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Introduction de l’étude
Le sepsis est un problème de santé publique majeur en raison d’une mortalité élevée estimée à 10% chez les enfants et 38.4% chez les personnes âgées3. L’augmentation de la mortalité chez les patients en sepsis est due à un retard d’administration des antibiotiques8, une antibiothérapie inadaptée 12,13 ou à la présence de résistances bactériennes comme des BLSE14. La bactérie responsable du sepsis peut être mise en évidence par la réalisation d’hémocultures. Les résultats de sensibilité (antibiogramme) permettent d’adapter l’antibiothérapie. Un rendu d’antibiogramme plus rapide est associé à une meilleure évolution clinique des patients en sepsis15. Actuellement à partir d’un flacon positif les résultats de l’antibiogramme sont obtenus en 16 à 24 heures. Les bactéries majoritairement impliquées dans le sepsis sont les entérobactéries et Staphylococcus aureus16.
Ces dernières années, les laboratoires de bactériologie ont amélioré la prise en charge des flacons d’hémocultures. Dans un premier temps ils ont élargi leur plage de travail 24/7 10 afin d’incuber en continu les flacons d’hémocultures dans les automates. Cependant la lecture et la validation des antibiogrammes demeurent des activités réalisées entre 8h30 et 17h.
Dans un deuxième temps, l’utilisation de la protéomique avec la spectrométrie de masse (Maldi-tof) a permis d’obtenir une identification en direct depuis le flacon d’hémoculture positif dans un délai de 10 minutes à 1 heures ou après une pré-culture de 4 heures17. Dans notre laboratoire la méthode (lyse + lavage) permet une identification de 80% des bactéries (96% des entérobactéries) dans un délai de 10 minutes11. Une première adaptation de l’antibiothérapie probabiliste peut donc se faire à partir de ces résultats. Cette identification en direct permet d’éviter l’étape de subculture qui nécessite un délai supplémentaire de 24 heures18.
Plusieurs méthodes moléculaires ont été développées et utilisées pour détecter directement sur des flacons d’hémocultures positifs les résistances bactériennes. Par exemple la détection de la résistance à la méticilline chez les S. aureus par Xpert MRSA/SA (Cepheid, Sunnyvale, CA) est utilisée pour les flacons d’hémocultures positifs à cocci gram positif en amas afin d’adapter le traitement. La résistance chez les entérobactéries peut être également détectée par des tests moléculaires ciblant plusieurs gènes de résistances19. Ces techniques ont comme inconvénient d’avoir un surcoût important et des études médico-économiques sont actuellement en cours afin de définir la place de ces tests dans la stratégie diagnostique. Par ailleurs ces techniques ne permettent pas de détecter les céphalosporinases hyperproduites17.
Les méthodes phénotypiques restent pour l’instant le gold standard permettant de tester la sensibilité de la bactérie à un large panel d’antibiotiques. Cependant le résultat de l’antibiogramme à partir d’un flacon positif nécessite un délai de 16 à 24 heures.
Récemment une méthode de rendu rapide des antibiogrammes par diffusion sur un milieu de culture a été développée. Cette méthode utilise un milieu particulier contenant des adjuvants dans la gélose associée à une lecture précoce des diamètres par une caméra (SIR-scan). Ce milieu Mueller-Hinton Rapid-SIR (MHR-SIR) vient d’être évalué et il permettrait un gain de 17 heures sur le rendu de l’antibiogramme 20. Cependant dans l’étude de Pilmis et al. 2019, il n’y a pas eu d’évaluation des performances du milieu MHR et d’étude comparative du milieu MHR par rapport au milieu MH sur des flacons d’hémoculture positifs. De plus, elle a été réalisée sur les entérobactéries et le S. aureus avec un antibiogramme réalisé en direct depuis des flacons d’hémoculture positifs en suivant les recommandations d’inoculum de la British society for antimicrobial chemotherapy21. L’utilisation de la PCR à la recherche du gène mecA par la majorité des laboratoires limite l’utilisation d’un milieu MHR pour les S. aureus. Cette étude n’indique pas si la validation des antibiogrammes est effectuée de 8h30 à 18h30.
Par ailleurs depuis 2018, les laboratoires français de microbiologie suivent les recommandations d’inoculum du CA-SFM pour la réalisation d’un antibiogramme en direct depuis un flacon d’hémoculture positif. Ces recommandations sont différentes de celle utilisées dans le travail précédemment publié20.
Les objectif de notre travail sont : (i) évaluer les performances (répétabilité et reproductibilité) du MHR selon les recommandations d’inoculum proposées par la BSAC et le CA-SFM, (ii) de comparer les résultats MHR/MH obtenus sur des flacons d’hémocultures positives à entérobactéries de patients en sepsis, (iii) estimer la réduction du délai de rendu des antibiogrammes d’entérobactéries directement réalisés à partir d’un flacon d’hémoculture au sein de notre laboratoire où la lecture des antibiogrammes est effectuée de 8h30 à 17h00.
Comparaison BSAC vs CA-SFM sur gélose MHR après inoculation de flacons d’hémocultures
L’ensemencement de l’hémoculture a été réalisé grâce à l’incubation d’un flacon contenant 10 mL de sang avec 1mL d’une souche type E.coli ATCC 25922 à 0,5 Mac Farland. Le flacon était détecté positif après 7 heures d’incubation. Dès la positivité du flacon d’hémoculture un ensemencement est effectué sur 2 géloses MHR (I2a) avec un inoculum suivant les recommandations du CA-SFM de 15 gouttes du flacon d’hémoculture dilué dans 9 mL (15G) de sérum physiologique et 2 géloses MHR suivant les recommandations du BSAC avec 1 goutte dans 5mL d’eau stérile (1G).
Le milieu MHR (I2a) contient des adjuvants dans la gélose permettant de mieux révéler une faible pousse bactérienne associée à des paramètres spécifiques d’acquisition d’image sur le SIR-Scan 2000 Automatic (I2a). La lecture sur l’automate se fait toutes les 1/2 heures à partir de la 6ème heure et jusqu’à la 8ème heure d’incubation.
La répétabilité a été effectuée grâce à 20 antibiogrammes réalisés par le même opérateur, avec le même lot de réactifs, le même instrument et dans le délai le plus court possible.
La reproductibilité a été effectuée avec 34 antibiogrammes. Les critères de variation sont le temps et les opérateurs avec 34 opérateurs différents sur 3 jours. Les diamètres sont lus et corrigés par un biologiste en fonction du CA-SFM 2019 V1.
Les données de diamètre d’inhibition et de sensibilité ont été extraites du SIR-Scan 2000 (I2a) à l’aide du logiciel SIRWEB (I2a). Ces données ont été comparées entre elles et par rapport aux limites acceptables pour la souche E. coli ATCCC 25922 décrites dans le CA-SFM 2019 V1.
Comparaison MHR vs MH sur des flacons d’hémocultures positives
Les performances du milieu MHR ont été comparées à celles du milieu MH en testant les flacons positifs sur une période de 4 mois (Juin 2019 et Septembre 2019). Nous avons inclus les flacons détectés positifs mono-microbien à entérobactéries entre 9h et 16h de patients en sepsis. L’antibiogramme a été réalisé sur un flacon positif par patient. L’ensemencement du milieu MHR se fait selon les recommandations de la BSAC et celui du milieu MH se fait selon les recommandations standard du laboratoire (CA-SFM) qui est considéré comme la référence.
L’interprétation des sensibilités est faite grâce aux diamètres décrits dans le CA-SFM 2019 V1. Discordance d’interprétation pour la comparaison MH vs MHR : Pour chaque bactérie et chaque antibiotique nous avons comparé la concordance de l’interprétation entre les deux méthodes. Sensible = S, intermédiaire = I ou résistant = R. En cas de discordances une CMI est déterminée par technique de bandelette Etest (BioMérieux).
Les discordances étaient classées selon les critères d’interprétation suivants :
– Erreurs mineures / Minor Error (me) : antibiotiques interprétés S ou I avec une méthode et respectivement I ou R avec l’autre méthode.
– Erreurs majeures / Major Error (ME) : antibiotiques interprétés R avec le MHR-SIR et S avec la méthode standard.
– Erreurs très majeures/ Very Major Error (VME) : antibiotiques interprétés S avec le MHR et le R avec le MH standard.
Estimation de la réduction du délai de rendu de l’antibiogramme grâce à l’utilisation du MHR en direct depuis des flacons d’hémoculture positifs.
Nous avons relevé les délais d’obtention des antibiogrammes avec une étude mono-centrique entre le 1er juillet 2017 et le 31 octobre 2017 sur toutes les hémocultures de patients ayant plus de 18 ans présentant une bactériémie mono-microbienne à entérobactéries. Les données concernant l’identification bactérienne, le temps d’identification bactérienne et le délai de rendu de l’antibiogramme ont été extraites depuis le système d’informatisation du laboratoire (SIL).
Un senior de microbiologie et une équipe mobile d’infectiologie sont disponibles de 8:30AM à 6:30PM. Le senior de microbiologie assure une lecture des antibiogrammes de 8:30AM à 5:00PM. Lorsqu’une hémoculture est positive le temps estimé pour l ‘identification par maldi-tof et la réalisation de l’antibiogramme est de 1.5 heures. Ce délai a été calculé sur une période de 4 mois en réalisant une moyenne du temps nécessaire pour obtenir une identification bactérienne en direct depuis un flacon d’hémoculture et du temps nécessaire pour la réalisation de l’antibiogramme. Le temps moyen nécessaire à l’incubation d’une gélose Mueller-Hinton était durant notre étude de 16 heures. Un délai de 17.5 heures est donc nécessaire pour lire un antibiogramme réalisé depuis un flacon d’hémoculture positif.
Avec le milieu MH, les hémocultures positives après 11:30PM (J0) et jusqu’à 3PM (J1) auront un antibiogramme lu et validé par un microbiologiste à partir 8:30AM (J2). Les hémocultures positives de 3PM (J1) à 11:30PM (J1) auront un antibiogramme lu et validé par le microbiologiste dès la fin d’incubation entre 8:30AM (J2) et 5PM (J2) (Fig.1).
Le temps moyen nécessaire pour une lecture par l’automate du milieu MHR était durant notre étude de 7 heures. Un délai de 8.5h était donc nécessaire pour lire l’antibiogramme réalisé depuis un flacon d’hémoculture positif. Ce délai se compose du délai moyen d’incubation (7 heures) et de 1.5 heures pour réaliser l’identification bactérienne avec l’ensemencement du milieu.
Avec le milieu MHR, les hémocultures positives entre 3PM (J1) et 12:00AM de (J2) auront un antibiogramme théoriquement lu et validé par un microbiologiste à 8:30AM (J2). Les hémocultures positives de 12:00AM (J2) à 8:30AM (J2) auront un antibiogramme lu et validé par le microbiologiste dès la fin d’incubation entre 8 :30AM (J2) et 5PM (J2). Les hémocultures positives entre 8:30AM (J1) et 3PM (J1) n’auront pas de bénéfice (sur le délai d’obtention de l’antibiogramme) à être ensemencé sur milieu MHR. (Fig.1).
Le MHR permet donc un gain de temps pour les hémocultures positives entre 3PM de J1 et 8:30AM de J2 (Fig. 1).
Comparaison BSAC vs CA-SFM sur gélose MHR après inoculation de flacons d’hémocultures
Sur les 1000 diamètres d’inhibition étudiés lors de l’étude de répétabilité nous avons eu 79 diamètres hors des limites de diamètres acceptables décrites dans le CA-SFM 2019 V1 pour la souche type E. coli ATCC 25922. Avec 20 diamètres hors bornes pour le MHR selon les recommandations d’inoculum 1G (BSAC) et 59 pour le MHR selon les recommandations d’inoculum 15G (CA-SFM). Les différences sont significatives avec p < 0.001 (chi2). Les diamètres hors des limites étaient répertoriés pour la cefoxitine, la céfépime, l’imipénem et le méropénem, les quinolones et le triméthoprime-sulfamethoxazole. (Fig.2).
Comparaison MHR vs MH sur des flacons d’hémocultures positives
71 flacons d’hémocultures positives monomicrobiennes ont été recueillis pendant la période d’étude chez des patients en sepsis. Les bactéries identifiées étaient : E. coli (n=36), K. pneumoniae (n=15), E. cloacae (n=6), P. mirabilis (n=5), S. marcescens (n=4), E. aerogenes (n=2), K. oxytoca (n=2), M. morganii (n=1). Les souches avaient un profil de résistance aux bêta-lactamines de type sauvage pour 46 d’entre-elles, 15 avec une pénicillinase, 1 avec une céphalosporinase hyperproduite, 1 avec une céphalosporinase acquise et 8 avec une BLSE (Table 2).
Discussion
Dans ce travail nous avons montré que le MHR était comparable à la méthode standard avec le bénéfice d’un délai d’incubation raccourci à 7 heures +/- 30 minutes. Cette gélose permet ainsi une diminution importante du délai d’incubation de l’antibiogramme avec une excellente concordance par rapport à la méthode effectuée en routine au sein du laboratoire. Ce résultat confirme l’étude déjà effectuée sur les flacons d’hémoculture23 . Ce milieu s’ajoute donc aux techniques actuelles d’identification phénotypique rapide à partir d’un flacon d’hémoculture positif 17 avec un coût faible, une bonne reproductibilité et une adaptation simple au sein du workflow du laboratoire.
Pour la première fois sur le milieu MHR nous avons comparé les recommandations d’inoculum de la BSAC21 vs CA-SFM22 avec moins de discordance en faveur de l’inoculum proposé par la BSAC. Plusieurs méthodes sont décrites pour ensemencer un antibiogramme directement depuis un flacon d’hémoculture positive mais aucune ne fait pour l’instant consensus 24–26. Des études souhaitant standardiser les recommandations d’inoculum ont échoué à trouver l’inoculum parfait27. Les recommandations sont donc souvent nationales. Notre résultat est en faveur d’une utilisation du milieu MHR en suivant les recommandations de la BSAC malgré l’incrémentation dans l’EUCAST de l’ATU sensé absorber les variations dues à une différence d’inoculum28. L’ATU (Area of Technical Uncertainty) correspond à des zones d’incertitude technique. Le but est de minimiser la variations systémiques et aléatoires afin de ne pas compromettre la reproductibilité des tests.
Ici, deux sources de variation peuvent expliquer la différence observée entre les recommandations CA-SFM et BSAC. Premièrement, le diamètre CA-SFM était significativement réduit pour la majorité des antibiotiques, en lien avec l’utilisation d’un inoculum initial plus important. Deuxièmement, l’utilisation de deux milieux différents pour diluer l’hémoculture, du sérum physiologique pour le CA-SFM, de l’eau stérile pour le BSAC peut avoir un impact sur la culture bactérienne comme il a été montré dans une étude ancienne29.
L’identification en direct des hémocultures et la réalisation des antibiogrammes 24/730 associés à la lecture des antibiogrammes de 8h30 à 17 heures sont des adaptations techniques et organisationnelles qui permettent un rendu plus rapide de l’antibiogramme. L’identification en direct depuis un flacon d’hémoculture positif permet un gain de 12 à 24 heures par rapport à l’identification par culture bactérienne17. A ce gain de temps s’ajoute ensuite la réduction du délai permise par l’ouverture 24/7 prélèvement veineux à l’incubation l’antibiothérapie31. avec une réduction de 3.4 heures du délai depuis le dans l’automate et 10.4 heures sur l’adaptation de Le temps moyen gagné du MHR comparé à la méthode standard était de 16 heures comme il a été montré dans l’étude récente sur le milieu MHR20. Au sein du CHU de Nice, l’identification en direct depuis les flacons d’hémoculture de 96%11 des entérobactéries couplée à un rendu en moins de 8.5 heures de la majorité des antibiogrammes permettrait de réduire la durée d’hospitalisation12, les complications et la mortalité hospitalière8.
L’équipe mobile d’infectiologie disponible de 8h30 à 18h30 permet de faire le lien entre le rendu rapide des phénotypes de résistance et l’adaptation de l’antibiothérapie chez le patient32.
Grâce à la mise en place du MHR nous allons permettre un gain sur le temps nécessaire au rendu de l’antibiogramme pour 75.1% des hémocultures avec un gain théorique moyen de 16 heures. Ce gain est à revoir en fonction des facteurs humains et de l’organisation du travail au sein de notre laboratoire. En effet le workflow du MHR devrait permettre une validation biologique dès la disponibilité du MHR (entre 8:30AM et 5PM) mais un délai lié à la disponibilité du biologiste peut exister. Nous apportons ici une explication précise de l’intégration de ce milieu au sein d’un laboratoire hospitalier de microbiologie ce qui n’a pas été réalisé dans l’étude précédente.
L’intégration du milieu MHR au sein du workflow du laboratoire doit respecter les critères de la norme ISO 15189.
La lecture du milieu est réalisée par l’interface informatique du SIR-Scan (I2a), il n’y a donc plus la possibilité d’utiliser le pied à coulisse pour s’aider en cas de diamètre difficile à lire. On peut donc observer une difficulté à la lecture lorsque les conditions d’acquisition d’image sont mauvaises ou lorsque les limites entre la zone d’inhibition et la zone de pousse sont mal délimitées.
Nous ajoutons que les images synergiques des BLSE peuvent s’avérer difficiles à interpréter (Fig.4), dans ce cas la détection des BLSE peut être confirmée à l’aide d’un algorithme décisionnel sur le phénotype de résistance. La confirmation d’une BLSE est basée sur la présence d’un diamètre <6mm pour la ticarcilline, la résistance à la céfotaxime associée à une céfoxitine sensible pour les entérobactéries du groupe 1 et 2 lorsqu’il n’y avait pas de co-résistance. Si un doute était présent sur les entérobactéries du groupe 3, une gélose MH avec de la cloxacilline était réalisée avec un rapprochement de disque.
Nous avons constaté une pousse fine uniforme sur l’ensemble de la gélose de façon assez fréquente n’empêchant pas la lecture des antibiogrammes. Le milieu MHR a cependant montré une excellente concordance avec le milieu MH et a permis un raccourcissement du temps de rendu de l’antibiogramme. De plus cette méthode phénotypique permet d’étudier la sensibilité à 25 antibiotiques et de détecter les dérépressions de céphalosporinases 17.
Récemment l’EUCAST a publié des diamètres spécifiques en fonction du délai d’incubation et de l’espèce pour une lecture sur MH standard au bout de 4, 6 ou 8 heures d’incubation. Pour le développement de cette méthode l’EUCAST recommande de prélever 125μl depuis le flacon d’hémoculture à déposer directement sur la gélose et d’incuber les boites sur une durée maximale de 8 heures. La multiplication des diamètres de lecture en fonction du temps d’incubation et de l’espèce risque de compromettre l’utilisation dans les laboratoires de microbiologie. L’intégration du MHR au sein du workflow sera plus aisé et moins contraignantes.
Notre étude comporte cependant plusieurs limites. Nous avons un faible effectif d’hémocultures sur lesquels un milieu MHR en direct a été réalisé et notre étude est monocentrique. Notre échantillon de bactéries représente une épidémiologie classique de laboratoire et donc comporte une faible quantité de bactéries BLSE et une absence de carbapénémases. Une collection de souches avec des cabapénémases et BLSE permettrait d’explorer de façon plus poussée les limites de l’automate permettant l’acquisition des images (SIR-scan). Cette étude apporte une réduction de délai théorique qu’il serait nécessaire de confirmer dans les conditions d’utilisation du milieu MHR. L’évaluation du nombre d’erreurs n’a pas été faite sur le nombre de résistants mais sur le nombre total d’antibiotiques testés33.
Conclusion et perspectives
Nos résultats ont montré une excellente corrélation entre les deux méthodes MH et MHR-SIR.
Cette méthode permet une identification phénotypique rapide, jusqu’à présent impossible.
Le laboratoire de microbiologie clinique du CHU de Nice travaille actuellement sur le développement d’une forte coopération avec le service d’infectiologie ce qui permettra une adaptation précoce de l’antibiogramme. Associé à cette coopération un conseil antibiotique sera directement intégré au rendu de l’antibiogramme afin d’inciter les cliniciens à adapter l’antibiothérapie notamment chez les patients en sepsis.
Conclusion générale
Dans un environnement hospitaliser à la recherche perpétuelle de rapidité, les techniques de diagnostic moléculaire, avec principalement l’arrivée de la PCR multiplex, ont fortement bousculé les méthodes conventionnelles, lentes chronophages et fortement dépendantes d’une intervention humaine. Ces PCR présentent l’avantage d’obtenir un résultat rapide avec une excellente sensibilité et spécificité associés à peu de manipulations techniques. L’interprétation biologique de ces tests est restreinte avec pour les techniques multiplex commerciales un rendu binaire (positif/négatif).
La détection rapide des phénotypes de résistances bactériennes est un enjeu majeur permettant de repositionner dans un délai convenable face à l’urgence, le rendu des profils phénotypiques de résistance bactérienne. Ces méthodes permettent d’étudier l’expression des gènes de résistance et ont un avantage sur la détection des céphalosporinase hyperproduite. L’avantage que procure le MHR est aussi au niveau médico-économique. En effet plusieurs centaines d’euros sont nécessaires afin de rechercher 9 gènes de résistance pour les méthodes les plus performantes (Verigene® Bloodstream Infection Testing Panels (Luminex Corporation, Nanosphere, Northbrook, Etats-Unis)) avec un délai de 2.5 heures.
La méthode phénotypique MHR permet d’obtenir le résultat de 25 antibiotiques avec une concordance par rapport au gold standard (MH) de 99.6% et pour un coût inférieur à 9 euros. Le MHR associé aux modifications organisationnelles et technologiques effectuées au sein du laboratoire permet un gain de 16 heures en moyenne sur le rendu de l’antibiogramme.
Le laboratoire propose donc en cas d’identification d’une entérobactérie sur le flacon d’hémoculture d’effectuer une gélose MHR en direct depuis le flacon, ce qui permet d’obtenir le résultat de l’antibiogramme dans un délai minimum de 8,5 heures. En cas d’identification d’un S. aureus ou en cas de cocci gram positifs en amas non identifiés par la spectrométrie de masse de faire une PCR MRSA (GeneXpert® System) avec un résultat disponible en 1 heure. Cette PCR permet d’adapter rapidement l’antibiothérapie avec de la céfazoline en cas d’absence du gène mecA ou de la Daptomycine/Vancomycine le cas échant. Lorsque les hémocultures sont positives à un autre germe, un protocole standard avec une gélose MH sera réalisé.
La PCR et le milieu MHR sont donc complémentaires. L’utilisation en routine du milieu MHR peut être associée à l’utilisation de la PCR multiplex pour certain cas critiques selon un algorithme défini avec l’équipe mobile d’infectiologie. L’équipe mobile d’infectiologie est l’élément permettant le lien entre le laboratoire et le service d’hospitalisation. Sans coopération efficace entre ces deux unités le gain de temps du laboratoire n’est pas transformé en gain pour le patient.
Les objectifs à venir pour notre laboratoire seront de réduire le délai d’identification par spectrométrie de masse des germes en direct depuis les flacons d’hémoculture. En raison du travail en lot de notre laboratoire un délai de 1,5 heures est nécessaire pour obtenir une identification du germe avec un ensemencement de l’antibiogramme. Un travail en continu permettrait de gagner une heure sur le délai d’obtention du résultat de l’antibiogramme MHR et de réduire encore l’écart de temps entre la PCR et le milieu MHR.
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Table des matières
Partie I : Contexte du travail
Partie II : Introduction de l’étude
Partie III : Matériels et méthodes
Partie IV : Résultats
Partie V : Discussion
Partie VI : Conclusion et perspectives
Partie VII : Conclusion générale
Partie VIII : Article
Partie IX : Bibliographie
Partie X : Serment de Galien
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