Soutenance mémoire
Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste qui s’adapte à son milieu
Plusieurs noms ont été attribué à ce pathogène opportuniste comme Bacillus pyocyaneus, Bakterium aeruginosa, Pseudomonas polycolor, et Pseudomonas pyocyaneus, avant sa dénomination finale. Ces noms reflètent la forme en bâtonnet de cet organisme, mais aussi l’aspect bleu-vert caractéristique d’une culture de cette bactérie ou du pus lors d’infection.
En effet, elle produit un mélange de deux pigments, la pyocyanine de couleur bleu et la pyoverdine, une fluorescéine jaune (Botzenhart and Döring, 1993). Découverte en 1862 par Lucke qui a observé des organismes en forme de bâtonnet dans le pus bleu-vert de plaies infectées, P. aeruginosa n’a été isolée en culture qu’en 1882 par Carle Gessard à partir de plaies cutanées de deux patients (Gessard, 1984; Lyczak et al., 2000).
La bactérie possède plusieurs appendices lui permettant de se mouvoir dans différents milieux.
Tout d’abord un flagelle polaire, qui favorise la nage de la bactérie dans un environnement liquide ainsi que son essaimage (« swarming ») sur des surfaces semi-liquides (0,5 à 1% de gélose), à condition que le milieu présente des sources spécifiques d’azote et de carbone, telles que le glutamate et le glucose (Köhler et al., 2000; Rashid and Kornberg, 2000). La bactérie possède également des pili de type IV qui favorisent son adhérence et son déplacement (« twitching ») sur des surfaces solides (Dasgupta et al., 2003; Mattick, 2002). Enfin P. aeruginosa présente une motilité glissante (« sliding motility») sur des surfaces semi-solides, essentielle pour coloniser les milieux favorisant la répression flagellaire, comme par exemple les voies respiratoires humaines (Murray and Kazmierczak, 2008).
Le premier génome de P. aeruginosa à avoir été séquencé est celui de la souche PA01 en 2000, puis d’autres génomes ont été séquencés comme celui des souches PA14 et PA7 respectivement en 2006 et 2010 (Lee et al., 2006; Roy et al., 2010; Stover et al., 2000). La taille de ces génomes peut varier de 5,2 à 7 millions de paires de bases selon les souches. L’étude de Wolfgang sur le génome de 18 souches couramment retrouvées dans les infections humaines et dans l’environnement, a démontré une forte conservation du contenu génomique, notamment des gènes codant pour les facteurs de virulence (Wolfgang et al., 2003). De plus, le génome de P. aeruginosa contient une forte proportion de gènes impliqués dans la régulation, le métabolisme ainsi que les systèmes de transport et d’efflux de composés organiques (Stover et al., 2000).
Toutes ces caractéristiques génomiques reflètent l’adaptation évolutive de P. aeruginosa pour coloniser et prospérer dans une grande variété d’environnement.
La bactérie réside principalement dans les environnements humides des milieux communautaire et hospitalier, comme le sol, les bondes des éviers et les douches, ainsi que dans les systèmes d’eau artificiels (Pellett et al., 1983; Rutherford et al., 2018). Pour le milieu hospitalier, elle a également pu être isolée à partir de cathéters, d’implants, de piscines (pour la physiothérapie et l’hydrothérapie), mais aussi à partir d’humidificateurs ou de solutions pourlentilles (Abdallah et al., 2014; Blanc et al., 2007; Harris et al., 1984; Lakkis and Fleiszig, 2001; Pollack, 1984). En revanche, P. aeruginosa est très peu présente dans la flore microbienne normale de l’homme. La bactérie est très peu retrouvée sur la peau et dans les narines et son taux de colonisation, dans les selles et la cavité buccale, est faible (D’Agata, 2015; Morrison and Wenzel, 1984). Cependant, l’hospitalisation d’un patient peu considérablement augmenter son taux de colonisation, notamment si celui-ci présente une altération des barrières cutanées ou des muqueuses, à la suite d’actes chirurgicaux ou d’une déficience dans son système immunitaire.
Suivant l’environnement dans lequel se trouve P. aeruginosa, la bactérie peut se présenter sous deux modes de vie bien distincts, une forme planctonique ou une forme sessile, lorsqu’il y a formation d’un biofilm.
Mode de vie de P. aeruginosa
L’état planctonique correspond à la forme libre des bactéries, qui peuvent alors se déplacer de façon isolée les unes des autres. Dans cet état, les bactéries expriment leur flagelle et les pili de type IV pour se mouvoir. Sous cette forme, elles sont le plus souvent associées à des infections de courte durée, mais avec des symptômes sévères. Le passage de l’état planctonique à sessile s’opère quand les bactéries se fixent sur une surface pour former des microcolonies. Par la suite, les bactéries vont croître et produire des exopolysaccharides pour adopter une forme en champignon, correspondant à un biofilm mature (Figure 2). Ainsi dans cet état, la densité bactérienne est localement plus élevée que dans l’état planctonique. La formation d’un biofilm est nécessaire pour la colonisation des tissus humains au cours d’infections chroniques et pour la persistance de la bactérie dans les dispositifs médicaux implantés. Au cours de cette transition vers une forme sessile, de nombreux gènes sont régulés dans le but d’adapter le comportement de la bactérie à son nouveau mode de vie en communauté. En passant au stade biofilm, les gènes impliqués dans la formation des exopolysaccharides sont surexprimés, afin de favoriser l’adhésion des bactéries, tandis que les gènes de motilité et de virulence sont réprimés (Dunne, 2002). Une fois le biofilm arrivé à maturation et afin d’assurer la survie dans un milieu hostile, des bactéries du biofilm peuvent se détacher et retrouver un caractère planctonique. Cettedispersion permet aux bactéries de coloniser de nouveaux environnements et de réinitialiser le processus de formation du biofilm (Rollet et al., 2009; Mikkelsen et al., 2011; Joseph et al., 2016).
Les infections à P. aeruginosa
P. aeruginosa est capable d’infecter une grande variété d’hôtes, vertébrés comme nonvertébrés. La bactérie est un pathogène sévère pour les plantes, les insectes, mais aussi les amibes et nématodes, ainsi que les mammifères comme les souris et l’homme (Boman et al., 1972; D’Argenio et al., 2001; Jander et al., 2000; Pukatzki et al., 2002; Rahme et al., 1995; Tan et al., 1999). Chez l’homme, la bactérie est un pathogène opportuniste et il est donc nécessaire que son système immunitaire soit affaibli ou que les barrières du corps présentent une rupture, pour que P. aeruginosa puisse initier une infection.
Les sites d’infection à P. aeruginosa et les facteurs de risques associés
Les sites d’infection de P. aeruginosa chez l’homme sont divers, tout comme les facteurs de risque associés à ces infections. Les personnes les plus à risques sont celles atteintes de mucoviscidose, suite à l’épaissement du mucus des voies respiratoires et les patients en milieu hospitalier. Ces derniers peuvent en effet présenter des lésions graves ou un déficit du système immunitaire causé par une chimiothérapie ou le VIH par exemple, favorisant l’infection. (Franzetti et al., 1992; Lyczak et al., 2000). La pause d’un cathéter ou une intubation sont également des facteurs de risque chez les patients hospitalisés (David et al., 2005).
Le Tableau 1 résume les principales pathologies causées par P. aeruginosa en milieu hospitalier ainsi que les facteurs de risque associés. La bactérie est principalement associée aux infectionspulmonaires (13,94%) et aux infections de la peau et des tissus mous (9, 29%) (Santé Publique France, 2017)
Les infections nosocomiales
Les infections nosocomiales se définissent comme étant des infections contractées dans un établissement de soins. Ces infections doivent survenir au moins 48 h après l’admission du patient pour être considérées « nosocomiales ». C’est généralement dans les services de réanimation, de soins intensifs et les centres de brûlés, que le risque d’infection à P. aeruginosa est le plus important. Dans ces espaces, les patients sont en effet souvent immunodéprimés, intubés, ventilés et porteurs de cathéters.
Selon une étude de 2012, menée par l’Institut nationale de Veille Sanitaire (InVS), 5% des patients hospitalisés en France ont contracté une infection nosocomiale. Cela représente750 000 infections par an. Les trois bactéries majoritairement associées à ces infections sont Escherichia coli (26%), Staphylococcus aureus (16%) et P. aeruginosa (8,4%). Le taux plus faible d’infections nosocomiales causées par P. aeruginosa, peut être lié au fait que cette bactérie est très peu présente chez l’homme en tant que bactérie commensale, contrairement aux deux autres bactéries. Or, dans la majorité des cas, les infections nosocomiales sont des infections endogènes, c’est-à-dire que le patient est infecté par ses propres bactéries au cours de certains actes chirurgicaux. En outre, les infections contractées à l’hôpital par P. aeruginosa se font via l’environnement hydrique des services (lavabos, robinets, savons, humidificateurs), car il s’agit d’un environnement humide, propice au développement et à la multiplication de labactérie (Floret et al., 2009).
Le microenvironnement dans lequel se trouve la bactérie et l’état pathologique du patient, vont engendrer des modifications génotypiques chez P. aeruginosa, aboutissant à deux types d’infection : aigues ou chroniques (Hogardt and Heesemann, 2010; Ventre et al., 2006).
Les infections aigües
Ces infections sont soudaines et brèves et principalement associées à des infections de type nosocomiales. Elles se caractérisent par un mode de vie planctonique de P. aeruginosa, ainsi que par l’expression d’un grand nombre de facteurs de virulence. On observe notamment une propagation rapide de la bactérie, liée à une mobilité flagellaire accrue, ainsi qu’une forte expression des pili de type IV. Ces appendices induisent aussi une réponse inflammatoire forte, suite au contact de la bactérie avec les cellules de l’hôte. De plus, les systèmes de sécrétion de type 2 et 3 sont également activés, provoquant la libération de protéases et de toxines et donc la formation de lésions tissulaires. Cela cause des dommages au niveau des barrières épithéliales et crée des ouvertures, favorisant la dissémination de la bactérie (Gellatly and Hancock, 2013).
Cette dissémination sera d’autant plus importante si le système immunitaire de l’hôte est affaibli et donc incapable de faire face au pathogène.
Les pneumonies
Les pneumonies causées par P. aeruginosa sont généralement acquise en milieu hospitalier et rarement d’origine communautaire. Ces infections pulmonaires sont également plus fatales en milieu hospitalier, car les patients présentent préalablement un endommagement des voies respiratoires, causé par une ventilation mécanique, un traumatisme ou une infection virale antérieure. Ces facteurs augmentent aussi le risque d’une dissémination de la bactérie à travers le système sanguin. En règle générale, les pneumonies contractées à l’hôpital par P. aeruginosa surviennent chez les patients mécaniquement ventilés, qui sont en soins intensifs ou les patients neutropéniques (Fernández-Barat et al., 2017). Pour donner un exemple, parmi les patients dans les unités de soins intensifs européennes nécessitant une ventilation mécanique, P. aeruginosa était responsable de 23,1% des cas de pneumonie (Koulenti et al., 2009). Dans certaines unités de soin, les pneumonies dues à P. aeruginosa ont pu atteindre 30% voire 50% des pneumopathies, ce qui a pour effet, entre autres, de prolonger la durée de séjour en soins intensifs et d’augmenter la mortalité (Heyland et al., 1999; Maqbool et al., 2017). Concernant les cas de pneumonies d’origine communautaire, les personnes sont souvent atteintes d’une maladie pulmonaire chronique avant l’apparition de la pneumonie bactérienne. Cependant quelques cas de personnes auparavant en bonne santé et ayant contractées une pneumoniecommunautaire grave, causée P. aeruginosa, ont été décrits (Hatchette et al., 2000; Wang et al., 2019).
Déclenchement du système immunitaire par P. aeruginosa
La colonisation et le franchissement des barrières naturelles de l’hôte (peau et muqueuses) par P. aeruginosa, conduit à l’activation du système immunitaire. Ce système immunitaire met en jeu l’immunité innée, qui est un mécanisme de défense non spécifique et l’immunité acquise, dite adaptative, qui est sélective de l’agent pathogène à éliminer. L’immunité innée se déclenche très tôt, suite à la reconnaissant de motifs moléculaires associés à certaines structures du pathogène, comme le flagelle, les pili et les LPS, regroupés sous l’acronyme PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns), par des récepteurs cellulaires spécifiques, les PRR (Pattern Recognition Receptors). Ces récepteurs se situent au niveau des cellules épithéliales, des neutrophiles et des monocytes/macrophages et se composent entre-autres, des récepteurs membranaires TLR (Toll-Like Receptors) et des récepteurs cytosoliques NLR (Nod-Like Receptors). L’activation des TLR se traduit par la synthèse de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β et IL-18) au sein de cellules sentinelles comme les macrophages alvéolaires dans le poumon ou les cellules NK (DiMango et al., 1995; Wesselkamper et al., 2008; Bonfield et al., 2012). Ces cytokines sont ensuite activées et sécrétées, suite à l’activation de NLRs et l’assemblage d’un inflammasome de type NLRC4 ou NLRP3. Cette première phase inflammatoire entraine la synthèse et la sécrétion de chimiokines, comme l’IL-6 et l’IL-8, déclenchant le passage de cellules immunitaires du sang vers le tissu infecté (Figure 4). Les cellules recrutées, majoritairement composées de neutrophiles, vont éliminer les bactéries par phagocytose. Les facteurs du complément participent aussi à cette élimination en formant des pores dans la membrane bactérienne, grâce au complexe d’attaque membranaire (CAM) (Lavoie et al., 2011). Ainsi, l’infection des poumons par P. aeruginosa, déclenche une réponse inflammatoire intense chez l’hôte. Pour preuve, les patients atteints de mucoviscidose et infectés par P. aeruginosa présentent généralement une inflammation excessive, avec notamment une forte expression de cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-1β, l’IL-6 et l’IL-8 (DiMango et al., 1995; Kube et al., 2001; Bonfield et al., 2012).
L’immunité acquise se déclenche plus tardivement, parfois plusieurs jours après le premier contact avec le pathogène. Elle est activée après digestion du pathogène par les phagocytes, en particulier les cellules dendritiques. Ces cellules fixent des peptides bactériens sur les récepteurs CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité) et les présentent aux lymphocytes T et B, au niveau des ganglions lymphatiques, permettant entre-autres, la production d’anticorps spécifiques et de cellules mémoires.
Pour persister et disséminer dans l’organisme, P. aeruginosa va atténuer le système immunitaire de l’hôte à l’aide de plusieurs facteurs de virulence qui seront détaillés dans le Chapitre 2 (Allen et al., 2005; Chung et al., 2009; Diaz et al., 2008; Garrity-Ryan et al., 2000; Rocha et al., 2003; Skopelja-Gardner et al., 2019; Van Gennip et al., 2009). L’activation de l’immunité innée est nécessaire à l’élimination du pathogène, mais est à double -tranchant : la stimulation incessante de la réaction inflammatoire liée à la persistance de la bactérie est délétère pour l’organisme et cause des lésions graves.
Importance du flagelle dans la mobilité
Ce flagelle confère à P. aeruginosa une mobilité de type nage (« swimming ») ou de type « essaimage » (« swarming ») selon l’environnement où se trouve la bactérie.
La nage est une mobilité rapide dans les environnements aqueux ou expérimentaux, comportant moins de 0,4% d’agar. Dans ces conditions, la bactérie peut se déplacer à une vitesse de plusieurs dizaines de micromètres par seconde, par exemple 41 μm.s-1 pour la souche PAK (Doyle et al., 2004; Murray and Kazmierczak, 2006). Selon les stimulus, la bactérie pourra se mouvoir vers l’avant ou vers l’arrière pour se déplacer vers un environnement propice ou au contraire, s’éloigner d’un environnement peu favorable. Cette adaptation de la nage aux signaux externes, ou chimiotactisme, est médiée par des chémorécepteurs qui engendrent une cascade de signalisation, modifiant la fréquence de rotation dans le sens horaire ou anti-horaire du flagelle (Sampedro et al., 2015). Ces chémorécepteurs sont enchâssés dans la membrane cytoplasmique et captent des ligands situés dans le périplasme. Chez P. aeruginosa, il existe 26 chémorécepteurs différents, qui montrent un chimiotactisme positif envers les acides aminés, l’éthylène et le malate (Kato et al., 2008; Sampedro et al., 2015)
La mobilité de type essaimage correspond à un déplacement coordonné de bactéries sur des surfaces semi-solides, mimée en laboratoire par de l’agar mou comportant 0,5 à 0,7% d’agar.
Cette mobilité requière la présence du flagelle mais aussi des pili de type IV et la production de biosurfactant, comme les rhamnolipides, qui réduisent la friction entre la bactérie et la surface sur laquelle elle se déplace. Ce type de déplacement est induit lorsque certains acides aminés, comme le glutamate ou l’aspartate, sont la seule source d’azote du milieu. De plus, la morphologie de P. aeruginosa évolue pour favoriser cette mobilité. En effet, les bactéries sont plus allongées et surtout, certaines se voit attribuer un deuxième flagelle situé au même pôle que le premier flagelle (Köhler et al., 2000; Rashid and Kornberg, 2000).
Importance des pili de type IV dans la mobilité
Comme mentionné précédemment, les pili de type IV sont importants pour la mobilité de type « swarming » (Köhler et al., 2000). Cependant, ils ne sont pas directement impliqués dans le déplacement mais permettent plutôt de renforcer l’association des bactéries entre-elles, afin d’engendrer et de coordonner ce mouvement collectif (Anyan et al., 2014).
La mobilité des bactéries liée aux pili est principalement de type « twitching ». Il s’agit d’un mouvement de traction sur une surface solide, où les bactéries se regroupent pour former des « radeaux » et se déplacent linéairement le long de leur axe longitudinal. Ce mouvement est engendré par les mécanismes successifs de polymérisation puis dépolymérisation des pilines, permettant l’extension des pili, qui se fixent alors à la surface, puis se rétractent au niveau de leur base. Les bactéries se déplacent donc de manière saccadée, comme tractées par des grappins (Merz et al., 2000; Talà et al., 2019). Ce type de déplacement est activé à la suite de différents signaux environnementaux comme la présence de lipides, notamment les phosphatidyléthanolamines, la production d’alginate, la présence d’ADN extracellulaire ou encore la carence en fer (Whitchurch et al., 1996; Kearns et al., 2001; Patriquin et al., 2008; Gloag et al., 2013)
Enfin, les pili de type IV sont également impliqués dans deux autres modes de déplacement pour l’exploration locale, le « crawling » et le « walking ». Durant le crawling, la bactérie se déplace en rampant le long de son axe longitudinal tandis que durant le walking, la bactérie est Figure 7: Pili de type IV de P. aeruginosa. A. Pili de type IV après 15 min d’exposition sur une surface solide vu en microscopie électronique (Laventie et al., 2019). B. Schéma d’un pilus.
D’après (Burrows, 2012) et (Nguyen et al., 2015b) orientée verticalement, et « marche » de façon perpendiculaire à son axe. Selon le type de déplacement choisi, les bactéries pourront couvrir de grande distance ou explorer rapidementla zone sur laquelle elles sont attachées (Conrad et al., 2011).
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Table des matières
REMERCIEMENTS
AVANT-PROPOS
TABLE DES MATIERES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
ABBREVIATIONS
INTRODUCTION
Chapitre 1: Présentation de l’espèce Pseudomonas aeruginosa
A- Caractéristiques du genre Pseudomonas
B- Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste qui s’adapte à son milieu
C- Mode de vie de P. aeruginosa
D- Les infections à P. aeruginosa
1- Les sites d’infection à P. aeruginosa et les facteurs de risques associés
2- Les infections nosocomiales
3- Les infections aigües
i- Les pneumonies
ii- Infections des voies urinaires
iii- Bactériémie
iv- Autres infections aigües
4- Les infections chroniques
i- Infection des patients atteints de mucoviscidose
ii- Autres infections chroniques causées par P. aeruginosa
5- La résistance aux antibiotiques
E- Déclenchement du système immunitaire par P. aeruginosa
Chapitre 2 : Les facteurs de virulence de P. aeruginosa
A- Le flagelle
1- Structure du flagelle
2- Importance du flagelle dans la mobilité
3- Importance du flagelle dans l’infection
B- Les pili de type IV
1- Structure des pili de type IV
2- Importance des pili de type IV dans la mobilité
3- Importance des pili au cours de l’infection
C- Le système de sécrétion de type 2
1- Structure du SST2
2- Les principaux effecteurs du SST2 de type Xcp
i- La protéase LasB
ii- La protéase LasA
iii- L’exotoxine A ou ToxA
iv- Les phospholipases C
3- Importance du SST2 au cours de l’infection
D- Le système de sécrétion de type 3
1- Structure du SST3
2- Le contrôle de l’expression du SST3
3- Les effecteurs du SST3
i- ExoU
ii- ExoS
iii- ExoT
iv- ExoY
4- Importance du SST3 au cours de l’infection
E- Les autres systèmes de sécrétion
1- Le système de sécrétion de type 1
2- Le système de sécrétion de type 5
3- Le système de sécrétion de type 6
F- Les autres facteurs de virulence
1- Les lipopolysaccharides
2- Les chromophores
3- Les rhamnolipides
G- Coordination des facteurs de virulence de P. aeruginosa au cours d’une infection
1- Investigation et colonisation des surfaces grâce au flagelle et aux pili de type 4
2- Coopération des facteurs de virulence pour la traversée des barrières tissulaires
Chapitre 3: ExoU et ses cofacteurs eucaryotes
A- ExoU est une phospholipase A2 bactérienne
1- Les différents domaines de la toxine
2- Le complexe ExoU-SpcU avant l’injection de la toxine dans les cellules
3- Similarités entre le domaine PLP d’ExoU et celui des PLA2 eucaryotes
i- Les différentes PLA2 eucaryotes
ii- Homologies entre ExoU et les cPLA2 et iPLA2 eucaryotes
B- Interaction d’ExoU avec le PIP2 et activation du domaine catalytique
1- Présentation du PIP2
2- Le PIP2 interagit avec ExoU et permet d’activer son activité phospholipase
3- Le domaine C-terminal d’ExoU interagit avec le PIP2 et permet de localiser la toxine à la membrane plasmique
4- Changements conformationnels permettant l’activité cytotoxique d’ExoU
C- Oligomérisation de la toxine dans les cellules eucaryotes
D- Interaction d’ExoU avec l’ubiquitine et les protéines ubiquitinylées
E- Importance d’ExoU au cours de l’infection
1- Induction de la réponse inflammatoire de l’hôte par ExoU
2- Conséquences de l’intoxication des cellules hôtes par ExoU
F- Inhibiteurs d’ExoU
G- Homologues d’ExoU
RESULTATS
Chapitre 1: ExoU exploite le trafic vésiculaire dirigé par DNAJC5 pour se localiser à la membrane plasmique
A- Introduction
1- Présentation de la protéine DNAJC5
2- Rôle de DNAJC5 dans l’activité d’ExoU
B- Publication
C- Résultats complémentaires
1- Interaction entre ExoU et DNAJC5
i- Co-immunoprécipitation entre les deux protéines
ii- Visualisation par la technique HTRF
iii- Docking possible entre DNAJC5Nter et ExoU
iv- Gel filtration et « pull-down » avec DNAJC5 et ExoU
2- Implication du domaine Cter d’ExoU dans l’interaction avec les vésicules
3- Rôle de DNAJC5 dans l’ubiquitinylation d’ExoU
4- Conclusion
Chapitre 2: Identification du récepteur cellulaire d’ExlA
A- Introduction
B- Identification des ARNg surreprésentés suite à des infections avec une souche ExlA +
C- Mutation des gènes codant pour les récepteurs potentiels d’ExlA
D- Conclusion
Chapitre 3: Développement d’un test ELISA pour la détection d’ExlA
A- Introduction
B- Présentation du test ELISA en sandwich
C- Expériences préliminaires avec les anticorps polyclonaux
D- Test ELISA avec des échantillons in vitro
E- Test ELISA avec des échantillons in vivo
F- Conclusion
DISCUSSION GENERALE
A- Le rôle joué par DNAJC5 dans le mécanisme d’activation d’ExoU
B- Vers une meilleure compréhension du mécanisme d’action d’ExlA
MATERIELS & METHODES
Chapitre 1: Interaction entre ExoU et DNAJC5
A- Construction de la souche exprimant la toxine ExoU-HA
B- Sécrétome bactérien avec induction du SST3
C- Co-immunoprécipitation
D- Production des protéines recombinantes
E- Chromatographie d’exclusion
F- Pull-down avec les protéines exprimées séparément
G- Pull-down avec les protéines co-exprimées
H- Test HTRF pour quantifier l’interaction entre ExoU et DNAJC5
1- Préparation des contrôles
2- Préparation des échantillons testés
3- Évaluation de l’interaction entre les protéines
Chapitre 2: Criblage avec la toxine ExlA
A- Infection des cellules A549-CRISPR avec ExlA
B- Extraction, séquençage et analyse d’ADN génomique
C- Inhibition des gènes sélectionnés
1- ARNg ciblant les gènes identifiés
2- Préparation des particules lentivirales contenant les ARNg
D- Production de cellules déficientes pour les gènes d’intérêt
E- Test de cytotoxicité des cellules mutées
Chapitre 3: Protocoles pour le test ELISA
A- ELISA direct avec les anticorps polyclonaux
B- ELISA en sandwich avec les anticorps polyclonaux et monoclonaux
C- Caractéristiques des expectorats de patients infectés
ANNEXES
Annexe 1: Liste des participations à des événements scientifiques
Annexe 2: Poster présenté à la 12 ème journée scientifique de l’IBS – Juin 2019 (Grenoble)
Annexe 3: Résumé pour la présentation du poster lors de la JAD de l’EDCSV – Juin 2019 (Grenoble)
Annexe 4: Communication orale lors du « Mini-Colloque Pseudomonas 2019 » – Septembre 2019 (Voiron)
Annexe 5: Article présentant l’activation de l’inflammasome par ExlA
BIBLIOGRAPHIE
