Evolution des canaux sodiques dépendants du potentiel à l’origine des tissus excitables

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Hypothèse de la dépolarisation retardée

Une seconde hypothèse a été émise suggérant qu’un retard de conduction dans le ventricule droit serait à l’origine du SBr [31] [25, 32]. En effet, la chambre de chasse du ventricule droit est le lieu d’insertion du système vasculaire artériel dans le système musculaire du myocarde. Ces deux tissus ont des propriétés électriques différentes, ce qui pourrait représenter une surface de ralentissement de la dépolarisation et constituer un substrat anatomique responsable du retard de la conduction. L’activation asynchrone du subendocarde et du subépicarde créerait un gradient de potentiel, responsable d’un courant électrotonique, entraînant une élévation du segment ST ainsi que des phénomènes de réentrée. Ce phénomène est amplifié par la perte de fonction du canal sodique Nav1.5. En effet, un courant INa moins important diminue la vitesse de dépolarisation phase 0 du potentiel d’action, retarde la vitesse de dépolarisation du myocarde, et par voie de conséquence élargit le QRS (Figure 7A). Par ailleurs, le décalage de l’activation vers des potentiels plus positifs, souvent identifié lors de mutations du canal sodique cardiaque, augmente le seuil d’activation du potentiel d’action et retarde ainsi la dépolarisation myocardique (Figure 7B) [6]. Ce phénomène associé à une perte de courant INa est accentué lors du repos par l’augmentation de l’activité vagale et pourrait être la raison pour laquelle l’augmentation du segment ST serait plus importante au repos. Cette hypothèse est en accord avec le risque accru de syncope et de mort subite par fibrillation ventriculaire durant le sommeil chez des patients atteints du SBr (Figure 7C) [6].
A ce jour, ces deux hypothèses sont discutées, il s’avère que l’une n’exclut pas l’autre et que la combinaison d’un retard de conduction associé à un raccourcissement des potentiels d’action subépicardiques pourrait être à l’origine du syndrome de Brugada.

La sous-unité  du canal sodique cardiaque Nav1.5

La sous-unité  du canal sodique cardiaque, Nav1.5, est constituée de quatre domaines homologues (DI à DIV) de six segments transmembranaires chacun (S1 à S6) [33]. Les trois boucles reliant les domaines ainsi que les parties N- et C-terminales sont intracytoplasmiques (Figure 8) [34]. Ce canal fait partie de la famille des canaux sodiques dépendants du potentiel, Nav1.X, qui comprend neuf canaux Nav1.1 à Nav1.9 possédant des propriétés biophysiques très proches. Ils sont majoritairement spécifiques d’un tissu, mais leur expression n’est pas exclusive, Nav1.5 est par exemple majoritairement exprimé dans le coeur mais certaines isoformes sont aussi exprimées dans le cerveau [35]. Les canaux Nav1.X auraient évolué par mutations des canaux calciques Cav dépendants du potentiel qui sont aussi des canaux à quatre domaines transmembranaires [36]. A l’inverse, les gènes des canaux potassiques ne codent qu’un seul domaine. Ces derniers forment des tétramères de sous-unités le plus souvent identiques pour constituer un canal fonctionnel.
Le repliement des quatre domaines permet la formation d’un entonnoir sélectif des ions sodium, porté par le motif D/E/K/A. Chacun des 4 acides aminés de ce motif est apporté par un domaine différent (Figure 8). L’ouverture du canal est dépendante de la différence de potentiel entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule. Elle est possible grâce aux segments transmembranaires S4 chargés positivement (Figure 8). De plus, le canal sodique est capable de s’inactiver grâce à la porte d’inactivation formée de trois acides aminés hydrophobes « IFM » (isoleucine, phénylalanine, méthionine) située dans la boucle liant les domaines DIII et DIV (Figure 8). Enfin, sa fonction est régulée par de nombreuses modifications post-traductionnelles (Figure 8), sa liaison aux sous-unités  et à certains partenaires qui feront l’objet des chapitres suivant.
L’apparition de mutations dans le gène SCN5A a très souvent des conséquences biologiques importantes. En effet, de nombreuses mutations « perte de fonction » ont été répertoriées dans le gène SCN5A (Figure 9) [21]. Ces mutations peuvent altérer les propriétés cinétiques d’ouverture du canal, son expression et sa distribution à la membrane, ou encore sa dégradation [6, 37-39]. Ces mutations sont responsables d’arythmies cardiaques telles que le SBr, des troubles de la conduction (CCD pour cardiac conduction disease) dont la maladie de Lenègre. Cette dernière se manifeste par un bloc de branche droit ou gauche avec, à l’ECG, un élargissement du complexe QRS, puis par un bloc auriculo-ventriculaire, dû à un ralentissement important de la dépolarisation. Enfin ces mutations ont aussi été identifiées chez des patients atteints de fibrillations atriales (FA), ou de dysfonction du noeud sinusal (DNS) [39, 40]. Néanmoins, la raison de la fibrillation atriale due à une perte de courant sodique est moins bien comprise, mais pourrait être liée au raccourcissement de la période réfractaire atriale et au ralentissement de la conduction qui sont considérés comme des substrats pour les réentrées responsables des arythmies [41]. Par ailleurs, plus de 80 mutations menant à un gain de fonction ont été identifiées. Ces dernières sont le plus souvent associées à un défaut d’inactivation [42, 43] et sont responsables du syndrome QT-long (SQTL), une maladie associée à un allongement de l’intervalle QT dû à une prolongation du potentiel d’action. Enfin, une perte ou un gain de fonction du canal Nav1.5 peuvent conduire à des cas de mort subite infantile (MSI) [22, 23].

Evolution des canaux sodiques dépendants du potentiel à l’origine des tissus excitables

Les canaux sodiques dépendants du potentiel (Nav) furent les premiers de la superfamille des canaux ioniques à être découverts. Cette dernière inclut les canaux potassiques (Kv) et calciques (Cav) dépendants du potentiel, les canaux apparentés aux TRP (Transient Receptor Potential), une famille de canaux perméables à différents cations, ainsi que les canaux dépendants des nucléotides cycliques. Cependant, la famille des canaux sodiques dépendants du potentiel (Nav) serait la plus récemment apparue au cours de l’évolution. Le canal « classique » à quatre domaines n’a pas été retrouvé chez les procaryotes. Néanmoins, un canal sodique dépendant du potentiel à un seul domaine mais formant des homo-tétramères a récemment été identifié dans la bactérie Bacillus Halodurans. Ce dernier possède des séquences et des caractéristiques pharmacologiques proches des canaux calciques dépendants du potentiel et est très certainement l’ancêtre des canaux Nav et Cav connus chez les vertébrés [44, 45].
L’évolution du règne animal a pris un réel essor avec l’apparition du système nerveux, présent chez tous les animaux excepté chez les éponges et les métazoaires. La communication intercellulaire sur de longues distances à travers les cellules excitables est apparue chez les animaux bilatériens et quelques cnidaires (méduses) grâce aux potentiels d’action générés dans les neurones par les canaux sodiques dépendants du potentiel. Les canaux calciques dépendants du potentiel ont évolué dans les cellules eucaryotes unicellulaires où ils jouent un rôle dans la signalisation intracellulaire.
Il est communément accepté que les canaux Nav dérivent des canaux Cav, et que leur apparition est à l’origine du système nerveux [36]. Cette idée est renforcée par le manque apparent de courant sodique chez les éponges. Cette innovation aurait permis aux cellules de propager le potentiel d’action sans interférer avec la concentration de calcium intracellulaire utilisée dans la signalisation [46].

La famille des canaux sodiques Nav1.X chez les mammifères

Neuf sous-unités  dépendantes du potentiel ont été caractérisées (Nav1.1 à Nav1.9). Une dixième (Nax) a été rapportée et pourrait aussi fonctionner comme un canal sodique [57], [59]. Les acides aminés de ces canaux sont conservés à plus de 50% dans les segments transmembranaires et boucles extracellulaires. Au moins 20 exons codent chacun des neuf canaux sodiques. Leurs gènes sont classés en quatre groupes selon leur évolution, et les membres de chaque groupe sont localisés sur un même segment de chromosome (Figure 13). Les segments chromosomiques contenant les gènes des canaux sodiques sont paralogues (issus de duplications) et chacun contient de plus un groupe de gènes Hox (Homeobox) codant pour des facteurs de transcription impliqués dans le développement [58]. Ces facteurs de transcription interviennent dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur tel que le tube neural et sont responsables de l’identité cellulaire durant le développement [60]. Par ailleurs, on notera que les gènes des canaux sodiques et les gènes Hox, sont réexprimés de façon pathologique dans des cellules cancéreuses capables de métastaser et sont impliqués dans la mobilité cellulaire [60-62].

Le canal sodique cardiaque dépendant du potentiel, Nav1.5

Le gène SCN5A est constitué de 28 exons : les exons 2 à 28 codent la protéine, l’exon 1 et une partie de l’exon 2 codent selon l’épissage pour différentes séquences non traduites en 3’ (ou 3’UTR), et la fin de l’exon 28 pour différentes séquences de régions non traduites en 5’ ou (5’UTR pour untranslated region) [68]. Les isoformes cardiaques, Nav1.5, Nav1.5a, Nav1.5b, Nav1.5c, Nav1.5d sont issus de différentes variations d’épissage (Figure 14). En plus de ces cinq isoformes, il existe des isoformes néonatales, Nav1.5hNbR1 et Nav1.5hNbR1-2, issues d’un épissage alternatif de l’exon 6 en exon 6A. L’exon 6A code pour le même nombre d’acides aminés que l’exon 6 mais possède 7 substitutions situées dans le segment S3, la boucle liant le segment S3 et S4 et le segment S4 du domaine DI (Figure 14A) [35, 68]. Les caractéristiques biophysiques de l’isoformes Nav1.5hNbR1 ont été étudiées par Onkal et coll. et présentent un décalage de la courbe d’activation vers des potentiels dépolarisés et de la courbe d’inactivation vers des potentiels hyperpolarisés. Par ailleurs, la cinétique d’inactivation est altérée et le retour à l’état activable plus rapide [61]. Ces isoformes néonatales sont aussi exprimées dans certaines cellules cancéreuses capables de métastaser comme la lignée cellulaire humaine de neuroblastome NB-1 et la lignée cellulaire humaine de cancer du poumon MDA-MB 231. La présence du canal dans ces cellules pourrait être associée à leur comportement invasif [61, 62]. Récemment, Wang et coll. ont montré la présence de deux nouvelles isoformes dans le cerveau adulte, toutes deux issues de l’épissage alternatif de l’exon 6 : Nav1.5hB1 et Nav1.5hB2 (Figure 14A). De plus, Nav1.5hB1 possèderait 20 substitutions d’acides aminés réparties dans diverses régions du canal comparée à l’isoforme néonatale Nav1.5hNbR1. Néanmoins, l’origine de ces substitutions n’est pas encore connue [35]. Quant à l’isoforme Nav1.5hB2, elle ne possède pas l’exon 24, en conséquence elle perd 18 acides aminés de la boucle du segment S5/S6 du domaine DIII qui sont nécessaires à la formation du filtre sélectif du canal, aussi la fonctionnalité de cette dernière isoforme reste à déterminer [35].
Il est intéressant de noter que le polymorphisme H558R est connu pour avoir la capacité de restaurer partiellement le courant sodique altéré par certaines mutations, même si le polymorphisme est situé le second allèle. Récemment, Shinlapawittayatorn et coll. ont montré qu’un polypeptide encadrant la région du polymorphisme possédait cette capacité. Aussi ces auteurs suggèrent que le polypeptide pourrait faciliter le repliement de la protéine mutante et permettra ainsi son transport vers la membrane [69-72]. Ces derniers résultats suggèrent que les canaux Nav1.5 pourraient intéragir dès le Réticulum Endoplasmique.

La partie N-terminale des canaux sodiques dépendants du potentiel

Si beaucoup de régions fonctionnelles des canaux sodiques ont été étudiées suite à l’identification de mutations chez des patients, peu d’études se sont intéressées aux mutations de la partie N-terminale de ces canaux. Ainsi, ce paragraphe a pour rôle de résumer ces travaux.
En ce qui concerne le canal Nav1.5, des mutations ont été identifiées chez des patients présentant des arythmies telles que le SBr, des troubles de la conduction ou le SQTL [21, 39]. Deux études fonctionnelles ont été réalisées sur ces mutations. Le canal sodique R121W-Nav1.5, exprimé dans des cellules HEK293, n’est pas fonctionnel et semble être dégradé [39]. Une autre étude rapporte que le variant R43Q induirait un décalage hyperpolarisant de l’activation, mais seulement en présence de lidocaine [110].
Un plus grand nombre de mutations de cette région a été répertorié dans Nav1.1 codé par le gène SCN1A. Ces mutations sont à l’origine de formes d’épilepsie infantile ou du syndrome de Dravet [111]. Il est intéressant de noter que pour les mutations R101W et R118S-Nav1.1, les acides aminés affectés sont analogues à ceux du canal sodique cardiaque portant les mutations R104W et R121W-Nav1.5. Ceci, associé à la conservation de la région suggère qu’elle pourrait avoir une fonction importante et peut-être similaire au sein de la famille des canaux Nav1.X (Figure 19).

Les partenaires du canal sodique cardiaque Nav1.5

La sous-unité  du canal sodique cardiaque est la protéine constituant le pore du canal ionique. Elle est fonctionnelle seule, mais reste néanmoins la pièce centrale d’un complexe canalaire beaucoup plus important. Ce complexe, qui comprend de nombreux partenaires est très difficile à étudier dans son intégralité. Ces protéines peuvent réguler sa fonction, son expression à la membrane et sa localisation subcellulaire (Tableau 4). Des mutations dans les gènes codant ces partenaires ont aussi été identifiées dans des pathologies cardiaques telles que le SQTL congénital [186] ou le syndrome de Brugada [187]. Les protéines partenaires du canal sodique peuvent être classées comme (1) des protéines d’ancrage ou adaptatrices, ce sont des protéines qui jouent un rôle dans le transport et la localisation subcellulaire du canal, (2) des enzymes capables d’interagir et de modifier la structure du canal comme les tyrosines kinases, les ubiquitines ligases, impliquant des modifications post-traductionnelles; et enfin (3) des protéines capables de modifier les propriétés biophysiques du canal (Tableau 4). Le but de ce chapitre est de passer en revue les partenaires déjà connus, de mieux comprendre comment ils peuvent réguler la biologie et la fonction du canal et d’évaluer leur implication dans les arythmies.

L’ankyrine-G / syndrome de Brugada de type 8

Les ankyrines organisent, transportent et ancrent les canaux ioniques au cytosquelette d’actine et de spectrine [188]. Trois gènes codent pour les différentes ankyrines, (ANK1, ANK2, ANK3). Les ankyrines B et G, codées par ANK2 et ANK3, sont exprimées dans le coeur [188]. Des variants du gène ANK2 ont été identifiés dans certaines pathologies cardiaques telles que le SQTL de type 4 [189], des dysfonctions du noeud sinusal, la fibrillation auriculaire, des troubles de la conduction et des morts subites, définissant ainsi un « syndrome cardiaque ankyrine B » [190]. Il n’y a cependant aucune évidence que le courant sodique puisse être directement régulé par l’ankyrine B, bien que chez les souris déficientes en ankyrine B, le courant sodique des myocytes présente un courant tardif similaire à celui observé chez les patients atteints de SQTL de type 3 dont le canal sodique est muté [191]. L’ankyrine G interagit directement avec le motif de liaison à l’ankyrine dans la boucle liant les domaines II et III de Nav1.5 [192] (Figure 22). Une mutation dans Nav1.5, E1053K, a été trouvée dans ce motif chez un patient atteint du syndrome de Brugada. Elle empêche la liaison entre les deux partenaires [193]. L’expression de Nav1.5 sauvage et mutant dans des cardiomyocytes adultes, via une infection virale, montre que le canal sauvage est capable d’atteindre la membrane plasmique alors que le canal E1053K est retenu dans des compartiments intracellulaires [193]. Ces résultats ont été confirmés par la suite, par des expériences d’inhibition génique de l’ankyrine-G dans des cardiomyocytes néonataux qui présentent une réduction d’expression de Nav1.5 ainsi qu’une diminution du nombre de canaux à la membrane [194]. Ces résultats suggèrent que ANK3 devrait être ajouté à la liste des gènes candidats des arythmies cardiaques causées par une réduction de la fonction de Nav1.5.

La syntrophine 1 / SQTL de type 12

Il a été montré que Nav1.5 interagissait avec la dystrophine de façon indirecte via une protéine adaptatrice, la syntrophine 1 (SNTA1) [129]. Le domaine PDZ de la syntrophine interagit avec un motif constitué des trois derniers acides aminés de Nav1.5 : sérine-isoleucine-valine (SIV) (Figure 22) [195]. Précédemment, il a été montré que la syntrophine interagissait avec la nitrique oxyde synthase (NOS) qui est exprimée de façon constitutive dans le coeur et l’ATPase dépendante du couple Ca2+/calmoduline (PMCA4b) [196, 197]. En présence de SNTA1, PCMA4b agit comme inhibiteur de la production de NO par la NOS. Il est important de noter que le NO augmente le courant INaL du cardiomyocyte [198]. De ces résultats, Ueda et coll. ont suggéré que des mutations dans SNTA1 pourraient rompre la liaison avec PMCA4b, en annulant la capacité de PMCA4b d’inhiber NOS, ce qui aurait pour conséquence d’augmenter la concentration de NO et le courant INaL [199]. Ces auteurs ont identifié la mutation A390V dans SNTA1 chez un individu isolé. Des expériences de GST-pull down ont révélé une interaction entre la partie C-terminale de Nav1.5, NOS, PMCA4b et la SNTA1. La mutation A390V dans SNTA1 rompt sélectivement l’interaction de PMCA4b avec Nav1.5 et NOS. Ce mécanisme est associé à une augmentation de la nitrosylation de Nav1.5. De plus, la coexpression dans des cellules HEK293 de Nav1.5, NOS, PMC4Ab et du mutant A390V augmente le courant persistant INa et décale l’inactivation vers des potentiels positifs, menant à un élargissement du courant de fenêtre entrant comparé à la coexpression avec la syntrophine sauvage. Ce gain de fonction est aboli dans les cellules incubées avec du L-NG-monomethyl arginine (L-NMMA), un inhibiteur de NOS. La surexpression du mutant A390V dans des cardiomyocytes augmente aussi le courant sodique persistant par rapport aux cellules exprimant la forme sauvage [199]. Ces données montrent que NOS, PMCA4b, et SNTA1 jouent un rôle clé dans la régulation de la nitrosylation de Nav1.5 et dans l’amplitude du courant INa persistant. Wu et coll. ont également identifié la mutation A257G chez trois patients SQTL [200]. Ce mutant augmente le courant sodique et décale l’activation vers des différences de potentiels négatives, résultant à nouveau en un élargissement du courant de fenêtre entrant dans les cellules HEK293 et les cardiomyocytes. Bien que cette mutation ne semble pas augmenter le courant persistant, les effets sont similaires à ceux retrouvés chez les patients atteints de SQTL de type 3 chez lesquels Nav1.5 est muté [23]. Enfin, des mutations dans la syntrophine ont aussi été retrouvées chez des patients atteints de MSI [201]. Cheng et coll. ont identifié six variants dans SNTA1: G54R, P56S, T262P, S287R, T372M et G460S chez huit patients. Il est intéressant de noter que la coexpression dans des cellules HEK293 de Nav1.5 avec les mutants G54R et P56S ne semblent pas altérer le courant sodique par rapport à la coexpression avec la syntrophine sauvage. Le mutant T262P augmente le courant sodique alors que S287R, T372M et G460S ont des effets similaires au mutant A390V cité ci-dessus: une augmentation du courant persistant INa et un décalage de l’inactivation vers des potentiels positifs.
Dans le coeur des souris mdx déficientes en dystrophine, un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne, la quantité de protéines Nav1.5 est diminuée [129]. La diminution d’expression de Nav1.5 implique une perte de courant INa à l’échelle de la cellule, conduisant à des défauts de conduction visibles à l’ECG et par une augmentation de la durée du QRS. La diminution d’expression de Nav1.5 n’est pas corrélée avec une diminution d’ARNm de SCN5A [129], suggérant un défaut traductionnel ou un manque de stabilité de la protéine en l’absence de dystrophine. Une étude récente montre que l’utrophine fait aussi partie de ce complexe multi-protéique. C’est une protéine homologue à la dystrophine surexprimée dans les muscles des souris mdx qui pourrait compenser l’absence de dystrophine, expliquant ainsi le phénotype moins sévère. Cette protéine est aussi capable de se lier à la syntrophine et donc au canal sodique cardiaque [202]. Cette dernière étude montre chez des souris issues de la double invalidation génique pour la dystrophine et l’utrophine, une perte de courant sodique encore plus importante. Il a aussi été récemment montré que le complexe Nav1.5-syntrophine-dystrophine était localisé à la membrane latérale des cardiomyocytes, contrairement au complexe Nav1.5-SAP97 qui est localisé aux disques intercalaires, suggérant qu’il puisse exister deux pools de canaux sodiques [203].

Table des matières

Introduction
I. Le coeur
A/ Anatomie
B/ Le potentiel d’action initiateur de la contraction cardiaque
C/ Le couplage excitation-contraction
D/ La propagation du potentiel d’action, un substrat pour les arythmies
II. Le syndrome de Brugada (SBr)
A/ Historique
B/ Epidémiologie du syndrome de Brugada
C/ Génétique du syndrome de Brugada
D/ Phénotypes cliniques du syndrome de Brugada
E/ Rôle de la perte du courant INa dans l’élévation du segment ST
E.1/ Hypothèse de la repolarisation précoce
E.2/ Hypothèse de la dépolarisation retardée
III. La sous-unité  du canal sodique cardiaque Nav1.5
A/ Evolution des canaux sodiques dépendants du potentiel à l’origine des tissus excitables
A.1/ Evolution de la sélectivité du pore
A.2/ Evolution de l’inactivation rapide
A.3/ La famille des canaux sodiques Nav1.X chez les mammifères
B/ Le canal sodique cardiaque dépendant du potentiel, Nav1.5
B.1/ Les isoformes du canal sodique Nav1.5
B.2/ Structure du canal sodique Nav1.5
C/ La partie N-terminale des canaux sodiques dépendants du potentiel
D/ Régions de régulation post-traductionnelle
IV. Les sous-unités Nav structure et fonctions
A/ Les sous-unités Nav1 et Nav1B
B/ La sous-unité Nav2
C/ La sous-unité Nav3
D/ La sous-unité Nav4
V. Les partenaires du canal sodique cardiaque Nav1.5
A/ Les protéines d’ancrage ou adaptatrices
A.1/ L’ankyrine-G / syndrome de Brugada de type 8
A.2/ La syntrophine 1 / SQTL de type 12
A.3/ La SAP97
A.4/ MOG1 / syndrome de Brugada de type 11
A.5/ L’alpha-actinine-2
B/ Les Enzymes
B.1/ L’ubiquitine ligase Nedd4
B.2/ La CAMKII
B.3/ La protéine Tyrosine Phosphatase PTPH1
C/ Les protéines capables de modifier les propriétés biophysiques du canal
C.1/ La protéine 14-3-3
C.2/ La cavéoline-3 / SQTL type 9
C.3/ FHF1B ou FGF12-1b
C.4/ La calmoduline
C.5/ La protéine GPD1L / syndrome de Brugada de type 2
C.6/ La téléthonine
C.7/ La plakophiline-2
D/ Conclusions sur les partenaires et perspectives
VI. Objectifs du travail de thèse
Résultats
I. Etude fonctionnelle de mutations de la partie N-terminale du canal sodique Nav1.5
A/ Résumé de l’article soumis pour publication “Dominant-negative suppression of the cardiac sodium channel by N-terminal mutations”
A.1/ Introduction
A.2/ Résultats
A.3/ Conclusion
A.4/ Article
B/ Implication de la partie N-terminale dans la fonction du canal sodique cardiaque
II. Etude fonctionnelle d’une mutation induisant la formation d’un codon stop prématuré dans la partie C-terminale de Nav1.5
A/ Introduction
B/ Résultats
Discussion
I. Etude fonctionnelle de la partie N-terminale du canal sodique Nav1.5
II. Discussion préliminaire sur l’étude fonctionnelle du canal R1860GfsX12-Nav1.5 . 110
Conclusion
Bibliographie

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