Evolution des cas de cryptococcose neuro-méningée en fonction de l’année

Mode de reproduction

Cryptococcus neoformans se reproduit par bourgeonnement généralement uni mais parfois multipolaire. Les bourgeons sont reliés à la levure mère par un col étroit pouvant former exceptionnellement des pseudos filaments [34]. Il fait des hyphes pendant l’accouplement et crée finalement des basidiospores à la fin de l’hyphe avant de produire des spores. Dans les conditions favorables, les cellules produisent une capsule polysaccharidique caractéristique.

Nutrition

Cryptococcus neoformansest retrouvé fréquemment dans les fientes des pigeons très riches en acide urique, en xanthine, en guanine et en créatinine nécessaires à son développement et à la reproduction des formes sexuées.

Caractères biochimiques

Cryptococcus neoformans est incapable de fermenter les sucres et n’assimile pas le nitrate comme source d’azote comme tous les cryptocoques. Par contre, il assimile de nombreux hydrates de carbone et l’inositol. Cette levure produit une phénoloxydase qui jouerait un rôle protecteur contre les défenses de l’hôte et une uréase qui est très importante pour l’identification de Cryptococcus neoformans. Elle est très sensible à l’actidione.

Caractères antigéniques

La capsule polyosidique du genre Cryptococcus est composée majoritairement de glucuronoxylomannane (GXM) et d’environ 10% de galactoxylomannane (GalXM) et de mannoprotéines (MP) [16].

Le Glucuronoxylomannane (GXM)

Le GXM est un polymère dont la taille n’est pas encore définitivement établie.
Le motif général de sa structure pour tous les sérotypes de cryptocoques est un squelette d’α-1,3-mannose portant des résidus β-D xylopyranosyl, acide β Dglycopyranosyluronique et des branchements 6-O-acétyl [16].
En 1998, Cherniak et son équipe ont défini 6 structures élémentaires qu’ils ont nommées SRG (structure reporter group) allant de M1 à M6. Ces structures constituent les éléments de base du GXM. L’agencement et la proportion des différents résidus varient selon les espèces, les variétés et les isolats. Ainsi la structure du GXM de chaque souche peut être définie comme un mélange de plusieurs SRG. Il existe toutefois un SRG majoritaire spécifique de chaque sérotype et un ou plusieurs SRG minoritaires.

Le Galactoxylomannane (GalXM) 

Les structures complètes du GalXM et des mannoprotéines ont pu être déterminées par purification du polyoside et des protéines à partir d’une souche de sérotype D ne produisant plus de GXM (souche Cap67) [65].
Le GalXM est un polymère α(1,6)-galactose possédant des branchements β(1-3)galactose, α(1.2)mannose et des branchements α(1.2)mannose plus ou moins β(1-3) xylosylés.

Les Mannoprotéines (MP)

Les mannoprotéines capsulaires, quant à elles, sont immunogéniques et à l’origine d’une immunité protectrice. Par exemple, la protéine MP-98, présentant des homologies de séquences avec des chitinedésacétylases, a été décrite comme fortement immunogènes vis-à-vis des cellules T [44].
La structure de la capsule change même en fonction de l’environnement in vitro (milieux de culture, temps et températures de culture) [33]. Ainsi, certaines conditions de culture (milieux riches en acides aminés, sulfate d’ammonium, incubation en présence de CO2) permettent d’induire une capsule plus large. La structure et la taille de la capsule changent aussi très rapidement au cours de l’infection.

Culture

Elle se fait sur gélose de Sabouraud sans actidione (cycloheximide) qui a une action inhibitrice sur ces levures. Laculture est positive en 3à 5 jours parfois en 3 semaines. Les cultures négatives au bout de 48 doivent être gardées pendant 4 à 6 semaines. Les colonies sont lisses, brillantes, muqueuses, coulantes de couleur blanche à crème. L’identification de Cryptococcus neoformansse fait grâce à des profils d’assimilation de sucres en particulier (galeries commercialisées). C’est une levure qui ne fermente pas, produit une Uréase et pousse à 37°C [5].

Diagnostic immunologique

Recherche d’antigènes cryptococciques

Les antigènes polyosidiques solubles ont un grand intérêt diagnostique. Ils sont habituellement recherchés dans le sérum et le LCR mais également dans le LBA et les urines. La détection de l’antigène cryptococcique se fait en général par agglutination de particules de latex sensibilisées avec des anticorps spécifiques ou plus rarement par Elisa. Ces tests ont en général, une excellente spécificité et sensibilité. L’Elisa a l’avantage de permettre le criblage d’un nombre d’échantillons, mais perd de sa valeur dans la détermination des titres antigéniques élevés [50]. Les titres antigéniques sont plus élevés dans le sérumque dans le LCR et nettement plus élevés chez les patients séropositifs que chezles patients séronégatifs [56]. Il peut y avoir des réactions faussement positives dues aux macroglobulines présentes dans le sérum des patients souffrant d’arthrite rhumatoïde, de sarcoïdose, de cirrhose, de syphilis, de sclérodermie, de psoriasis, de goutte, de lupus érythémateux disséminé [34]. Le traitement du prélèvement par une pronase permet d’éliminer ces fausses réaction s positives et de libérer les antigènes cryptococciques intégrés à des complexes immuns. Il y a parfois des interférences dues à des communautés antigéniques avec certains champignons comme Trichosporon beigelii ou avec certaines bactéries (Pseudomonas aeruginosaou Klebsiella).

Recherche d’anticorps

L’étude de l’immunité humorale s’est toujours heurtée à l’absence ou au très faible taux d’anticorps spécifiques sériques: dépression immunitaire des malades, faible antigénicité de la levure ou faible diffusion des antigènes en raison de l’épaisseur de la capsule. Ces anticorps spécifiques sont très difficilement décelables par les techniques classiques (agglutination, immunofluorescence, immunoprécipitation en gel, ELISA) et leur recherche dans la cryptococcose n’a qu’un intérêt épidémiologique [22].

Diagnostic histologique

Il repose sur l’examen anatomo-pathologique qui est indispensable pour les prélèvements tissulaires. Les biopsies d’organes (tissu nerveux, peau, organes profonds) sont colorées par diverses techniques de coloration (hématéine-éosinesafran(HES), Gomori-Grocott, PAS, Muci-carmin, Bleu Alcian, May Grunwald Giemsa) pour révéler les levures dans les tissus.
La présence de Cryptococcus neoformans dans le tissu nerveux se caractérise habituellement par une réaction inflammatoire non spécifique peu intense ; En histologie standard, après coloration en hématéine-éosine-safran (HES) s’observe une réaction cellulaire évocatrice lorsqu’elle montre un nodule mycosique (cryptococcome) composé en son centre d’une zone de nécrose plus ou moins suppurée, cernée d’une couronne d’histiocytes en palissade avec parfois quelques cellules épithélioïdes et géantes [46]. Il faut faire la coloration dans la zone de nécrose ou dans la couronne histiocytaire. Le cryptocoque est colorable par l’hématéine éosine (HE) en rose pâle, et la capsule apparaîtcomme un halo légèrement réfringent. La méthode de Gomori-Grocott (imprégnation argentique) colore les levures en noir, mais ne permet pas de visualiser la capsule. La capsule peut être colorée de façon spécifique soit par le bleu Alcian qui la colore en bleu, soit par la méthode de Mayer au Mucicarminqui la colore en rouge [41].
Cryptococcus neoformansest la seule levure Mucicarmin positive et bleu Alcian positive. Le rouge Sirus confère à la capsule une coloration rouge et une biréfringence en lumière polarisée, avec des images en croix de Malte [34].
L’immunohistochimie permetde préciser la nature de la levure dans les tissus.
Elle fait appel à des techniques d’immunofluorescence ou immunoenzymatique (peroxydase) réalisées à l’aide d’anticorps monoclonaux (anti-Cryptococcus).

Diagnostic moléculaire

Il est basé sur la mise en évidence de l’ADN de l’agent pathogène directement à partir du prélèvement biologique. Cet examen repose sur les méthodes modernes de typage moléculaire qui représentent de précieux outils d’enquête épidémiologique en milieu hospitalier. Ces méthodes sont peu utilisées enroutine.
Certains gènes sont utilisés en biologie moléculaire pour permettre la caractérisation de l’espèce, des variétés et du mating-type des souches de C. neoformans et C. gattii.Des amorces spécifiques des sérotypes A et D ont été dessinées pour amplifier des régions des gènes GPA1 et PAK1. Le gène GPA1 localisé sur chromosome 1 de C. neoformans [64] code pour la sous-unité alpha de la protéine G. Le gène PAK1 code pour une protéine kinase impliquée dans la fusion cellulaire lors de la reproduction sexuée [48]. Le gène PAK1 n’est pas localisé dans le locus MAT et il n’est donc pas spécifiquedu mating-type.

Etude de la sensibilité in vitro

Le but de cette étude est de connaitre l’activité in vitro des agents antifongiques sur les souches de Cryptococcus neoformans. Les tests utilisés sont les microméthodes en milieu liquide mises au point par les comités de standardisation américain (NCCLS) ou européen (EUCAST) et les bandelettes commercialisées type E-test qui permettent de déterminer la CMI des antifongiques. La grande majorité des isolats de Cryptococcus neoformans est sensible aux antifongiques conventionnels : amphotéricine B, 5-fluorocytosine et triazolés (fluconazole, itraconazole). Mais la résistance initiale des souches à la 5- fluorocytosine est exceptionnelle, et peut en revanche, apparaitre en cas de monothérapie fortement déconseillée. Une diminution de sensibilité à cet antifongique en cours de traitement aurait été corrélée à un risque de rechute[13]. Il existe peu de cas où la découverte de concentrations minimales inhibitrices(CMI) élevée de l’amphotéricine B a été corrélée à un échec thérapeutique [52]. Mais cela est dû à des problèmes techniques en raison de l’étroite gamme des CMI observées avec les méthode s utilisées. La majorité des souches cliniques a une sensibilité normale vis-à-vis des azolés et en particulier du fluconazole. Les échecs thérapeutiques ou les rechutes ont parfois été associés à des diminutions de sensibilité au cours du temps. Cependant une équipe a clairement démontré que l’existence d’une corrélation entre efficacité et CMI du fluconazole dépendait de la méthode utilisée pour la détermination de la CMI, ce qui rend difficile l’interprétation des résultats individuels en l’absence d’étude préalable [67]. Cela prouve que les CMI déterminées pour les souches de Cryptococcus neoformansne sont pas des valeurs absolues.

Traitement

But du traitement

Le traitement de la cryptococcose est avant tout médical et repose sur la prescription d’antifongiques. Le but du traitement est de guérir l’infection du moins de la contrôler à long terme en stérilisant les sites infectés en particulier le LCR, et en évitant les séquelles et les rechutes.

Type et période d’étude

Il s’agit d’une étude rétrospective allant de la période du 1er janvier 2004 au 31
Décembre 2010 et prospective de janvier 2011 à Décembre 2011. Elle a été effectuée chez des patients hospitalisés pour une cryptococcose neuro-méningéeà la clinique des maladies infectieuses du CHNU de Fann de Dakar.

Patients

La population d’étude était constituée par tous les patients hospitalisés à la clinique des maladies infectieuses chez qui un diagnostic de cryptococcose neuro-méningée a été posé devant la présence de la levure à l’examen microscopique direct à l’encre de chine et/ou après culture et/ou la présence d’antigène cryptococcique dans le sang ou le LCR.

Collecte de données

Outils de collecte

Les données ont été recueillies à partir de:
 Questionnaires d’enquête
 Registres de manipulation des prélèvements au laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHNU de Fann.
 Dossiers d’hospitalisation des patients à la clinique des maladies infectieuses du CHNU de Fann.

Prélèvements

Prélèvement du liquide céphalo-rachidien

Il se fait par ponction lombaire, entre la 4 ème et la 5 ème vertèbre grâce à une aiguille stérile munie de mandrin. Le LCR récupéré dans trois tubes secs était envoyé au laboratoire de parasitologie pour la recherche de la levure mais aussi au laboratoire de biochimie et de bactériologie pour l’étude cytologique et cytochimique. Il est exclusivement réalisé par un médecin.

Prélèvement sanguin

Il se fait par ponction veineuse à l’aide d’une aiguille au pli du coude. Le sang récupéré dans un tube sec est envoyé au laboratoire pour l’étude sérologique.

Examen des prélèvements au laboratoire

Dès la réception du prélèvement au laboratoire, les échantillons sont centrifugés à 1500 tours/mn pendant 5mn. Au niveau du sang, le sérum est récupéré pour laréalisation des examens sérologiques en particulier la recherche de l’antigène.
Au niveau du LCR, nous recueillons le surnageant pour la recherche de l’antigène cryptococcique et le culot pour l’examen microscopique

Examen direct du LCR à l’encre de chine

Matériel

– Lame porte objet
– Lamelle
– une pipette pasteur
– Gants
– Un microscope optique
– Un flacon d’encre de chine

Technique 

Une goutte du culot de centrifugation était mélangée avec une goutte d’encre de chine diluée au 1/5 ème et examinée entre lame et lamelle au microscope à l’objectif X10 puis à l’objectif X40.

Résultat 

Cette étape devait nous permettre d’observer la présence de levures encapsulées qui apparaissent sous la forme d’une cellule entourée d’un halo clair très net régulier de taille variable.

Culture du LCR

Ensemencement et incubation

Matériel

– Un bec benzène ou une hotte à flux laminaire
– une étuve réglée à 37° C
– une pipette pasteur
– un milieu de culture Sabouraud chloramphénicol

Technique

La culture est effectuée en présence d’une flamme ou sous la hotte. Elle consiste à ensemencer par épuisement progressif du culot sur une gélose Sabouraud chloramphénicol coulée dans un tube à essai. Le tube est incubé à l’étuve à 37°C pendant 3 à 4 semaines.

Résultat

Après 48h d’incubation, on devait observer des colonies coulantes à bord régulier devenant ocres après une semaine d’incubation.

Identification après culture

Elle consistait à mettre en évidence la présence de capsules après coloration à l’encre de chine à partir d’une colonie et observation au microscope optique à l’objectif 10X puis à l’objectif 40X.

Recherche d’antigène cryptococcique

Elle est réalisée grâce au coffret PASTOREX TM CRYPTO PLUS. Cette recherche s’effectue sur le surnageant obtenu après centrifugation du LCR ou sur le sérum du patient.
 Matériel nécessaire :
 Vortex
 Un agitateur
 Une pipette Gilson
 Un bain-marie
 Une boite de PASTOREX
TM CRYPTO PLUS

Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LA CRYPTOCOCCOSE
1. Définition
2. Historique
3. Epidémiologie
3.1. Agent pathogène
3.1.1. Classification
3.1.2. Morphologie
3.1.3. Biologie
3.2. Mode de contamination
3.3. Facteurs favorisants
3.4. Répartition géographique
4. Clinique
4. 1. Physiopathologie
4.2. Formes cliniques
4.2.1. Cryptococcose neuro-méningée
4.2.2. Cryptococcose pulmonaire
4.2.3. Cryptococcose cutanée
4.2.4. Autres formes de cryptococcose
5. Diagnostic
5.1 Diagnostic mycologique
5.2 Diagnostic immunologique
5.3. Diagnostic histologique
5.4 Diagnostic moléculaire
5.5 Etude de la sensibilité in vitro
6. Traitement
6.1. But du traitement
6.2. Moyens
6.3. Indications
7. Prévention
7.1. Prévention individuelle
7.2. Prévention collective
METHODOLOGIE
1. Cadre d’étude
2. Type et période d’étude
3. Patients
4. Collecte de données
4.1. Outils de collecte
4.2. Prélèvements
5. Examen des prélèvements au laboratoire
5.1 Examen direct du LCR à l’encre de chine
5.2 Culture du LCR
5.2.1 Ensemencement et incubation
5.2.2 Identification après culture
5.3 Recherche d’antigène cryptococcique
6. Saisie et analyse des données
RESULTATS
1. Prévalence de la CNM
2. Caractéristiques des patients de l’étude
2.1. Caractéristiques globales des patients
2.1.1. Age
2.1.2. Sexe
2.1.3. Profession
2.1.4. Evolution des cas de cryptococcose neuro-méningée en fonction de l’année
2.1.5. Répartition des cas de CNM selon l’origine et la région
2.1.6. Répartition selon le statut matrimonial et le régime
2.2. Caractéristiques socio-démographiques selon le statut VIH
2.2.1. Répartition des cas de CNM par âge et par sexe selon le statut VIH
2.2.2. Répartition de la proportion des cas de CNM par année selon le statut VIH
2.2.3. Répartition de la proportion des cas de CNM par région et par origine selon le statut VIH
2.2.4. Répartition de la proportion des cas de CNM par profession selon le statut VIH 44
2.2.5. Répartition de la proportion des cas de CNM par statut et régime matrimonial selon le statut VIH
3. Examens biologiques
3.1. Eléments d’orientation
3.1.1. Au niveau sanguin
3.1.2. Au niveau du LCR
3.2. Diagnostic de certitude
3.2.1. Résultats globaux des examens
3.2.2. Résultats des examens biologiques selon le statut VIH
4. Evaluation du niveau de fiabilité des méthodes de diagnostic biologique
4.1. Niveau de fiabilité de l’examen direct à l’encre de chine comparé à la culture
4.2. Niveau de fiabilité de la recherche de l’antigène cryptococcique dans le LCR comparé à la culture
DISCUSSION
1. Aspects épidémiologiques
2. Aspects biologiques
3. Evaluation du niveau de fiabilité des méthodes de diagnostic biologique de la cryptococcose neuro-méningée
4. Perspectives
5. Recommandations
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

Lire le rapport complet