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Évaluation fonctionnelle des gènes candidats de la susceptibilité au DT1
L’étude de gènes candidats a été longtemps la principale méthode pour l’identification des gènes de susceptibilité au diabète de type 1, ce qui a permis la découverte de HLA, INS, PTPN22, CTLA4 et IL2.
Toutefois, bon nombre d’études qui reposaient sur cette stratégie ont été largement sous-estimés, en raison des limites de l’information génomique et du génotypique, ainsi que la taille limitée des cohortes disponibles.
Depuis, cette situation a évolué, avec les grands progrès technologiques et méthodologiques survenus au cours des dernières années, et la disponibilité de plus grandes cohortes ont abouti à la faisabilité de balayage du génome en entier (genome-wide association scans ″GWAs″), qui disposent désormais de la puissance d’études d’associations sans hypothèse. Bien que ces études conduisent à l’identification d’un nombre croissant de SNP (single-nucleotide polymorphisms) associés au DT1, ceux-ci se trouvent souvent à une certaine distance du gène responsable de causalité; la variante comme une conséquence des régions prolongées de déséquilibre de liaison sur le génome.
En revanche, les gènes candidats ont été choisis en fonction de leurs rôles connus ou putatifs dans la fonction immunitaire et auto-immunitaire où la fonction cellulaire des cellules β et les résultats d’association positive fourni une preuve directe du mécanisme de la maladie. Par conséquent, l’examen des gènes candidats, avec la charge d’explorations antérieures de ces gènes, est apparue comme une source prometteuse pour identifier et/ou confirmer les gènes associés au DT1 ou de nouveaux SNP associés à des gènes connus, en utilisant la meilleure technologie disponible et la meilleure information génomique, ainsi que la grande taille des cohortes. Le progrès a été accompli en étudiant les facteurs génétiques impliqués dans le développement du diabète de type 1 (D T1) pendant les dernières années tandis que La cartographie de déséquilibre de liaison (DL) a été utile à la fois à la confirmation et la cartographie fine des intervalles de sensibilité, Ainsi que l’identification de mutations
étiologiques et l’identification des gènes responsables de maladies spécifiques définies et limitées à des gènes candidats connus.
Le risque global pour les diabétiques de type 1 de la molécule HLA DR et DQ (IDDM1) est déterminé par des combinaisons des allèles polymorphes. Des études fonctionnelles indiquent que cette susceptibilité, est liée au HLA DR-DQ protecteur et présente des peptides non –recouvrant.
Bien que la preuve de liens constants ait été signalée pour l’intervalle de susceptibilité d’IDDM2, IDDM5 et IDDM12, la preuve pour la plupart des autres intervalles varie dans différents ensembles de données.
Le nombre variable des répétitions en tandem du VNTR à l’extrémité 5′ du gène de l’insuline règle l’expression de l’insuline au niveau du thymus, Un polymorphisme dans l’extrémité 5’ flanquant la région du gène de l’insuline (INS) sur le chromosome 11p15.5 a été considéré pendant deux décennies c’est le SNP -23 Hph1. Il se compose d’un nombre variable de répétitions en tandem (VNTR), également dénommé un polymorphisme de minisatellite, situé dans la 365ème pb en amont de l’INS, en dehors des séquences codantes [38] il ya répétition en tandem d’un oligonucléotide de 14 à 15 pb qui est lié à une séquence consensus ACAGGGGTGTGGGG.
Le nombre de répétitions montre une distribution bimodale avec des allèles regroupant soit à 30-60 répétitions (classe I) ou 120-170 répètitions (classe III), avec des tailles intermédiaires (classe II) très rares. L’homozygotie pour l’allèle de la classe I confère un risque relatif de 2-3 contre la présence d’au moins un allèle de classe III. Inversement, les allèles de classe III, moins fréquents ont un effet protecteur dominant [Knerr I.; Wolf J. et al 2005]. Le polymorphisme des INS-VNTR n’affecte pas la séquence peptidique d’insuline. Par conséquent, et compte tenu de sa situation en amont du promoteur de l’INS, ses effets biologiques sont les plus susceptibles aux différences alléliques dans les niveaux de transcription d’INS.
Les études sur IDDM5 ont mené à la découverte d’un polymorphisme 163 A G (substitution méthionine-valine au codon 55 M55V) dans le gène SUMO4, ce qui s’est Avéré être associé au DT1 chez les patients d’origine asiatique. Fonctionnellement le SUMO4 conjugué à IkB alpha règule négativement la voie tanscriptionnelle. La substitution de M55V réduit l’activité de simulation de la variante V55, qui a pour conséquence une activité dépendante plus élevée de la transcription de NFkB [D. Kantárová, M. Buc 2006]. Les polymorphismes du gène CTLA4 (IDDM12) codant une molécule de régulation dans la réponse immunitaire du DT1 et des maladies thyroïdiennes auto-immunes (ATD). Dans des désordres complexes, comme démontré par des changements quantitatifs des gènes candidats contribuent à la destruction auto-immune des tissus.
D’ailleurs, on a identifié deux facteurs de transcription dans le cas des mutations, qui sont responsables de maladies auto-immunes graves et qui nous ont mené à une meilleure compréhension de la tolérance des cellules T [Mein Ca et al 1998].le CTLA-4 est considéré comme le troisième gène de susceptibilité du DT1 et a été associé à des niveaux élevés de CTLA4 soluble et dans la régulation des cellules LT.
En Algérie, dans l’ouest à Oran [Benhamamouch et al 1992] ont montré que l’observation des fréquences haplotypiques et alléliques de HLA-DQA1, DQB1et DRB1 et leurs associations au diabète étaient, à part quelques différences mineures, comparables à ceux observés en France. Les études des gènes candidats susceptibles ont également identifié le gène de l’insuline sur le chromosome 11 comme deuxième facteur génétique de susceptibilité, contribuant à 10% de susceptibilité génétique au DT1; des formes plus courtes d’une (VNTR) dans le promoteur de l’insuline sont associées à la susceptibilité à la maladie, tandis que de plus longues formes sont associées à la protection. Pendant la dernière décennie, l’analyse du génome en entier a montré qu’il existe au moins 15 autres locus liés au DT1, dont 2 gènes intimement associés avec l’activation de cellule-T ont été identifiés récemment.
Gène de l’insuline : le locus IDDM2
En 1974, les scientifiques ont découvert que des variantes particulières des gènes du CMH étaient fortement associées au diabète de type 1 ; les personnes qui héritent des variantes DR3 et DR4 sont exposées à un risque de développer un diabète 10 à 20 fois supérieur par rapport à d’autres personnes, par contre, ceux qui héritent de la variante DR2 bénéficient d’une forte protection [Merriman 2004]. La contribution génétique la plus importante au risque de diabète de type 1 est codée dans le complexe HLA sur le chromosome 6 sur le bras court [Concannon P. 1998].
Mais de nombreux facteurs montrent que le caractère génétique du diabète de type 1 n’est pas uniquement lié à ce système. En 1984, une association génétique entre le diabète de type 1 et une région polymorphe localisée à l’extrémité 5’du gène de l’insuline a été rapportée pour la première fois dans une étude cas-témoins [Bell et al 1984]. Ainsi, la région du gène de l’insuline (INS) localisé au niveau du chromosome 11 sur le bras court est probablement la deuxième plus importante contribution génétique à la variation de la susceptibilité au diabète de type 1 ; elle contribue pour 10% au risque génétique du diabète [Bain et al 1992] ; le gène de l’insuline fut admis comme deuxième gène candidat avant même l’avènement des approches par l’étude systématique du génome [Lucassen et al 1993]. La région codante pour l’insuline est située plus précisément sur le chromosome 11p15.5 et les premières descriptions de polymorphismes l’ont initialement rattachée au diabète non insulinodépendant.
La variation de cette région comprend en fait 2 types de polymorphismes ; d’une part, les travaux de Lucassen et Julier (1993) ont montré l’existence de mutations ponctuelles en amont et dans le gène de l’insuline, dont certaines sont fréquentes chez les sujets diabétiques de type 1; l’autre variation est l’existence de mini-satellites formés d’unités répétitives de 14 paires de bases, en nombre plus ou moins important, ce sont des séquences répétées en tandem (VNTR) avec le consensus ACAGGGGTSYGGGG [Lucassen et al 1993].
Le VNTR « insulin/IGF-2 » (INS-IGF2 VNTR) est situé à l’extrémité 5’, à environ 600 pb du site de début de la transcription de l’INS ; il représente un marqueur VNTR, dont les allèles sont divisés en 3 classes principales selon leur taille : Court (classe I), intermédiaire (classe II), et long (classe III), présentant respectivement 40, 85 et 157 unités en moyenne [86]. Dans les populations caucasiennes, ce VNTR est représenté par 2 principales classes, les allèles courts de la classe I ont entre 26 et 63 unités de répétition, et les allèles de la classe III ont entre 141 et 209 unités de répétition. Les allèles intermédiaires de la classe II sont rares dans les populations européennes blanches [Stead et al 2000].
Les différentes études épidémiologiques ont montré que les allèles de la classe I au INS VNTR confèrent une susceptibilité au diabète de type 1, par la présence plus fréquente de cette classe chez les diabétiques [Bain et al 1992]. Des études sur les polymorphismes des régions flanquantes rapportaient que cette association était limitée aux marqueurs compris dans un intervalle de 19 kb [Owerbach et Gabbay 1994]. La découverte d’une association entre les allèles de la classe I du VNTR de l’insuline et le DT1 a suggéré qu’un gène (ou plusieurs gènes) dans la région ait contribué à la susceptibilité de la maladie, mais puisque le VNTR n’a pas affecté la région codante d’un gène connu, des polymorphismes additionnels dans et autour du gène de l’insuline et des gènes flanqués, à savoir le facteur de croissance insuline-like (IGF2) et la tyrosine hydroxylase (TH), ont été identifiés [Lucassen et al 1993]. Ces sites polymorphes ont montré des degrés similaires d’association avec le diabète de type 1 chez les patients et les témoins [Julier C, Lucassen A, Villedieu et al 1994].
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Table des matières
INTRODUCTION
Objectif
Chapitre I -Synthèse Bibliographique
1.1- Aspect clinique
1.1.1-Anatomie et physiologie du pancréas
1.1.2- Anatomie pathologique : l’insulite
1.1.3- Classification étiologique du diabète de type 1 (DT1)
a) diabète de type 1 auto-immun
b) diabète de type 1 idiopathique
1.1.4- Symptômes
1.1.5- Diagnostic et évolution
1.1.6- Traitement
1.1.6.1-Traitement par insuline
1.1.6. 2- Thérapie cellulaire
1.1.6.3- Immunothérapie
1.1.6.4- Greffe du pancréas
1.1.7- Complications
1.1.8- Prévention et conseils
1.2-Aspect génétique
1.2.1-Évaluation fonctionnelle des gènes candidats de la susceptibilité au DT1
1.2.2- Locus de susceptibilité héritée pour le DT1
1.2.3- Gène de l’insuline : le locus IDDM2 INS-VNTR
1.2.3.1- Mécanisme biologique de l’action du locus IDDM2
1.2.4- Gène CTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)
1.2.4.1- Rôle de la molécule CTLA4 Processus de présentation de l’antigène aux cellules T par les molécules HLA classe II
1.2.4.2-les polymorphismes du CTLA-4 dans le DT1
Résumé de la signification génétique et fonctionnelle des SNP dans le gène CTLA4
1.3- Aspects immunologiques du DT1
1.3.1-Mécanisme de la réaction auto-immune dans le DT1
Pathogénie de la destruction des îlots de Langerhans
1.3.2 – les auto-anticorps dans la prédiction du DT1
1.3.3 -Marqueurs immunologiques du DT1
1.3.3.1- Anticorps anti-Cytoplasme des Ilôts (ICA)
1.3.3.2- Auto-anticorps anti-insuline (IAA)
1.3.3.3- Auto-anticorps anti-acide-glutamique decarboxylase (GADA)
1.4-Facteurs de risques environnementaux du DT1
1.4.1-L’environnement prénatal
1.4.2- Le facteur de risque alimentaire
1.4.2.1- L’allaitement maternel
1.4.2.2- Le lait de vache
1.4.2.3- La vitamine D
1.4.3- Les infections
1.4.3.1- Les infections virales
1.4.4 – Les toxines
1.4.5-Les variations saisonnières du DT1
1.4.6-Les autres causes
Chapitre 2 -MATERIEL ET METHODES
2.1 -Echantillonnage
2.2 – Analyses des échantillons
2. 3- Prélèvement du sang
2. 4- Mesure de l’indice de masse corporelle (IMC)
2.5- Extraction de l’ADN à partir du sang total
2.5.1- Méthode d’extraction au NaCl
2.5.2- Méthode d’extraction au phénol-chloroforme
2.6- Contrôle de la qualité de l’ADN
2.6.1- Pureté de l’ADN
2.7- La PCR (Polymérase Chain Reaction)
2.7.1- Principe
2.7.2- Échantillon
2.7.3- Matériels nécessaires pour la PCR
a.Biologique
b.Non biologique
2.7.4- Protocole de l’amplification
2.7.5- Procédure de la PCR
2.7.5- Avant la réalisation
Programme PCR pour le SNP +49 du gène CTLA4
Programme PCR pour le SNP -23 Hph1 du gène INS-VNTR
Programme PCR pour le gène HLA-DMB
2.8- Electrophorèses sur gel d’agarose
2.8.1- Principe
2.8.2- Procédure de l’électrophorèse sur gel d’agarose
2.8.2.1-Préparation du gel d’agarose
2.8.2.2-Dépôt des produits d’amplification. Observation du gel sous UV
2.8.4-Avertissement
Chapitre 3 -RESULTATS ET DISCUSSION
3. 1-Analyses statistiques
3.1.1- Effet du sexe dans le déclenchement du DT1
Distribution des diabétiques de type 1 et des témoins en fonction du sexe
Nombre et fréquences de nos échantillons
3.1.2- Effet de la consanguinité sur le déclenchement du DT1
Distribution des individus selon la consanguinité chez les DT1 et les témoins
Fréquence de la consanguinité
3.1.3 Effet de l’IMC sur l’apparition du DT1
Distribution de l’IMC dans notre échantillon
Moyenne générale de la distribution de l’IMC
3.2-Analyse moléculaire
3.2.1 – Extraction de l’ADN
Electrophorèse après extraction au phénol
3.2.2- Concentration et pureté de l’ADN
3.2.3- La PCR
Les données génotypiques
Electrophorèse après amplification du SNP -23Hph1 du gène INS-VNTR à Tm 55°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54,5°C
Electrophorèse après amplification du gène INS-VNTR à Tm 53°C
Electrophorèse après amplification du gène HLA-DMB à Tm 62°C
CONCLUSION
