Soutenance mémoire
VARIABILITE GENETIQUE DES VIH
Les VIH présentent une très grande variabilité génétique [31]qui résulte des erreurs de copies effectuées par la transcriptase inverse lors de la réplication du virus. Il a été montré qu’il survient environ une erreur pour 10 000 bases par cycle de réplication. Ce taux de mutation n’est pas différent de celui rapporté pour d’autres virus à ARN. La particularité du VIH est la dynamique de réplication virale, puisqu’on estime à environ 10 milliards le nombre de nouveaux virus produits chaque jour par une personne infectée.
Cette variabilité confère au virus un grand pouvoir d’adaptation par rapport à son environnement, c’est-à-dire son hôte. Ce pouvoir d’adaptation va lui permettre d’échapper en particulier aux réponses immunes ou aux thérapeutiques antirétrovirales par sélection des mutants capables de résister à ces processus d’inhibition dela réplication virale.
La variabilité n’est pas le même la même tout au long du génome : gaget pol sont relativement conservés alors qu’env est très variable.
L’analyse des séquences génétiques a permis d’identifier trois groupes de VIH-1 : le groupe M (majeur) d’une part, et les groupes O (Outlier) et N (nonM, non-O).A l’intérieur du groupe M, neuf sous-types de A à D, de F à H, J etK ainsi que des formes recombinantes (CRF : Circulating Recombiant Form), ces formes recombinantes résultant d’échange de matériel génétique entre lessous-types.
La Phase asymptomatique
La séroconversion commence avec l’apparition des anticorps anti-VIH dans la circulation, au plus tôt 3 semaines (fig.6) et au plus tard 7 mois après la contamination; le délai moyen d’apparition est de 6 à 8 semaines. Ces anticorps augmentent rapidement dans le sang alors que la virémie va chuter de façon très importante. Le virus ne se multiplie plus que dans les organes lymphoïdes et la virémie reste basse; cette phase va durer en moyenne 8 ans. Cette multiplication virale est inhibée par l’action des lymphocytes CD8+ (Cytotoxique)qui détruisent les cellules infectées et par les anticorps qui vont limiter la fixation sur les cellules cibles. Cette phase est cliniquement muette, cependant l’altération continue des lymphocytes CD4+ (T-helper ou mémoires) va aboutir progressivement à une rupture de l’équilibrequi s’est établi entreréplication intra-ganglionnaire du virus et la réponse immunitaire. On passealors à la phase de SIDA maladie.
Le Syndrome de l’immunodéficience acquise ou SIDA
Lorsque le nombre de lymphocytes CD4+, cellules à rôle central dansl’immunité, chute à moins de 200 cellules par mm de sang (la normale est de1000/mm), les défenses de l’organisme nepeuvent plus être assurées et la maladie commence.
La virémie augmente de façon importante et devient facilement détectable; des infections opportunistes caractéristiques de l’immunodépression s’installent.
On est alors au stade de SIDA qui peut se traduire également par des manifestations nerveuses dues à l’atteinte du système nerveux central ou par un sarcome de Kaposi caractérisépar des lésions cutanées de couleur brun violet, infiltrées dans le derme.
DIAGNOSTIC : PRINCIPE ET METHODES
Prélèvements utilisés dans le diagnostic sérologique
Prélèvements de sang
Le diagnostic de l’infection à VIH s’effectue, en général, sur un prélèvement du sang effectué au pli du coude. Cependant cette technique classique de prélèvement est relativement traumatisantepour le patient et nécessite l’utilisant de matériel coûteux (aiguilles et tubes). De plus, il doit être conservé dans des conditions particulières (au réfrigérateur) ; prélèvement consiste à recueillir le sang dans un tube EDTA de 10 ml étiqueté avec un numéro de code.
Pour palier ces inconvénients, des techniques de prélèvement non invasives sont de plus en plus utilisées.
Prélèvements alternatifs
Prélèvement salivaire
La salive est un liquide translucide, déversé dans la cavité buccale par les glandes salivaires.
Le liquide salivaire contient des anticorpsdétestables par différentes techniques.
L’utilisation de la salive dans le diagnostic de l’infection à VIH est limitée par sa faible concentration en anticorps. Cependant, il existe des trousses comportant un dispositif de prélèvement permettant d’obtenir un exsudat salivaire plus concentré en anticorps plus élevé que la salive. Ces trousses incluent en plus un test d’Elisa et un Western blot permettant le dépistage desanticorps anti-VIH à partirde l’exsudat salivaire [20].
Prélèvement urinaire
Les urines ont également été préconisées comme prélèvement alternatif. Cependant même si la présence d’anticorps a été démontrée avec une détection possible même avant la séroconversion [5, 52, 74,75], sa faible concentration a très vite limité l’utilisation des urines dans le diagnostic de l’infection à VIH.
Prélèvement de gouttes de sang séchées sur papier filtre
Le concept de base du prélèvement de gouttes de sang sur papier filtre a été élaboré par GUTHRIE et SUSIE vers le début des années 1960, afin de mener de larges études épidémiologiques concernant des pathologies métaboliques sur des populations de nourrissons en Scotland. A cette époque, l’utilisation de faibles quantités de sang (5-10μl) n’a pas permis
à la technique d’avoir une spécificité et une sensibilité appréciable, ce qui a limité d’une façon notable son utilisation.
Le progrès technologique et les nouvelles recherches menant vers la production d’anticorps monoclonaux, l’élaboration de protéines synthétiques etl’introduction de la PCR (polymérase chaîne réaction) ont permis de surmonterles problèmes liés au volume de l’échantillon permettant ainsi d’améliorer le potentiel d’une telle technique, technique qui sera ensuite utilisée dans plusieurs domaines à savoir : la biochimie, le génie génétique et la microbiologie.
Principe et réalisation de la technique
La technique de base consiste en un recueil de sang capillaire prélevé à partir du bout du doigt ou du talon (Figure 7).Les gouttes de sang obtenues sont déposées sur des cercles pré-imprimés sur un papier filtrede haute qualité, de type GUTHRIE(Figure8).
Les cercles renfermant les gouttes de sang de la cartede GUTHRIE peuvent être séchés à l’air libre, recouverts d’un papier glacé et conservés dans des sachets en plastique renfermant un déssicant qui absorbe l’humidité résiduelle dans lessachets. Les échantillons prélevés peuventêtre immédiatement testés, stockés àtempérature ambiante ou bien congelés à –20°C.
Avantages
Réduction des risques
Le prélèvement sur papier filtre qui est un prélèvement capillaire permet d’éviter les problèmes liés à la ponction veineuse et de réduire les risques infectieux.
La faible quantité de sang prélevée est très adaptée à un usage pédiatrique et le matériel de prélèvement basique permet de remplacer l’utilisation des seringues ou d’autres dispositifs lourds et coûteux.
On note également une diminution nette des risques d’endommagement des échantillons au cours du transport, car ces échantillons ne présentent pas une grande fragilité physique et ainsi ne requièrent aucune condition particulière de transport.
Ce type de prélèvement permet une diminution des risques de contamination du personnel du laboratoire.
Avantages économiques
Le prélèvement sur papier est également peu onéreux, dufait du prix très accessible du matériel utilisé (ne nécessitant pas de centrifugation du sang nitubes de collection) et de la simplicité des procédés de transport.
Ces avantages économiques font de cettetechnique, un procédé de choix dans les pays à budget sanitaire limité.
Avantages épidémiologiques
Méthode non invasive, le prélèvement de gouttes de sang sur papier filtre permet d’exécuter les enquêtes épidémiologiques à grande échelle telles que les sérosuveillance du VIH dans la population générale et les enquêtes démographiques et de santé (qui incluent maintenant un module VIH) d’une manière très rapide, et plus acceptée par les populations (EDS).
Utilité dans le diagnostic d’une infection à VIH
La technique de prélèvement de gouttes de sang sur papier filtre présente une sensibilité et une spécificité permettant d’avoir des résultats aussi fiables que les autres méthodes habituellement utilisées. Cette concordance de résultats est estimée entre 99% et 100% [60].
Le prélèvement de gouttes de sang sur papier filtre présente également l’avantage d’être stable, pouvant être conservé pendant longtemps dans desconditions appropriées.
Méthodes de diagnostic
Le diagnostic au laboratoire a joué un rôle primordial dans l’identification précoce de la gravité et extension de pandémie VIH/SIDA. Ce diagnostic est basé sur la mise en évidence de différents marqueurs de l’infection.
Cinétique des marqueurs virologiques au cours de l’infection à VIH
Une bonne connaissance de la cinétique des marqueurs virologiques est indispensable pour l’interprétation des tests VIH (figure 9).
Après la contamination, l’ARN viral est détectable dès le 10-12 e jour ; De même une fraction du virus, l’antigène p24 est détectable vers le 12-14 e jour.
Les premiers anticorps sont délectables vers le 21 e jour.
ELISA indirect
Les anticorps éventuellement présents dans l’échantillon à tester se fixent dans un premier temps sur l’antigène lui-même fixé sur un support solide inerte.
Cette fixation est révélée par une anti-globuline humaine marquée par une enzyme, en général la peroxydase. L’intensité de la réaction colorée est
approximativement proportionnelle à la quantité d’anticorps présents dansl’échantillon à tester.
Ces ELISA indirects ont une bonne sensibilité et une spécificité variable.
Pour le diagnostic du VIH, ce type de test a été abandonné car la révélation à l’aide d’une anti-IgG marquée ne permet pas de détecter les anti-VIH des autres classes d’immunoglobulines. Cela donnait au test une sensibilité insuffisante
ELISA de compétition
Le principe repose sur la compétition pour les antigènes absorbés sur la surface solide entre les anticorps anti-VIH du patient et des anticorps anti-VIH marqués contenus dans le conjugué ajouté en même temps que l’échantillon à tester. L’intensité de la réaction est inversement proportionnelle au titre des anticorps.
Ces ELISA par compétition sont spécifiques ; cependant, l’ELISA par compétition n’est plus utilisé pour le diagnostic VIH car l’interférence au niveau de la réaction des autres immunoglobulines sériques, altèrerait la qualité du résultat.
ELISA sandwich
Cette méthode est utilisée aussi bien pour la mise en évidence des anticorps que des antigènes. Si on recherche un antigène sérique, p24 par exemple, il sera pris en sandwich entre l’anticorps anti-p24 sensibilisant la phase solide et l’anticorps anti-p24 conjugué à l’enzyme. Pour la recherche de l’anti-VIH, on sensibilise la phase solide avec l’antigène du virus qui va capter l’anti-VIH sérique. La révélation se fait avec de l’antigène VIH conjugué à l’enzyme. Cette réaction se déroule en trois temps : incubation du sérum et lavage ; incubation avec le conjugué et lavage ; addition du substrat de l’enzyme.
Après la réaction enzyme-substrat, il sedéveloppe une réaction colorée dont l’intensité est proportionnelleà la quantité d’anticorps (ou d’antigènes selon le cas).
Les tests de recherche d’anticorps par cette méthode ont été considérablement améliorés. Ils atteignent une sensibilité voisine de 100 % et une spécificité quidépasse 95 %.
Les tests combinés de détection des antigènes/anticorps
Les cupules de polystyrène sont sensibilisées à l’aide d’antigènes du VIH-1 et du VIH-2 ainsi que d’un pool d’anticorps anti- p24 et anti- p26.
Le conjugué est composé des mêmes antigènes et anticorps marqués. Ce test réalise ainsi un sandwich qui va détecterà la fois l’antigène et l’anticorps.
La positivité de la plupart des ELISA se traduit par l’apparition d’une coloration dont l’intensité est mesurée au spectrophotomètre. Ces techniques ELISA peuvent être automatisées.
Composition antigénique des tests de détection des anticorps
Du fait de la grande variabilité des souches virales, il fautêtre très attentif à lacomposition antigénique des tests utilisés. Actuellement, on exige d’un test qu’il soit en mesure de détecter les anticorpsanti-VIH-1 du groupe M, O ainsi que les anticorps anti-VIH-2. Normalement, les tests actuellement disponibles répondent à cette exigence.
Les tests rapides
On les définit comme des tests permettant de détecter les anticorps anti-VIH en moins de 30 minutes. D’utilisation facile, ils sont réalisés avec les mêmes antigènes que ceux utilisés pour produire les tests ELISA.
Il y a plusieurs types de tests rapides :
• Les systèmes de filtration :ils ont l’inconvénient de nécessiter plusieurs étapes.
• Les tests d’agglutination:sont d’utilisation facile mais ils nécessitent la lecture par une personne expérimentée pour l’obtention d’une spécificité et d’une sensibilité élevée.
• Tests à flux capillaire basés sur l’immunochromatographie:ce sont des bandelettes d’utilisation facile dont la lecture est rapide. Elle se fait par rapport à une bande témoin qui, elle aussi, doit se colorer pour que le résultat soit acceptable.
Les tests rapides de 2 e génération, actuellement disponibles, nécessitent peu ou pas d’équipement.
On peut les réaliser à partir du plasma, du sérum et même à partir du sang total prélevé par piqûre au doigt.
La spécificité et la sensibilité sont similaires à celles de l’ELISA, ils détectent les mêmes types d’anticorps (anti VIH-1 M et O, anti- VIH-2) avec des résultats pouvant être obtenus en 2 à 5 minutes.
Ces tests rapides permettent la mise en œuvre des stratégies alternatives OMS de diagnostic de l’infection à VIH (OMS).
Tests de confirmation
L’existence de résultats de recherche d’anticorps anti-VIH faussement positifs et les conséquences qui en découlaient ontrendu nécessaire le développement de tests complémentaires plus spécifiques. Plusieurs tests peuvent être utilisés : le Western Blot, l’immunoanalyse en ligne, l’immunofluorescence indirecte, et
La radio-immunoprécipitation. d1- Western blot(fig.13 et 14)
Principe
Le western blot est basé sur une migration électrophorétique de lysat viral sur gel de polyacrylamide dénaturé afinde séparer les protéines virales en fonction de leur poids moléculaire.
Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose coupée en bande sur des migrants électrophorétique et incubée avec les échantillons de sérum à tester. Les complexes Ag-Ac sont visualisés à l’aide d’un anti-IgG humain couplé à une enzyme. Une bande colorée apparaît pour chaque protéine virale sur laquelle un anticorps spécifique s’est fixé permettant l’identification des anticorps spécifiques liés à leurs protéines correspondantes.
La procédure du Western blot est très technique et demande un personnel bien formé.
Immunoanalyse en ligne ou LIA (Line ImmunoAnalyse Assay) :
Des protéines recombinantes et des peptides synthétiques du VIIH-1 et du VIH-2 sont déposées sous forme de ligne sur des membranes fixées sur des supports plastiques( Fig.15).
Manipulée comme le western blot, l’Immunoanalyse en ligne constitue une alternative moins onéreuse, permettant de confirmer une infection à VIH ou de différencier les deux virus.
Autres tests pour le diagnostic biologique
La recherche de l’antigène
La protéine p 24 est la protéinemajeure de la capside du VIH.
Dans le cas de primo-infection symptomatique, la détection de l’antigène p 24 peut être intéressante car elle est positive pendant la phase sérologiquement muette (fig. 9).
Cet examen, autrefois considéré comme un marqueur de laréplication virale, est devenu à ce stade, inutile et déconseillé.
L’isolement du virus en culture
L’isolement du virus est une technique longue et difficile, qui n’est pas utilisée en routine.
Elle est réservée au laboratoire de recherche.
L’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)
La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) est une méthode de biologie moléculaire qui permet d’amplifier in vitro une région spécifique d’un acide nucléique donné afin d’en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Elle utilisée pour la détection du matérielgénétique : Recherche ou dosage de l’ARN viral plasmatique (ou charge virale) ou l’ADN proviral cellulaire. C’est la technique qui est utilisée dansle diagnostic d’une infection à VIH chez le nouveau-né de mère infectée.
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Table des matières
INTRODUCTION
REVUE DE LITTERATURE : Les virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le diagnostic sérologique des infections à VIH
1. EPIDEMIOLOGIE
1.1. Modes de transmission
1.1.1. Transmission par voie sexuelle
1.1.2. Transmission par voie sanguine
1.1.3. Transmission materno-fœtale ou transmission verticale
1.2. Epidémiologie : Evolution et progrès
2. TAXONOMIE ET STRUCTURE DU VIRUS
a)-Les gènes classiques
b)-Les gènes supplémentaires
3- VARIABILITE GENETIQUE DES VIH
4. HISTOIRE NATURELLE DE L’INFECTION A VIH
4.1. La primo-infection
4.2. La Phase asymptomatique
4.3. Le Syndrome de l’immunodéficience acquise ou SIDA
5- DIAGNOSTIC : PRINCIPE ET METHODES
5.1. Prélèvements utilisés dans le diagnostic sérologique
5.1.1. Prélèvements desang
5.1.2. Prélèvements alternatifs
a- Prélèvement salivaire
b- Prélèvement urinaire
c- Prélèvement de gouttes de sang séchées sur papier filtre
9 Principe et réalisation de la technique
9 Avantages
– Réduction des risques
– Avantages économiques
– Avantages épidémiologiques
– Utilité dans le diagnostic d’uneinfection à VIH
5.2. Méthodes de diagnostic
5.2.1. Cinétique des marqueurs virologiques au cours de l’infection à VIH
5.2.2. Méthodes de diagnostic
5.2.2.1. Diagnostic sérologique
a -ELISA ou Test immuno-enzymatique
a1- ELISA indirect
a2 – ELISA de compétition
a3 – ELISA sandwich
a4-Test d’ immunocapture des anticorps
a5- Les tests combinés de détection des antigènes/anticorps
b- Composition antigénique des tests de détection des anticorps
c- Les tests rapides
d- Tests de confirmation
d1- Western blot
– Principe
– Critères d’interprétation du Western Blot
d2- Immunoanalyse en ligne ou LIA (Line Immunoanalyse Assay)
e Caractéristiques des tests et Stratégies de diagnostic sérologique
5.2.2. Autres tests pour le diagnostic biologique
a- La recherche de l’antigène p 24
b- L’isolement du virus en culture
c- L’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)
Article III. Evaluation d’un test de dépistage de l’infection à VIH de quatrième génération : le testELISA AxSYM Ab/Ag Combo (Abbott Laboratories)
1. CONTEXTE DE L’ETUDE
2. OBJECTIFS DE L’ETUDE
2.1. Objectif général
2.2. Objectifs spécifiques
3. CADRE DE L’ETUDE
4. MATERIEL UTILISE DANS L’ETUDE
5. METHODOLOGIE
5.1. Origine des échantillons testés
5.2. Détermination du statut sérologique VIH des échantillons
5.3. Principes et mode opératoire des tests
5.2.1. Tests classiques utilisés dansle laboratoire de référence
5.2.1.1. Genscreen HIV-1/2 version 2 (Biorad)
5.2.1.2. Murex HIV-1.2.O (Laboratoires Abbott)
5.2.1.3. HIV Blot 2.2 (Laboratoires Abbott)
5.2.2. AxSYM Ag/Ac VIH combo ®(Laboratoires Abbott)
5.2.2. principe du test
5.2.2.2- Analyseur ou automate AxSYM (Laboratoires Abbott)
a) Présentation générale
a1) Description de l’appareil
a2) Usages et fonctions du système
b) Utilisation de l’appareil
b1) démarrage de l’appareil
b2) maintenance journalière
b3) calibration
c) Matériel nécessaire
6. RESULTATS
6.1. Statuts sérologiques des échantillons testés
6.2. Calcul des performances des ELISA
6.2.1. Performances des ELISA obtenus avec les plasmas
a) Avec le Genscreen
b) Avec l’association Genscreen+Murex
c) Avec l’AxSYM
6.2.2. Performances des ELISA obtenusavec les prélèvements de gouttes de sang séché
a) Avec le Genscreen
b) Avec l’association Genscreen +Murex
c) Avec l’AxSYM
6.2.3. Comparaison des faibles réactivités obtenues avec le Genscreen avec celle obtenue avec l’AxSYM
DISCUSSION
CONCLUSION
BIBIOGRAPHIE
