1LGY, respectivement). De la même manière, le lid de lip2 a été identifié comme étant formé par les résidus T88 – L105. En comparaison des lipases homologues, le lid de lip2 apparait plus long de 3 résidus, I98 – R99 – I100, ajoutant ainsi un tour supplémentaire en C-terminal de l’hélice (Figure 11B). Egalement, l’allongement de deux résidus du brin3 chez lip2 perturbe fortement la conformation de la boucle 87 – 90 qui inclue le second résidu potentiel du trou oxyanion, T88.
Lip2 possède également neuf cystéines qui forment quatre ponts disulfures (Figure 12). Le pont disulfure entre les cystéines C30 – C299 lie ensemble les extrémités N- et C-terminales de la protéine. Les autres ponts disulfures, C43 – C47, C120 – C123 et C265 – C273 sont situés dans des boucles et jouent vraisemblablement un rôle dans leur flexibilité. Enfin, la cystéine C244 est libre et il a été montré qu’elle était impliquée dans les mécanismes de dénaturation thermique de la lipase en favorisant les phénomènes d’agrégation (Bordes et al. 2011).
Propriétés enzymatiques de Lip2
Les propriétés biochimiques de Lip2 ont été caractérisées par différentes études (Aloulou et al. 2007a, Aloulou et al. 2007b, Yu et al. 2007). Ainsi Lip2 est capable d’hydrolyser des triglycérides à chaine carbonée courte (tributyrine), moyenne (trioctanoylglycerol) ou longue (huile d’olive en émulsion avec de la gomme arabique). L’activité spécifique maximale a été mesurée pour les triglycérides à chaine longue. Par ailleurs, pour la tributyrine et le trioctanoylglycerol, l’activité n’est détectable qu’en présence de sodium taurodeoxycholate (NaTDC). Cette observation suggère que Lip2 est engagée dans une interaction complexe avec les interfaces hydrophobes et requiert la présence d’agents tensioactifs tels que le NaTDC ou la gomme arabique pour être active sur les triglycérides. De plus, contrairement à de nombreuses lipases, Lip2 n’est pas inhibée par les sels biliaires (Aloulou et al. 2007a). Enfin, Lip2 présente une régiosélectivité de type sn1,3 lors de l’hydrolyse des triglycérides comme en témoigne l’accumulation de 2-monoglycérides au cours de la réaction.
Le pH optimal de Lip2 a été trouvé à 6.0 et la lipase est stable après incubation à un pH entre 4.0 et 7.0. Par contre, une incubation à des pH inférieurs à 3.0 ou supérieurs à 8.0 entraine une diminution importante et irréversible de l’activité (Aloulou et al. 2007b). De même, une température optimale de 40 °C a été mesurée avec une inactivation rapide pour des températures au-delà de 50 °C (Yu et al. 2007). Un variant thermostable avec une demi-vie accrue à 60 °C a été obtenu en remplaçant la cystéine 244 par une alanine (Bordes et al. 2011). La présence de solvant a également un effet sur l’activité de lip2, ainsi 10% d’acétonitrile ou 20% d’éthanol, d’isopropanol ou d’acétone entrainent une inactivation de l’enzyme. Une concentration de 10% de méthanol, éthanol, isopropanol, acétone ou DMSO est sans effet sur l’activité. La présence d’ions divalents a aussi un effet modulateur sur l’activité catalytique de Lip2 et si les ions Ca2+ et Mg2+ l’augmente, les ions Zn2+, Ni2+ ou Cu2+ la diminue (Yu et al. 2007).
Intérêt Biotechnologique.
Les propriétés de la lipase lip2 de Yarrowia lipolytica en font une enzyme avec un fort potentiel d’applications industrielles (Fickers et al. 2011).
En effet, lip2 a montré un intérêt certain dans la résolution de mélanges racémiques. Les acide 2-halogéno-carboxyliques sont d’importants intermédiaires dans la synthèse de molécules thérapeutiques (analgésiques, prostaglandines, prostacyclines, pénicillines semi-synthétique). Lip2 a montré une énantiosélectivité de 28 pour l’énantiomère S lors de la résolution d’un mélange racémique de 2-bromo-p-tolyl-acétique-éthyl-ester par transesterification (Guieysse et al. 2004). De même, lip2 a montré également son efficacité pour la résolution de 2-bromo-o-tolylacétique-éthyl-ester, un précurseur d’analgésiques et d’antagonistes au récepteur de l’angiotensine 2, avec une énantiosélectivité de 27. Par une approche semi-rationnelle, il a été possible d’améliorer l’énantiosélectivité de lip2 vis-à-vis des esters 2-bromo-arylacétique (Bordes et al. 2009). Sur la base d’un modèle tridimensionnel de lip2 généré par modélisation comparative, 5 positions de résidus du site de liaison au substrat ont été sélectionnés. L’importance de ces positions dans l’énantiosélectivité a été étudiée par mutagénèse dirigée des acides aminés sélectionnés. Les positions V232 et D97 se sont révélées particulièrement importantes et ont été étudiées plus en détail. Sur ces deux positions, les variants substitués par les 19 autres acides aminés possibles ont été générés. Le variant V232S s’est avéré avoir une énantiosélectivité supérieure à 200 pour la transformation de l’énantiomère S du 2-bromo-phényl-acétique-octyl-ester et du 2-bromo-o-tolyl-acétique-octyl-ester lors de réactions d’hydrolyse. De plus, cette amélioration de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de la vitesse de réaction vis-à-vis de l’énantiomère S pour les deux substrats. La substitution de la position 232 par un acide aminé ayant une chaine latérale volumineuse, tel qu’une leucine, isoleucine, phénylalanine ou une tyrosine, entraine un changement de l’énantiosélectivité en faveur de l’énantiomère R par diminution de l’activité catalytique sur l’énantiomère S. Le même phénomène est observé à la position 97 avec le remplacement de l’aspartate par une alanine. Enfin la combinaison de ces deux mutations dans le double variant D97A-V232F a permis non seulement de changer l’énantiosélectivité pour l’énantiomère R mais aussi d’augmenter l’activité vis-à-vis de cet énantiomère (Cambon et al. 2010). Ce changement d’énantiosélectivité est le fruit d’une diminution par un facteur 1000 de l’activité catalytique pour l’énantiomère S avec une augmentation par un facteur 20 de l’activité pour l’énantiomère R. Il est ainsi remarquable que la mutation de seulement deux positions a permis de changer l’énantiosélectivité de Lip2. De plus, le changement de l’énantiosélectivité et de l’activité catalytique du double variant n’est pas seulement une simple cumulation des propriétés de chaque simple variant, puisqu’il a été constaté que ces deux mutations avaient un effet synergique sur les propriétés énantiosélectives de Lip2.
Lip2 s’est également révélée être une enzyme efficace pour la purification d’acide gras polyinsaturés (PUFA) de type oméga-3 (Casas-Godoy et al. 2014). Ainsi l’acide cis-4,7,10,13,16,19-docosahexanoïque (DHA) et l’acide cis-5,8,11,14,17-eicosapentanoïque (EPA) ont pu être purifiés par hydrolyse d’un mélange d’esters d’éthyle extrait d’huile de poisson. La purification enzymatique des acides gras polyinsaturés se fait par résolution cinétique. Les acides gras riches en insaturations sont souvent plus lentement catalysés que les acides gras saturés ou mono-insaturés. En effet, la présence de plusieurs insaturations augmente l’encombrement stérique de la chaine carbonée en limitant sa mobilité au niveau du site actif. La comparaison des vitesses de réaction entre les différents esters avec le nombre et la position des insaturations a confirmé que l’activité de lip2 était plus affectée par la présence de doubles liaisons sur la chaine carbonée que par la longueur de cette dernière. Cet effet est d’autant plus délétère que la première insaturation est proche du groupement carbonyle de l’ester. Ces propriétés ont permis dès lors d’atteindre une pureté de 90% en omega-3 et de 77% en DHA avec un rendement de 77% et de 94%, respectivement, dans un réacteur ouvert permettant l’évaporation de l’éthanol produit au cours de l’hydrolyse.
L’insuffisance pancréatique exocrine se traduit par un défaut de la sécrétion exocrine du pancréas constituée principalement d’enzymes participant à la digestion. Cette insuffisance se traduit par une malabsorption des nutriments et une dénutrition. Si les causes peuvent être multiples, telles que des pancréatites chroniques ou aigues, des tumeurs pancréatiques ou la mucoviscidose, le traitement reste identique et consiste en des suppléments par voie orale d’extrait pancréatique de porc contenant des protéases, des amylases et des lipases (Keller et al. 2003). Néanmoins, en raison de l’origine des enzymes utilisées, ce traitement présente un risque de transmission viral inter-espèce. Yarrowia lipolytica est une levure non-pathogénique pour l’homme et a été classifiée comme « generally recognized as safe » (GRAS) par la Food and Drug Administration (FDA, USA) (Madzak et al. 2004, Groenewald et al. 2014). Les caractéristiques de lip2, son activité sur les triglycérides à longue chaine ainsi que sa stabilité à pH acide et en présence de sels biliaires, en font un bon candidat pour le traitement de l’insuffisance pancréatique exocrine (Aloulou et al. 2007a, Aloulou et al. 2007b, Turki et al. 2010).
Etude de la dynamique de Lip2
Seule la conformation dite fermée de lip2 a pu être obtenue par cristallographie malgré toutes les tentatives pour obtenir une conformation ouverte (Bordes et al. 2010). Pour pallier au manque d’information expérimentale, des simulations réalisées par dynamique moléculaire ont été réalisées pour étudier plus en détails le mécanisme d’ouverture du volet amphiphile et accéder à une modèle structural de la conformation ouverte de lip2. Ainsi des simulations de 20 ns ont été réalisées à partir de la structure de lip2 en conformation fermée en solvant explicite, soit de l’eau, soit dans un milieu biphasique eau/octane. Alors que dans l’eau, lip2 demeure dans une conformation fermée, lorsqu’elle est placée dans le mélange eau/octane, on observe de larges changements conformationnels au niveau du volet amphiphile. Lip2 adopte alors une conformation dite « semi-ouverte », qui n’évolue pas vers une conformation complètement ouverte même lorsque la simulation est poursuivie pendant 60 ns. Bien qu’il ne puisse être exclu qu’une simulation plus longue soit nécessaire pour passer à une conformation ouverte, il a été suggéré que la présence d’une interface seule n’était pas suffisante pour atteindre cette conformation ouverte.
L’ajout d’un substrat lié de façon covalente à la sérine catalytique dans le site actif a permis, en poursuivant la simulation, de passer de la conformation semi-ouverte à une conformation ouverte du lid. De plus, à la fin de la simulation, l’intermédiaire tétraédrique et les résidus catalytiques (S162, H289 et D230) établissent les liaisons hydrogènes classiquement décrites. Toutefois, la thréonine T88, second résidu potentiel du trou oxyanion, se retrouve dans une conformation qui ne lui permet pas de stabiliser l’intermédiaire réactionnel alors que la chaine latérale de l’arginine R86 est réorientée vers le site catalytique. Le groupement guanidinium de l’arginine R86 devient alors susceptible de stabiliser la charge négative de l’intermédiaire tétraédrique. Toutefois, les expériences de mutagénèse dirigée réalisées sur les résidus R86 et T88 n’ont pas permis de préciser le rôle de chacun de ces acides aminés, les mutants à ces deux positions s’étant avérés inactifs (R86A, R86K, T88L, T88V et T88A) (Bordes et al. 2009).
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. La lipase lip2 de Yarrowia lipolytica.
1.1. Définition des lipases
1.2. Réactions catalysées
1.3. Sélectivité de substrat
1.4. Mécanisme catalytique.
1.5. Structure générale.
1.5.1. Le repliement /
1.5.2. La triade catalytique
1.5.3. Le trou oxyanion
1.5.4. Le volet amphiphile ou « lid »
1.5.5. Topologie du site actif
1.6. Notre enzyme modèle : Lip2 de Yarrowia lipolytica
1.6.1. Découverte de Lip2
1.6.2. Structure de Lip2
1.6.3. Propriétés enzymatiques de Lip2
1.6.4. Intérêt Biotechnologique.
1.6.5. Etude de la dynamique de Lip2
II. La protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae
2.1. Klebsiella pneumoniae
2.2. L’enveloppe bactérienne
2.2.1. Les composants de l’enveloppe bactérienne
2.2.2. Le lipopolysaccharide
2.3. Les protéines de la membrane externe
2.3.1. La structure générale
2.3.2. L’insertion et l’interaction avec les lipides
2.3.3. Les fonctions des OMP
2.4. Biogenèse des protéines de la membrane externe.
2.4.1. Le passage de la membrane interne
2.4.2. Les voies des chaperonnes
2.4.3. La machinerie BAM
2.5. La protéine « Outer membrane protein A ».
III. Dynamique des protéines
3.1. Méthodes d’analyse de la dynamique fonctionnelle des protéines
3.2. RMN et dynamique
3.2.1. Le protéasome
3.2.2. La protéine CAP et la mesure de l’entropie conformationnelle
3.2.3. Le lysozyme du phage T4, et la caractérisation d’états « invisibles »
3.2.4. La rhodopsine d’Anabaena
IV. Références
CHAPITRE 2 EXPRESSION DE LA LIPASE LIP2 DE YARROWIA LIPOLYTICA EN VUE D’UNE ETUDE PAR RMN EN SOLUTION
I. Introduction
II. Material and methods
2.1. Chemicals
2.2. Strains and culture conditions
2.3. Vector construction
2.3.1. Escherichia coli vector
2.3.2. Cell-free vector
2.3.3. Pichia pastoris vector
2.4. Protein expression
2.4.1. Expression in Escherichia coli
2.4.2. Cell-free expression
2.4.3. Expression in Pichia pastoris
2.4.4. Expression in Yarrowia lipolytica
2.5. Characterization of the expressed lipase
2.5.1. Lipase activity
2.5.2. Protein quantification
2.5.3. SDS-PAGE analysis
2.5.4. Western Blot
2.6. Purification
2.7. NMR spectroscopy
III. Results
3.1. Expression in Escherichia coli
3.2. Cell free expression
3.3. Expression in Pichia pastoris
3.4. Expression in Yarrowia lipolytica
IV. Discussion
V. Conclusion
VI. Acknowledgments
VII. Supplementary information
VIII. References
CHAPITRE 3 STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE ET DYNAMIQUE PAR RMN EN SOLUTION DU DOMAINE C-TERMINAL DE OMPA DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE
I. Introduction
II. Material and Methods
2.1. Cloning, expression and protein purification
2.2. Crystallization
2.3. Structure determination
2.4. SEC-MALLS
2.5. NMR experiments
III. Results and Discussion
3.1. Tridimensional structure of C-terminal KpOmpA.
3.2. Binding site and sequence conservation.
3.3. Putative role of conserved D325 – R326 – R327.
3.4. Dimerization interface.
3.5. Dynamics in solution
IV. Conclusion:
V. Supplementary information
5.1. Supplementary Figures
5.2. Supplementary Tables
VI. References
CHAPITRE 4 ETUDE DE LA DYNAMIQUE DU DOMAINE N-TERMINAL DE OMPA DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE PAR RMN DU SOLIDE ET PROTEOLYSE MENAGEE
I. Introduction
II. Results and Discussion
2.1. Ultrafast solid state NMR:
2.2. Proteolysis experiments:
III. Supplementary information
3.1. Construction of the KpOmpA recombinant proteins
3.2. Protein expression and purification
3.3. Proteoliposomes preparation
3.4. Proteolysis experiments
3.5. Mass spectrometry
3.6. NMR spectroscopy
3.6.1. NMR experiments for KpOmpA assignment
3.6.2. Relaxation and REDOR NMR experiments
3.7. Supplementary Figures
3.8. Supplementary Tables
IV. References
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
I. Expression de la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica pour la RMN.
II. Interaction de C-KpOmpA avec le DAP.
III. Expression de F-KpOmpA dans la membrane externe d’E. coli
IV. Références
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