IBTS-77-RP-1000
Structure et composition de la lignocellulose
Organisation de la paroi végétale
Les cellules végétales possèdent à l’extérieur de leur membrane plasmique une enveloppe appelée paroi végétale, qui est impliquée dans le maintien de la plante et dans sa résistance à la déformation. Cette paroi est formée au cours du développement de la plante par le dépôt successif de plusieurs structures distinctes : la lamelle moyenne, la paroi primaire, et la paroi secondaire, constituée de trois couches. La lamelle moyenne, constituée de pectines et d’hémicelluloses, est située à l’interface entre deux cellules adjacentes. La paroi primaire, qui se forme durant la croissance de toutes les cellules végétales, contient des micro-fibrilles de cellulose emprisonnées dans une matrice de pectines et d’hémicelluloses, accompagnées de protéines . Lorsqu’elles ont fini de croître, certaines cellules spécialisées développent une paroi secondaire, où les micro-fibrilles de celluloses sont liées à des chaînes d’hémicelluloses et à des lignines par des interactions covalentes et non-covalentes (liaisons hydrogènes et forces de van der Waals) ; les couches S1, S2 et S3 qui composent la paroi secondaire diffèrent par l’orientation de leurs fibres de cellulose (Davin et al., 2008). La dernière étape de maturation de certains végétaux est celle de la lignification, au cours de laquelle la lignine remplace peu à peu l’eau qui se trouvait dans les tissus, en commençant au niveau de la lamelle moyenne, jusqu’à la paroi primaire puis la paroi secondaire, formant ainsi une matrice hydrophobe dans laquelle sont emprisonnés les composants cellulosiques et non-cellulosiques ainsi que les protéines (Iiyama et al., 1994).
La cellulose
La cellulose est le biopolymère le plus abondant sur Terre, et le composé principal de la paroi végétale. Elle est produite non seulement par les plantes, mais aussi par certains animaux marins, les tuniciers, ainsi que par des algues, des champignons, des bactéries et des invertébrés (Lavoine et al., 2012). Il s’agit d’un homopolymère linéaire de résidus anhydro-D-glucose, reliés entre eux par des liaisons glycosidiques de type β-(1→4), ce qui le différencie de l’amidon où les résidus D-glucose sont liés en α-(1→4). Chaque monomère effectuant une rotation de 180° par rapport à ses voisins, l’unité de répétition de ce polymère est un dimère appelé cellobiose. Chaque chaîne de cellulose possède une extrémité réductrice, porteuse d’un hémiacétal sur le carbone anomérique (C1) du résidu de glucose, et une extrémité appelée non-réductrice, porteuse d’une fonction hydroxyle . Le degré de polymérisation d’une chaîne de cellulose peut aller d’environ 8000 dans la paroi primaire jusqu’à plus de 20000 dans la paroi secondaire (Brown, 2004; Habibi et al., 2010). Dans la nature, les chaînes de cellulose sont assemblées entre elles pour former un ensemble hautement ordonné : approximativement 36 chaînes de cellulose sont assemblées en fibrilles élémentaires, qui elles-mêmes se regroupent en micro-fibrilles, qui s’associent aux autres composants de la paroi pour former des fibres cellulosiques . Les fibrilles élémentaires sont composées de régions cristallines, où les chaines sont étroitement liées entre elles par des forces de van der Waals et un réseau complexe de liaisons hydrogène inter- et intramoléculaires ; ces régions hautement ordonnées sont interrompues par des régions amorphes, probablement introduites par des tensions internes dans les fibrilles qui provoquent leur distorsion (Habibi et al., 2010).
Utilisation de biomasse lignocellulosique pour la bioraffinerie
Sources de biomasse lignocellulosique
L’appellation de «biomasse lignocellulosique» est utilisée pour désigner toute matière végétale contenant principalement de la lignocellulose. Cette appellation très large recouvre donc un grand nombre de produits, qui peuvent avoir différentes origines :
résidus agricoles produits lors de la culture de différentes plantes destinées à l’alimentation; déchets forestiers de bois dur ou de bois tendre, issus de l’industrie du bois ou des pâtes et papiers; plantes énergétiques issues de cultures dédiées (herbes vivaces et taillis à courte rotation); déchets solides municipaux et industriels.
La plupart de ces matières sont considérées comme des déchets ou des sous-produits d’autres industries, et sont donc facilement disponibles, en très grandes quantités, sans accaparer de terres cultivables supplémentaires.
Certains de ces sous-produits peuvent être utilisés comme source de chaleur et d’énergie, comme fourrage ou répandus dans les champs pour les fertiliser, mais ils sont aussi parfois simplement jetés ou brûlés ; il apparaît donc avantageux d’en transformer une partie en produits à plus haute valeur ajoutée (Gupta and Verma, 2015; Talebnia et al., 2010). Seules les plantes énergétiques font l’objet d’une culture dédiée, et bien qu’elles ne soient pas utilisées dans l’alimentation ou la production de fibres, elles pourraient être en compétition pour l’usage des terres. Cependant, leur capacité à pousser rapidement sur divers types de terrains, avec des besoins en eau limités ou une bonne tolérance aux basses températures, pourraient permettre leur exploitation sur des terres non-agricoles (García et al., 2014; Ho et al., 2014).Les différentes matières premières lignocellulosiques contiennent les polymères pariétaux présentés plus haut, mais leurs compositions et structures varient considérablement selon le type de végétaux dont elles sont issues. La principale différence de composition chimique entre le bois dur et le bois tendre est liée aux hémicelluloses : les galactoglucomannanes sont majoritaires dans le bois tendre (pins, épicéa…) alors que le bois dur (bouleau, chêne, peuplier…) contient majoritairement des glucuronoxylanes. Les monocotylédones (herbes et graminées) se différencient des dicotylédones (plantes à fleurs) par une fraction hémicellulosique plus pauvre en mannanes et xyloglucanes, et plus riche en xylanes, ainsi que par une quantité de pectines largement plus faible. Dans les deux cas, la paroi secondaire est enrichie en cellulose et en lignines, mais celle des dicotylédones contient plus de cellulose que celle des monocotylédones, alors que ces dernières contiennent plus de lignines (Rytioja et al., 2014).
Concept de la bioraffinerie lignocellulosique
Les différents types de biomasse lignocellulosique précédemment cités peuvent être utilisés comme matière première et valorisés par différents procédés dans ce qu’on appelle des bioraffineries, où la cellulose, les hémicelluloses et la lignine sont transformées pour obtenir une large palette de molécules plateformes (alcools, phénols, acides organiques, hydrocarbures, produits oxydés…) destinées à remplacer celles issues du raffinage du pétrole . Ces molécules plateformes peuvent ensuite être transformées en produits de consommation dans les domaines de l’industrie, de la santé, de l’alimentation humaine et animale, des matériaux et de l’énergie (Cherubini, 2010; de Bhowmick et al., 2018). Tous les constituants de la biomasse peuvent ainsi être valorisés, à condition de réussir à les atteindre, et donc à surmonter la résistance de la structure complexe formée par la cellulose, les hémicelluloses et la lignine. Les biomasses utilisables ayant des compositions chimiques et structurales très variées, l’un des défis de cette approche consiste à adapter en fonction des matières premières les prétraitements et procédés utilisés (de Bhowmick et al., 2018; Menon and Rao, 2012). Une fois séparées, les différentes fractions peuvent être converties ou fonctionnalisées grâce à un panel varié de procédés thermochimiques et biochimiques. La plupart de ces techniques sont encore en développement, mais devraient à terme permettre l’accès à de nombreux synthons, réduisant ainsi la dépendance aux produits issus du raffinage du pétrole, tout en minimisant les rejets de déchets qui sont transformés en produits à haute valeur ajoutée (Menon and Rao, 2012).
Procédés de production de bioéthanol
Le procédé classique d’obtention d’éthanol de deuxième génération à partir de biomasse lignocellulosique se décompose en quatre étapes principales.
Le prétraitement de la biomasse est nécessaire pour casser la structure de la paroi lignocellulosique, en solubilisant ou en séparant ses différents composants. Il existe différents types de prétraitements :
des prétraitements physiques (mécaniques ou hydrothermaux), qui permettent la réduction de la taille des particules, la diminution de la cristallinité de la cellulose et la solubilisation d’une partie des hémicelluloses ;
des prétraitements chimiques qui utilisent des acides, bases ou agents oxydants pour solubiliser les hémicelluloses, retirer la lignine ou en modifier la structure, et parfois diminuer la cristallinité de la cellulose ;
des prétraitements biologiques, qui utilisent des espèces fongiques capables de dégrader la lignine ou les hémicelluloses.
Certains prétraitements combinent des méthodes physiques et chimiques, comme par exemple l’explosion à la vapeur en présence d’acide dilué ou l’explosion à froid à l’ammoniaque (Gupta and Verma, 2015; Talebnia et al., 2010).
L’hydrolyse enzymatique, ou saccharification, consiste à dépolymériser la cellulose et les hémicelluloses restantes en monomères, à l’aide d’enzymes spécifiques. Cette étape d’hydrolyse est donc précédée par celle de la production des enzymes. On peut utiliser pour cela une variété d’organismes cellulolytiques, aérobies ou anaérobies, mésophiles ou thermophiles ; il peut s’agir de bactéries (notamment des genres Clostridium, Thermomonospora, Cellulomonas, Bacteriodes ou Streptomyces), et plus souvent de champignons filamenteux (Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Myceliophthora,) (Sun and Cheng, 2002). Ce sont ces enzymes et organismes fongiques auxquels on s’intéressera plus particulièrement dans la suite de ce rapport .
La fermentation par des microorganismes permet d’obtenir de l’éthanol à partir des sucres (pentoses et hexoses) issus de l’étape d’hydrolyse. La levure Saccharomyces cerevisiae est le microorganisme le plus utilisé dans l’industrie, grâce à ses forts rendements et productivités, et sa sensibilité modérée aux inhibiteurs.
Cependant, elle n’est naturellement pas capable d’utiliser les pentoses produits lors de l’hydrolyse enzymatique. Afin d’améliorer les rendements, des souches modifiées capables de fermenter des sucres tels que le xylose ou l’arabinose ont donc été développées (Dashtban et al., 2009).
La distillation, la rectification et la déshydratation permettent enfin de purifier l’éthanol et de le rendre propre à une utilisation en tant que carburant, qui doit répondre à un certain nombre de spécifications. Ces différentes étapes peuvent être réalisées séparément, comme c’est le cas dans le procédé conventionnel noté SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) où les enzymes et les levures peuvent être utilisées dans leurs conditions optimales respectives. Il est aussi possible de réaliser simultanément les étapes d’hydrolyse et de fermentation, un procédé que l’on nomme SSCF (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation), et qui nécessite de faire un compromis sur les conditions de réaction, mais permet aux sucres formés d’être immédiatement utilisés par les levures, et donc d’éviter l’accumulation d’inhibiteurs.
Enfin, le concept de bioprocédé consolidé (Consolidated Bioprocessing ou CBP) propose d’effectuer la production de cellulases pour l’hydrolyse enzymatique et la fermentation à l’aide d’un seul microorganisme, ce qui nécessite des approches d’ingénierie métabolique ou de biologie synthétique (Hasunuma et al., 2013; Lynd et al., 2002).
Enzymes impliquées dans la dégradation des polysaccharides
Principes de la classification CAZy
Les polysaccharides pariétaux précédemment cités, mais aussi tous les autres polysaccharides, notamment l’amidon (un polymère de glucose lié en α-1,4 trouvé dans les organes de réserve de nombreuses plantes) et la chitine (un polymère de N-acétylglucosamine qui forme la carapace des insectes et crustacés et se trouve également dans la paroi fongique), ainsi que tous les glycanes et tous les sucres, sont regroupés sous le terme de carbohydrates. Les carbohydrates font partie des quatre principales classes de biomolécules, avec les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Il s’agit d’une classe de substrats extrêmement divers, étant donné le nombre de monosaccharides existants, les différentes manières dont ils peuvent s’assembler, et la variété des autres molécules auxquelles ils peuvent se lier (Lombard et al., 2014). Les organismes vivants, pour s’adapter à leur environnement, ont donc développé un panel d’enzymes actives sur ces carbohydrates (Carbohydrate-Active enZymes, ou CAZymes), qui contrôlent leur assemblage, leur modification et leur dégradation, et possèdent une très grande diversité de structures et de spécificités.
Les cellulases
La dégradation complète de la cellulose en glucose nécessite le clivage de toutes les liaisons glycosidiques β- (1→4), ce qui fait appel à trois types d’activités complémentaires, qui se répartissent chez les champignons dans 7 familles de glycosyl-hydrolases (Couturier and Berrin, 2013).
Les exo-β-(1,4)-D-glucanases ou cellobiohydrolases (CBH), appartenant aux familles GH6 et GH7, attaquent les chaînes de cellulose par leur extrémité réductrice ou non-réductrice, et libèrent du cellobiose de manière processive.
Les endo-β-(1,4)-glucanases ou endoglucanases (EG), appartenant aux familles GH5, 6, 7, 12 et 45, agissent de manière apparemment aléatoire sur la cellulose amorphe, libérant du cellobiose ou de courtes chaînes de cellulose appelées cellodextrines, créant ainsi de nouvelles extrémités que les cellobiohydrolases peuvent attaquer.
Les β-D-glucosidases (BG), qui appartiennent aux familles GH1 et GH3, agissent sur le cellobiose et les cellodextrines produits par les autres cellulases et les dégradent en monomères de glucose ; cela permet d’éviter l’accumulation de cellobiose, qui est un inhibiteur des cellobiohydrolases et des endoglucanases. Qu’elles agissent de manière endo ou exo, les cellulases sont fréquemment liées à des CBM qui leur permettent d’approcher le module catalytique de son substrat, grâce à des interactions avec les résidus hydrophobes qu’ils portent (Gilbert et al., 2013; Himmel et al., 2010).
Utilisation de sécrétomes fongiques pour l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique
Classifications et modes de vie des champignons
Le règne fongique est constitué d’organismes eucaryotes, hétérotrophes vis-à-vis du carbone, qui ne peuvent pas réaliser de photosynthèse et se nourrissent donc par absorption au travers de leur paroi cellulaire de matière organique digérée de manière extracellulaire. Parmi ceux-ci on distingue souvent d’une part les levures unicellulaires, et d’autre part les champignons filamenteux, dont l’organe végétatif est composé d’hyphes qui s’associent en filaments, formant ce qu’on appelle le mycélium. Ce règne regroupe des organismes très différents les uns des autres, et sa phylogénie est complexe. On distingue communément les «champignons inférieurs» et les «champignons supérieurs» (Silar, 2016) :
Les champignons dits inférieurs, anciennement regroupés sous les noms de «chytridiomycètes» et «zygomycètes» et aujourd’hui classés dans plusieurs embranchements (Hibbett et al., 2007), ont gardé des caractéristiques ancestrales comme la dispersion à l’aide de zoospores flagellées ou un mycélium simple, rarement cloisonné.
La lignée des Dikarya regroupe les champignons supérieurs, s’organisant en mycélium perfectionné (dont les hyphes dits « septés » ont des cloisons percées d’un pore central associé à des structures permettant le passage sélectif de nutriments et d’organites), et capables d’effectuer des fusions entre deux cellules (anastomose). Parmi eux, on distingue les Ascomycota des Basidiomycota par leurs structures formant des spores : il peut s’agir soit de sacs (ou asques) contenant les ascospores, soit de cellules spécialisées appelées basides qui bourgeonnent pour donner les basidiospores.
Les champignons, présents dans tous les écosystèmes, s’adaptent parfois à des conditions extrêmes, et jouent des rôles écologiques essentiels, notamment par leur implication dans la dégradation et le recyclage de la matière organique. Les champignons ont acquis au cours de leur évolution différents styles de vie (Rytioja et al., 2014) :
la symbiose, qui leur permet d’avoir une relation mutualiste avec des algues (pour former des lichens), des animaux (champignons du système digestif) ou encore des plantes (champignons mycorhiziens par exemple) ;
le parasitisme, lorsqu’ils se développent au détriment d’une autre espèce, de plantes ou d’animaux par exemple ; le saprophytisme, lorsqu’ils dégradent le bois mort ou les déchets organiques.
Cependant, ces modes de vie ne sont pas cloisonnés, et beaucoup de champignons peuvent cumuler plusieurs de ces stratégies nutritionnelles ou passer de l’une à l’autre.
Utilisation du sécrétome de Trichoderma reesei
Système cellulolytique de Trichoderma reesei :Trichoderma reesei a été découvert pendant la Seconde Guerre mondiale, dans les Iles Salomon, lorsqu’il a été isolé sur des tentes et uniformes en coton en train de se décomposer dans les camps américains. Un programme de recherche a été établi par l’armée américaine, visant à comprendre et contrôler cette dégradation, ainsi qu’à étudier les possibles utilisations de ce phénomène. La souche « QM6a », initialement repérée pour son impressionnante capacité à dégrader la cellulose cristalline, est toujours considérée comme une souche de référence. Les travaux effectués sur les enzymes de cette souche sont à l’origine des connaissances que nous avons aujourd’hui des différentes cellulases et de leur action synergique . La CBHI de T. reesei a par exemple été la première cellulase eucaryote à être clonée, et la première cellulase dont la structure 3D a été résolue (Divne et al., 1994; Shoemaker et al., 1983).
Afin d’améliorer les performances de la souche sauvage, des stratégies de mutagénèse aléatoire et de criblage ont été mises en place dès les années 1970. En utilisant des techniques d’irradiation ou de mutagénèse chimique , des souches hyper-productrices de cellulases avec des niveaux de production largement supérieurs à ceux de la souche sauvage ont pu être obtenues, notamment la souche Rut-C30, qui est depuis des décennies une référence pour la recherche académique, ou la souche CL847, qui fait partie des souches utilisées à l’échelle industrielle (Durand et al., 1988; Eveleigh and Montenecourt, 1979; Peterson and Nevalainen, 2012). T. reesei étant très étudié et utilisé, son génome a été séquencé en 2008, révélant un nombre étonnamment faible de gènes impliqués dans la dégradation de la biomasse végétale, étant donné son efficacité. Le nombre et la diversité des gènes de T. reesei codant pour des cellulases et des hémicellulases est en effet inférieur à beaucoup d’autres champignons cellulolytiques dont le génome est connu. Il possède seulement 2 gènes codant pour des cellobiohydrolases, 4 gènes codant pour des endoglucanases caractérisées (et 3 autres prédites), 3 gènes codant pour des LPMO de la famille AA9 (dont une seule a été caractérisée), ainsi que 2 gènes codant pour des β-glucosidases (9 autres sont prédits). En plus de ces enzymes actives sur la cellulose, le génome de T. reesei contient une quinzaine de gènes codant pour des hémicellulases caractérisées, et une trentaine d’autres prédites, avec notamment des activités xyloglucanase, endoxylanase, xylosidase, mannanase, mannosidase, arabinofuranosidase, acétyle xylane estérase, galactosidase, glucuronidase, fucosidase (Häkkinen et al., 2012; Martinez et al., 2008).
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Table des matières
INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1 De la biomasse lignocellulosique au bioéthanol
1.1 Structure et composition de la lignocellulose
1.1.1 Organisation de la paroi végétale
1.1.2 La cellulose
1.1.3 Les hémicelluloses
1.1.4 Les pectines
1.1.5 Les lignines
1.2 Utilisation de biomasse lignocellulosique pour la bioraffinerie
1.2.1 Sources de biomasse lignocellulosique 0
1.2.2 Concept de la bioraffinerie lignocellulosique
1.3 Procédés de production de bioéthanol
2 Enzymes impliquées dans la dégradation des polysaccharides
2.1 Principes de la classification CAZy
2.2 Les cellulases
2.3 Les hémicellulases
2.4 Les LPMO
2.4.1 Découverte de leur activité
2.4.2 Classification actuelle
2.4.3 Structure tridimensionnelle des LPMO
2.4.4 Mécanismes proposés
2.4.5 Partenaires redox
2.4.6 Utilisation des LPMO dans les cocktails cellulolytiques
3 Utilisation de sécrétomes fongiques pour l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique
3.1 Classifications et modes de vie des champignons
3.2 Utilisation du sécrétome de Trichoderma reesei
3.2.1 Système cellulolytique de Trichoderma reesei
3.2.2 Etudes transcriptomiques et protéomiques
3.2.3 Ingénierie génétique des souches
3.2.4 Amélioration des enzymes
3.2.5 Mise en œuvre de l’hydrolyse enzymatique
3.3 Stratégies de supplémentation
3.3.1 Limitations du sécrétome de T. reesei
3.3.2 La biodiversité fongique comme source d’inspiration
3.3.3 Supplémentation par des sécrétomes fongiques
4 Enjeux et stratégie du projet de recherche
CHAPITRE II : MATÉRIEL ET MÉTHODES
1 Préparation des sécrétomes
1.1 Souches fongiques
1.2 Milieux de culture
1.3 Culture et récolte des sécrétomes
2 Tests de saccharification en supplémentation
2.1 Substrats utilisés
2.2 Cocktail enzymatique de référence
2.3 Tests de saccharification en tubes
2.4 Tests de saccharification en microplaques
2.5 Quantification des produits et calcul des rendements
3 Analyse du contenu protéique des sécrétomes
3.1 Identification des protéines par LC-MS/MS
3.2 Analyse des données
4 Analyse bioinformatique
5 Production de protéines recombinantes
5.1 Construction et transformation des vecteurs d’expression
5.2 Production des protéines
5.2.1 Milieux de culture
5.2.2 Production en plaques Deepwell
5.2.3 Production en fioles
5.2.4 Production en bioréacteurs
5.3 Purification des protéines
5.3.1 Purification par chromatographie d’affinité
5.3.2 Purification par chromatographie d’échange d’anions
5.4 Caractérisation biochimique des protéines produites
5.4.1 Analyse ICP-MS
5.4.2 Séquençage N-terminal
5.4.3 Analyse de masse globale
5.4.4 Tests Amplex Red
6 Caractérisation de l’activité des LPMO
6.1 Substrats utilisés
6.2 Tests de dégradation de substrats
6.3 Tests de synergies sur cellulose
6.4 Analyse des produits solubles de dégradation
6.4.1 HPAEC-PAD
6.4.2 Spectrométrie de masse
6.5 Spectroscopie du site actif
6.6 Modélisation des structures 3D par homologie
CHAPITRE III : IDENTIFICATION D’UNE NOUVELLE FAMILLE DE LPMO DANS DES SÉCRÉTOMES FONGIQUES
1 Résumé
2 Background
3 Results
3.1 Exploration of fungal secretomes to improve biomass saccharification
3.2 Comparative proteomic analysis of fungal secretomes
3.3 Bioinformatic analysis of a new LPMO family
3.4 Heterologous expression and purification
3.5 Substrate specificity and regioselectivity of cleavage
3.6 Synergy assays
4 Discussion
5 Conclusions
CHAPITRE IV : CARACTÉRISATION DE TROIS NOUVELLES LPMO DE LA FAMILLE AA16
1 Résumé
2 Background
3 Results and discussion
3.1 Selection and production of three novel AA16 enzymes
3.2 Activity of AA16 enzymes on cellulose
3.3 Redox partners
3.4 Synergy assays
3.5 Spectroscopic analysis of the active site
3.6 Structural data
4 Conclusions
CHAPITRE V : DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSIONS
1 Discussion générale
1.1 Exploration des sécrétomes et choix des cibles enzymatiques
1.2 Production et purification des LPMO AA16
1.3 Particularités de l’activité des AA16
2 Conclusions et perspectives
ANNEXES
RÉFÉRENCES
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