Évaluation in vitro de l’activité antipaludique sur les souches de Plasmodium falciparum

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LE BLEU DE METHYLENE

Le chlorure de méthylthioninium plus communément appelé bleu de méthylène (BM) appartient à la famille des phénothizinium et fut synthétisé pour la première fois en 1876 par Caro (Perea-Sasiain J. 2003 ; Gensini et al., 2006). Dix ans plus tard Paul Ehrlich un biochimiste allemand qui partagea le prix Nobel de physiologie en 1908 avec Elya Mechnikov, proposa le bleu de méthylène comme colorant vital des cellules ganglionnaires et des terminaisons nerveuses (Vennerstrom et al., 1995). Celli et Guarnieri démontrèrent que le bleu de méthylène colorait de manière spécifique les plasmodia (Vennerstrom et al., 1995 ; Gensini et al., 2006). Grace à cette observation, Ehrlich et Paul Guttmann en 1891, l’administrèrent avec succès à deux patients infectés par Plasmodium (Guttmann et Erlich, 1891). Pour la première fois une drogue de synthèse et non d’origine naturelle était active contre le paludisme. Plus tard le BM avec la quinine, servirent de point de départ structural pour le développement des 8-aminoquinoline (pamaquine) et 9-aminoacridine mepacrine (quinacrine) en 1925 et 1930, respectivement (Vennerstrom et al., 1995 ).
Des travaux antérieurs ont montré que le MB devrait être reconsidéré dans le traitement du paludisme. En effet, le bleu de méthylène présente une remarquable activité antipaludique in vitro et in vivo. Il est aussi très sélectif, il n’a pas de résistance croisée avec la chloroquine. Des travaux anciens ont montré que chez des souris infectées par P. berghei soumises à des doses subcuratives de bleu de méthylène pendant 4 mois, le parasite développe une résistance très faible moins marquée que pour la chloroquine et réversible (Thurston, 1953).
De plus, son mécanisme d’action sur la biominéralisation de l’hème et sur la glutathion réductase est bien compris. Enfin, sa synthèse est maîtrisée, et son coût de production extrêmement faible (quelques cents le gramme) et il est encore utilisé en thérapeutique sous d’autres indications (Schirmer et al., 2003).
Cependant, la limitante resterait le déficit en G6PDH, ceci s’explique sur le plan biochimique : Les stades intraérythrocytaires de Plasmodium présentent un intense métabolisme du glutathion. Cette enzyme joue un rôle clé dans le maintien de l’environnement réducteur du cytoplasme. Le glutathion réduit (GSH) fournit des électrons pour la synthèse des deoxyribonucléotides et participe à la détoxification de l’hème. Il est aussi connu comme coenzyme du système glyoxalase qui détoxifie le methylglyoxal, un métabolite de l’intense glycolyse de Plasmodium. Le BM provoque l’oxydation du glutathion par le peroxyde d’hydrogène engendré par l’autooxidation du leucoBM qui provient de la réduction du BM par le NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate réduit). Selon certains auteurs, le MB oxyderait aussi directement le glutathion. Le NADPH, joue un rôle clé dans la réduction du glutathion oxydé (par la glutathione réductase), l’activation de la diribonucléotide réductase qui est l’enzyme limitant de la synthèse de l’ADN, pour le bon fonctionnement de la catalase et pour la synthèse des bases pyrimidiques. Le BM entre en compétition avec le glutathion oxydé pour le NADPH, bloquant ainsi la réduction du GSSG en GSH. En effet, les électrons circulent depuis le glucose-6-phosphate via l’enzyme glucose-6-phosphate déhydrogénase (G6PD) vers le NADP, puis du NADPH via une flavine réductase vers le bleu de méthylène qui se transforme en une forme réduite incolore, le leukobleu.
Ceci explique pourquoi le MB ne devrait pas être administré chez des patients déficitaires en glucose-6-phosphate déhydrogénase, cette enzyme étant la source primordiale de NADPH dans les globules rouges. En effet, l’oxydation directe du glutathion par le bleu de méthylène associée à une diminution de la conversion du glutathion oxydé (GSSG) en glutathion réduit (GSH) peut engendrer des épisodes hémolytiques ou encore des méthémoglobinémies toxiques Figure 2.

L’INTERACTION HEME/GLUTATHION

La recherche de nouveaux antipaludiques repose sur l’utilisation de modèles in vitro (P. falciparum) et in vivo (Plasmodium murins). Indépendamment d’être coûteux et de soulever des problèmes moraux, ces essais prennent également du temps et les résultats sont obtenus en 3-5 jours, ce qui n’est pas approprié au criblage à haut débit. Pour détecter des activités antipaludiques, d’une manière plus économique et plus rapide, il est possible d’étudier l’impact d’une drogue sur un événement métabolique spécifique de Plasmodium appelé « cible », reproduit en plaques de microtitration.
La connaissance de la biochimie de Plasmodium a révélé beaucoup de cibles potentielles pour de nouvelles drogues; la dégradation de l’hémoglobine en fait partie. Plasmodium ingère l’hémoglobine par pinocytoses et la dégrade postérieurement dans sa vacuole digestive acide (pH 5,0 – 5,4), dans laquelle ont été caractérisées des protéases (plasmepsines I et II, falcipaine). La dégradation de l’hémoglobine démarre par l’action de la plasmepsine I qui coupe la liaison Phe33-Leu34. Les plasmepsines (I et II) et la falcipaine peuvent ensuite dégrader l’hémoglobine conduisant à de petits peptides (Figure 3). Hors de la vacuole, l’action des carboxypeptidases libère des acides aminés utilisés par Plasmodium pour la synthèse de ses propres protéines. La conséquence de ce processus est la libération du groupement hème toxique pour le parasite (Olliaro et al., 1995 ; Francis et al., 1996 ; Silva et al., 1996 ; Francis et al., 1997 ; Ridley, 1997 ; Rosenthal, 1998 ; Garavito et al., 2002).
Il a été démontré que des concentrations d’hème de l’ordre de 20 mM dégradent la membrane du parasite en 10 minutes. Cette quantité est produite par la digestion de seulement 1 % de l’hémoglobine érythrocytaire (le parasite consomme environ 75% de l’hémoglobine présente dans le globule rouge). Le groupe prosthétique (hème) maintient le fer en son état ferreux. Une fois libéré de sa protéine, il tend à perdre un électron et assumer son état ferrique à l’origine des dommages de la membrane par sa capacité à générer des espèces réactives de l’oxygène (Figure 4). De même, il interfère avec la voie de dégradation de l’hémoglobine (la falcipaine est très sensible à la présence de l’hème). Plasmodium requiert donc des processus hautement efficaces pour se débarrasser de ce résidu (Atamna et Ginsburg, 1995; Ginsburg et al., 1998; Garavito et al., 2002).

Les souches de plasmodies

Plasmodium falciparum

Quatre souches de référence de Plasmodium falciparum ont été utilisées :
la souche F32 originaire de Tanzanie, sensible à la chloroquine.
la souche HB3 originaire du Honduras, sensible à la chloroquine et à la pyriméthamine (Bhasin et Trager, 1984).
la souche FcM29 originaire du Cameroun, résistante à la chloroquine.
la souche FcB1 originaire de Colombie, résistante à la chloroquine (Trager et Jensen, 1976).

La lignée cellulaire

BJAB est une lignée cellulaire humaine de lymphome type B, dérivée d’un cas africain exceptionnel de lymphome de Burkitt établie par Menezes et al. en 1975 (Steinitz et Klein, 1975). Cette ligne cellulaire a été fournie par l’Institut Pasteur de Guyane (V. Lacoste) où l’essai a été effectué.

Les animaux

Comportement éthique vis-à-vis de l’expérimentation animale

Toute expérimentation animale doit suivre la règle des 3 Rs (Réduction, Remplacement, Raffinement) énoncée par Russell et Buch (1959) et également se conformer aux principes de Marshall Hall (cités par Monamy, 2000) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés ou de les remplacer, ou encore de réduire la douleur, le stress ou la détresse des animaux. En France, le décret 2001-464 du 29 mai 2001 et en Colombie la Résolution 008430 de 1993 du Ministère de la Santé précisent les règles relatives à l’éthique qui s’imposent à l’expérimentation animale.

Les rongeurs

Les animaux utilisés sont des souris albinos Swiss IOPS OF1 femelles non-consanguines (Charles Rivers LaboratoriesTM) pesant entre 20 et 25 grammes, et âgées de 4 à 8 semaines. Les animaux sont élevés avec boisson et nourriture ad libitum, en lots n’excédant pas 6 individus et en animalerie soumise à une alternance artificielle jour/nuit de 12 heures (6 h – 18 h).

Le vecteur expérimental

L’élevage d’Anopheles stephensi Liston, 1901 utilisé au MNHN provient d’un élevage initialement établi par Shute et Maryon en 1966.

CULTURE / ELEVAGE ET MAINTENANCE

Plasmodium falciparum in vitro

Trager et Jensen (1976) ont décrit un protocole pour la culture des stades érythrocytaires de P. falciparum in vitro. Desjardins et al., (1979) ont proposé une miniaturisation et semi-automatisation permettant la culture sur des plaques de microtitration et la quantification de la croissance parasitaire par l’incorporation d’un précurseur d’acides nucléiques radio marqué. Cette technique nous a permis de déterminer l’activité antipaludique du BM et des autres drogues. Elle est aussi le point de départ des techniques de détermination du stade sensible et de combinaison de drogues.

Entretien de la culture de Plasmodium falciparum in vitro

Les souches sont maintenues en culture continue au laboratoire selon la technique de Trager et Jensen (1976). Les GRP sont cultivés dans des flacons de 25 cm3 (Corning Costar Corporation, USA) contenant 8,5 ml de milieu RPMI 1640, 0,7 ml de SH, 0,1 ml de L-glut. et 400 µl de sang parasité (hématocrite = 4 %). La parasitémie est maintenue entre 0,7 et 3 % (autour de 2 %). Les ajustements de parasitémie sont réalisés avec des hématies saines lavées (Annexe 2).
Les cultures sont incubées dans une étuve à 37°C, avec 5% de CO2, et une humidité autour de 90%. Le milieu est renouvelé quotidiennement et un contrôle microscopique (x 1000) de la parasitémie est effectué par la réalisation d’un frottis sanguin fixé au méthanol, coloré au Giemsa, afin de vérifier le bon état de la culture (Annexe 2).

Plasmodium de rongeur

Constitution des stocks de sang parasité et conservation

Un lot de cinq souris est infesté (par voie intra péritonéale) à partir d’un même stock de sang congelé. L’évolution de la parasitémie est contrôlée régulièrement sur frottis. Lorsque la parasitémie avoisine 20 %, les souris sont anesthésiées avec un mélange de Rompun® à 0,4% et d’Imalgène®500 à 3,5% (2,5 ml/kg par voie intrapéritonéale) et 1 ml de sang environ est prélevé à chaque souris par ponction cardiaque à l’aide d’une seringue héparinée. Le sang de toutes les souris est mélangé à la seringue dans un tube hépariné. Une solution de glycérol à 10 % (1 ml de glycérol + 9 ml de NaCl 0,9%) est ajoutée volume à volume au sang parasité. Le sang ainsi glycérolé est réparti dans des tubes à congélation à raison de 1 ml par tube puis stocké dans un congélateur à -70°C, ou bien dans l’azote liquide à -196°C. Ce procédé permet d’effectuer plusieurs expériences à partir d’un même stock de sang congelé.

Infestation et suivi de l’infection

Les rongeurs sont infestés soit avec du sang parasité, soit avec des sporozoïtes. Afin d’obtenir directement une infection sanguine, 2106 globules rouges parasités (dilués dans de l’eau physiologique – NaCl 0,9%), provenant directement de sang de souris infestées, sont inoculés par voie intra-péritonéale. Afin d’obtenir une infection hépatique, les sporozoïtes sont inoculés par voie intraveineuse à raison de 1,5104 sporozoïtes (NaCl 0,9%) par inoculum.
L’observation des parasites se fait sur frottis, réalisés en prélevant une goutte de sang à la queue des souris. Les frottis sont fixés au méthanol et colorés pendant 45 minutes au Giemsa (MerckTM) dilué à 8 % dans du tampon phosphate (KH2PO4 15 mM ; Na2HPO4, 12H20 15 mM ; pH 7,2). La parasitémie (nombre de parasites pour 100 hématies) est évaluée sur 2 000 hématies.

Les cellules

Culture et conservation de la lignée cellulaire BJAB

Les cellules BJAB sont maintenues en suspension dans du milieu RPMI 1640 additionné de 2 mM de L-glutamine, 20 mM de bicarbonate de sodium, 25 mM de glucose, 10 mM d’HEPES et 1 mM de pyruvate de sodium et supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal décomplémenté (SVFd) (Sigma®). Les cultures sont maintenues à 37°C sous une atmosphère à 5% de CO2 et 90% d’humidité. Le repiquage se fait tous les 3 jours. Les cellules sont collectées par centrifugation (200g, 3 minutes) et une dilution est faite dans un milieu neuf en fonction du nombre de cellules; la culture doit contenir au maximum 3106 cellules/ml. Lorsque ce seuil est atteint, une nouvelle culture est lancée avec 4105 cellules. Pour la conservation, 1107 cellules/ml dans un milieu SVFd/diméthyl sulfoxide (DMSO) (90/10) sont congelées dans l’azote liquide (Steinitz et Klein, 1975; Diller et al., 2005; Bertani, 2006).

Anophèles stephensi

Elevage

La méthode d’élevage d’An. stephensi a été adaptée de la méthode de Shute et Marion (1966). La température et l’hygrométrie de l’insectarium sont de 23±1°C et 80±5% respectivement. Les imagos sont maintenus dans des cages autoclavables de 505050 cm et de l’eau glucosée (5%) est disponible en permanence. Une fois par semaine, les imagos femelles prennent un repas sanguin sur un lapin anesthésié avec un mélange de Vetranquil® à 1% et d’Imagène®500 à 0,25% (1 ml/kg par voie intramusculaire). Les pontes sont récoltées le 3e jour suivant le repas sanguin et les œufs sont transférés dans une cuvette d’eau. Les larves sont nourries quotidiennement avec des biscuits canins réduits en poudre (sans poisson dans leur composition) supplémentés en Superlevure-Gayelord Hauser® (8%) jusqu’à l’apparition des nymphes. Une fois la mue effectuée, les imagos sont collectés soit dans des cages de « pondeurs », soit dans des cages d’expérience (Bertani, 2006).

Production de sporozoïtes de Plasmodium yoelii yoelii

Une souris est infectée à J0 avec des globules rouges infectés par P. yoelii yoelii. A J3, 100 imagos sont nourris avec le sang de la souris anesthésiée. Les moustiques sont ensuite remis en conditions d’élevage pendant 14 jours. A J10, la présence d’oocystes est vérifiée par dissection de l’estomac d’une dizaine de moustique. A J17, les sporozoïtes sont récoltés par dissection du thorax et extractions des glandes salivaires des moustiques (Bertani, 2006).

TECHNIQUES PARTICULIERES

Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vitro a. Test de chimiosensiblité de Plasmodium falciparum

Les souches de Plasmodium falciparum on été travaillées avec une parasitémie ajustée entre 1 et 2% dans les conditions de cultures décrites précédemment. Le test s’effectue en microplaques de 96 puits (TPP, Switzerland) à raison de 200µl par cupule en triples essais. Plusieurs témoins sont également préparés (témoin de croissance et témoin négatif) :
Puits test: 100µl de solution à tester + 100µl de suspension globulaire (RPMI, SH 10%, L-Glutamine 1%, GRP hématocrite 1,5%),
Témoin de croissance (sans produit): 100µl RPMI + 100µl suspension globulaire (RPMI, SH 10%, L-Glutamine 1%, GRP hématocrite 1,5%),
Témoin négatif (hématies saines): 100µl RPMI + 100µl suspension globulaire (RPMI, SH 10%, L-Glutamine 1%, GRS hématocrite 1,5%),
Pour les microtests, nous avons adapté la technique décrite par Desjardins et al. (1979). Nous avons fait agir les différentes concentrations d’antipaludiques sur les formes jeunes en anneau des stades sanguins de Plasmodium falciparum (obtenues par synchronisation avec 5% D-sorbitol, voir annexe 3). Après 24 h de croissance nous avons ajouté au milieu 0.25 µCi/puit d’hypoxanthine tritiée (l’hypoxanthine est un précurseur de l’acide nucléique, donc un marqueur de croissance). L’incubation a été poursuivie jusqu’à la 48ème heure, puis les plaques on été congelées à -18°C. Elles ont été ensuite décongelées à température ambiante. Cette étape de congélation/décongélation permet une lyse des globules rouges ce qui entraîne la libération des parasites dans le milieu.

Détermination de la parasitémie

Une fois les plaques décongelées, les parasites ont été collectés sur un papier filtre au moyen d’un collecteur de cellules. Le papier-filtre est ensuite séché dans un four à chaleur sêche puis placé dans un sac spécial (Sample Bag, Wallac) contenant 5 ml de liquide de scintillation (BetaPlate Scint de Wallac). Le compteur Wallac Microbeta 1450 possède une interface de chargement robotisée, avec des cassettes spéciales. La radioactivité collectée sur chaque puits est alors mesurée, elle est proportionnelle à la croissance parasitaire. L’élimination des déchets radioactifs suit une procédure rigoureuse, avec l’utilisation de poubelles spéciales pour déchets radioactifs, balisées « radioactivité ».

Détermination des Concentrations Inhibitrices 50% (CI50)

La lecture de radioactivité permet de déterminer (par analyse de régression linéaire) la Concentration Inhibitrice 50 (CI50) qui est définie comme la concentration de produit nécessaire pour diminuer de 50% la parasitémie d’une culture mise en contact avec le produit à tester par rapport à la parasitémie d’une culture témoin de croissance (sans produit).
Chaque parasitémie (exprimée en %) rapportée au témoin de culture, en fonction des concentrations de produit, nous permet d’établir une relation graphique appelée « courbe effet-dose ». Grâce à cette courbe et par régression linéaire, nous pouvons déterminer la CI50 du produit testé.

Evaluation du potentiel antipaludique

Afin d’évaluer le potentiel antipaludique d’un composé, nous avons utilisé l’indice d’activité (IACQ) par rapport à la chloroquine (CQ) composé antipaludique de référence, selon la formule suivante : IACQ = CI50 de la CQ / CI50 de la drogue testée.
Lorsque l’index >1 le produit est plus actif que la CQ Lorsque l’index = 1 le produit est aussi actif que la CQ Lorsque l’index < 1 le produit est moins actif que la CQ

Détermination du stade érythrocytaire sensible

Tout au long de son développement érythrocytaire, Plasmodium ne possède pas la même sensibilité aux différents composés antipaludiques. Par exemple, il a été montré que la chloroquine agissait de façon spécifique sur les trophozoïtes entre la 24ème et la 36ème heure du cycle (Ter-Kuile et al., 1993; Zhang et al., 1986; Yayon et al., 1983) (Figure 8). Afin de mieux caractériser le potentiel antipaludique d’un composé, et d’accéder à une meilleure compréhension de son activité sur le parasite, il est donc intéressant de définir le stade de développement érythrocytaire sensible à ce composé.
La connaissance du stade le plus sensible de P. falciparum aux drogues est un outil dans la recherche de la meilleure combinaison de drogues pour diminuer les probabilités de développement de résistance par le parasite. Plasmodium falciparum se multiplie dans les hématies, selon des cycles de 48 heures, en passant par différents stades asexués sanguins, de la forme annulaire jeune au stade schizonte âgé.

Table des matières

Présentation du travail
I. Introduction
1. Le paludisme
2. Le bleu de méthylène
3. L’interaction hème/glutathion
II. Matériel et méthodes
1. Matériels et Réactifs
1.1. Le bleu de méthylène
1.2. Drogues antipaludiques
1.3. Matériels
1.4. Réactifs
2. Matériel biologique
2.1. Les souches de plasmodies
a. Plasmodium falciparum
b. Plasmodium de rongeur
2.2. La lignée cellulaire
2.3. Les animaux
a. Comportement éthique vis-à-vis de l’expérimentation animale
b. Les rongeurs
c. Le vecteur expérimental
3. Culture/élevage et maintenance
3.1. Plasmodium falciparum in vitro
a. Entretien de la culture de Plasmodium falciparum in vitro
3.2. Plasmodium de rongeur
a. Constitution des stocks de sang parasité et conservation
b. Infestation et suivi de l’infection
3.3. Les cellules
a. Culture et conservation de la lignée cellulaire BJAB
3.4. Anophèles stephensi
a. Elevage
b. Production de sporozoïtes de Plasmodium yoelii yoelii
4. Techniques particulières
4.1. Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vitro
a. Test de chimiosensibilité de Plasmodium falciparum
b. Détermination de la parasitémie
c. Détermination des Concentrations Inhibitrices 50% (CI50)
d. Evaluation du potentiel antipaludique
e. Détermination du stade érythrocytaire sensible
f. Synchronisation de la souche
g. Test de stade sensible in vitro
h. Etude de combinaison de drogues
4.2. Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vivo
a. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
b. Evaluation de l’activité sur stades hépatiques (inhibition de l’invasion)
c. Test de l’activité sur stages hépatiques
4.3. Technique d’étude de la cytotoxicité
a. Test de cytotoxicité
b. Détermination des Concentrations Toxiques 50% (CT50)
c. Détermination d’un index de sélectivité (IS)
4.4. Etude des mécanismes d’action
a. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
a.1. Préparation des produits à tester
a.2. Étude de l’interaction hème-glutathion
a.3. Essai de fixation à l’hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
a.4. Essai de fixation a l’hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
a.5. Essai de fixation à l’hémozoïne par spectrométrie de masses
III. Résultats
1. Évaluation in vitro de l’activité antipaludique sur les souches de Plasmodium falciparum
1.1. Détermination des profils de chimiosensibilité des souches F32, HB3, FcB1 et FcM29 de P. falciparum
1.2. Activité antipaludique du bleu de méthylène in vitro
2. Détermination in vitro du stade érythrocytaire de Plasmodium falciparum sensible aux composés
2.1. Détermination du stade sensible au bleu de méthylène in vitro
2.2. Détermination du stade sensible à la quinine in vitro
2.3. Détermination du stade sensible à la chloroquine in vitro
2.4. Détermination du stade sensible au artéméther in vitro
3. Etude in vitro de combinaison entre la bleu de méthylène et divers composés antipaludiques
3.1. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’amodiaquine
3.2. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’artéméther
3.3. Combinaison entre le bleu de méthylène et l’atovaquone
3.4. Combinaison entre le bleu de méthylène et la chloroquine
3.5. Combinaison entre le bleu de méthylène et la doxycycline
3.6. Combinaison entre le bleu de méthylène et la méfloquine
3.7. Combinaison entre le bleu de méthylène et la primaquine
3.8. Combinaison entre le bleu de méthylène et la pyriméthamine
3.9. Combinaison entre le bleu de méthylène et la quinine
4. Technique d’étude de l’activité antipaludique in vivo
4.1. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
4.2. Evaluation de l’activité sur stages hépatiques (inhibition de l’invasion)
5. Technique d’étude de la cytotoxicité
5.1. Essais préliminaires
a. Optimisation de la concentration cellulaire pour les essais
b. Détermination d’un contrôle de cytotoxicité
5.2. Test de cytotoxicité
5.3. Index de sélectivité (IS)
6. Etude des mécanismes d’action
6.1. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
a. Essaies préliminaires
a.1. Stabilité de bleu de méthylène
a.2. Stabilité de Glutathion réduit
a.3. Stabilité de l’hème
a.4. Stabilité de l’o-phthalaldehyde
a.5. Temps d’incubation
a.6. Température d’incubation
a.7. Effet de solvant (méthanol)
b. Test sur l’interaction hème/glutathion
b.1. Amodiaquine
b.2. Artemether
b.3. Atovaquone
b.4. Bleu de méthylène
b.5. Chloroquine
b.6. Doxycycline
b.7. Mefloquine
b.8. Primaquine
b.9. Pyrimethamine
b.10. Quinine
6.2. Les interactions physique chimiques drogue-hème
a. Essai de fixation à l’hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
b. Essai de fixation a hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
c. Essai de fixation à hémozoïne par spectrométrie de masses
IV. Discussion et perspectives
Chapitre 1 – Évaluation in vitro de l’activité antipaludique sur les souches de Plasmodium falciparum
1. Détermination des profils de chimiosensibilité des souches F32, HB3, FcB1 et FcM29 De P. falciparum
2. Détermination in vitro du stade érythrocytaire de Plasmodium falciparum sensible aux composés
2.1. Détermination du stade sensible au bleu de méthylène in vitro
2.2. Détermination du stade sensible à la quinine in vitro
2.3. Détermination du stade sensible à la chloroquine in vitro
2.4. Détermination du stade sensible au artéméther in vitro
3. Etude in vitro de la combinaison entre bleu de méthylène et divers composés antipaludiques
3.1. Interactions générales
Chapitre 2 – Techniques d’étude de l’activité antipaludique in vivo
1. Test suppressif de 4 jours ou test de Peters
2. Evaluation de l’activité sur stades hépatiques (inhibition de l’invasion)
Chapitre 3 – Technique d’étude de la cytotoxicité
1. Essais préliminaires
2. Test de cytotoxicité
Chapitre 4 – Etude des mécanismes d’action
1. Modèle pharmacologique sur l’interaction hème/glutathion
1.1. Essaies préliminaires
a. Stabilité des composés
a.1. Bleu de méthylène
a.2. Glutathion réduit
a.3, L’hème
a.4. L’o-phthalaldehyde
b. Temps d’incubation
c. Température d’incubation
d. Effet de solvant (méthanol)
1.2. Test sur l’interaction hème/glutathion
a. Amodiaquine
b. Artemether
c. Atovaquone
d. Bleu de méthylène
e. Chloroquine
f. Doxycycline
g. Mefloquine
h. Primaquine
i. Pyrimethamine
j. Quinine
1.3. Résultats généraux d’activité des drogues
1.4. Combinaisons des drogues
a. Combinaison BM+ATO
b. Combinaison BM+CQ
c. Combinaison BM+Q
2. Les interactions physique chimiques drogue-hème
2.1. Essai de fixation à hémozoïne par espectrofotometrie UV VIS
2.2. Essai de fixation à hémozoïne par chromatographie sur couches minces CCM
2.3. Essai de fixation à hémozoïne par spectrométrie de masses
V. Résumé – conclusion
Bibliographie

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