Evaluation de nouveaux outils de diagnostic de la tuberculose bovine

Définition de la Tuberculose

   La tuberculose est une maladie infectieuse, contagieuse, commune à l’Homme et à de nombreuses espèces animales. Elle est causée par diverses espèces bactériennes appartenant au genre Mycobacterium : toutes les espèces appartenant au groupe « tuberculosis » ainsi que Mycobacterium avium ssp. avium (Haddad M., Masselot M. et Durand B., 2004a). Elle est caractérisée cliniquement, par une évolution le plus souvent chronique et un grand polymorphisme et anatomiquement, par des lésions inflammatoires, les tubercules (Bénet J.J., 2008). En effet, le nom de tuberculose vient des nodules appelés « tubercules » qui se forment dans les ganglions lymphatiques des individus atteints.

Historique des connaissances sur la maladie

   La tuberculose est une maladie connue depuis la plus haute antiquité. En effet, des signes cliniques pathologiques (lésions osseuses du mal de Pott) révélateurs d’une dégénérescence tuberculeuse ont été retrouvés dans la colonne vertébrale de momies égyptiennes. L’origine des infections était principalement due à M. bovis associé à des infections osseuses (Crubézy et al., 1998). En 1810, Laennec R. découvre le stéthoscope pour l’auscultation et en 1819, il effectue une étude clinique et nécropsique complète de la maladie qui lui permet d’affirmer l’unicité de la tuberculose. Il a également le mérite de penser que « la maladie perlière ou pomelière » des bovidés était de nature tuberculeuse (Thorel M.F., 2003). En 1865, Villemin J.A. montre que la tuberculose est contagieuse (Villemin J.A., 1865). Puis, le bacille tuberculeux est mis en évidence à partir de lésions d’origine humaine, bovine et aviaire par Koch R., en 1882. Pour Koch R., un même bacille est responsable des trois formes de la maladie (Thorel M.F., 2003). En 1882, Ehrlich met en évidence son acido-alcoolorésistance qui est révélée dès 1883 par la méthode de coloration de Ziehl et Neelsen (Site web [1]). Les travaux de Rivolta en 1889 et de Mafucci en 1890 montrèrent la spécificité de l’infection due au bacille d’origine aviaire (Thorel M.F., 2003). Par ailleurs, Koch R. mit au point, en 1890 également, la « lymphe tuberculeuse » ou vieille tuberculine dont l’application au diagnostic allergique de la maladie, proposée par Guttmann l’année suivante, devait se révéler intéressante (Bénet J.J., 2008). En 1896, Smith T. différentie le bacille tuberculeux humain du bacille tuberculeux bovin (Site web [1]). Dès lors, les trois bacilles tuberculeux furent individualisés (nommés ultérieurement par des noms différents d’espèce). Le genre Mycobacterium fut créé par Neumann en 1896 (Thorel M.F., 2003). Le bacille bovin fut nommé Mycobacterium bovis par Karlson A.G. et Lessel E.F. en 1970. La tuberculose a été définie par les experts de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) au congrès de Vienne en 1952 comme «une maladie ou une infection qui se transmet naturellement des animaux vertébrés à l’Homme et inversement».

Mycobacterium bovis

   M. bovis est un bacille petit, trapu et granuleux (Thorel M.F., 2003). C’est un pathogène intracellulaire obligatoire (des macrophages et autres cellules de type monocytique) bien qu’il puisse persister assez longtemps dans le milieu extérieur (Coetzer J.A.W. et Tustin R.C., 2004 ; Biet F. et al., 2005 ; De la Rua-Domenech R. et al., 2006a). Il est micro aérophile avec une croissance lente (temps de génération 16-20 heures (Site web [6])) et sa température optimale de croissance est de 37°C (Coetzer J.A.W. et Tustin R.C., 2004). Sur milieu de culture de Löweinstein-Jensen, les colonies de M. bovis sont dysgoniques, non pigmentées et à la surface lisse, d’abord plates elles deviennent ensuite bombées et brillantes (en « gouttelette ») sans dépasser la taille d’une tête d’épingle (Thorel M.F., 2003). Par comparaison, les colonies de M. tuberculosis sont eugoniques avec un aspect en « choufleur », non pigmentées et à la surface rugueuse et sèche (Bourgoin A. et Agius G., 1995).

Modes de transmission

  La transmission verticale est la transmission de la mère tuberculeuse au fœtus (ou congénitale). Elle n’a jamais été réellement prouvée bien qu’on pense qu’elle soit en cause lors de découverte de cas graves de tuberculose hépatique chez de très jeunes veaux (Thorel M.F., 2003). Une transmission pseudo-verticale, par contact étroit entre la mère infectée et le jeune sain, ainsi que via l’ingestion de colostrum et/ou de lait maternel, expliquerait la contamination des jeunes animaux (Phillips C.J.C., 2003). La transmission horizontale peut être directe ou indirecte. La transmission directe s’opère par des contacts étroits et prolongés entre un individu sain et un individu infecté, par exemple, lors de confinement d’animaux (Costello E. et al., 1998). En effet, lors de la cohabitation à l’étable, le contact mufle à mufle joue un rôle crucial dans la transmission de la maladie. Dans le cas d’une stabulation entravée, ce sont les vaches voisines qui sont infectées alors qu’en stabulation libre, les contacts sont très nombreux et le risque est donc plus elevé. Par ailleurs, les comportements des bovins au pâturage, comme le phénomène de reconnaissance des bovins par des contacts mufle à mufle, peuvent accroître le risque de diffusion de l’infection. La transmission indirecte s’effectue par l’intermédiaire du milieu extérieur contaminé (locaux, pâturages, fèces, eaux, aliments, lait).

Facteurs de risque en élevage

  Le type, la taille et la conduite des élevages constituent des facteurs de risque interagissant sur les trois mécanismes (introduction, voisinage, résurgence) de survenue de l’infection dans un élevage indemne.
Type d’élevage Les niveaux de risque diffèrent selon le type d’élevage. Des études montrent que les cheptels laitiers sont plus susceptibles que les cheptels allaitants car le renouvellement des animaux, et par conséquent le risque d’introduction, est plus important qu’en élevage allaitant. Néanmoins, dans les élevages allaitants, il existe un risque important lié à l’introduction de taureau pour la reproduction alors qu’en élevage laitier, l’insémination artificielle est plus souvent utilisée. De plus, comme les animaux des élevages allaitants ont une plus grande durée de vie dans l’exploitation (jusqu’à 12 ans alors qu’une vache laitière est réformée à 5-6 ans), il existe donc un risque lié à la résurgence d’une infection latente (Barlow N.D., 1997 cité par Humblet M.F., Boschiroli M.L. et Saegerman C., 2009). De plus, dans ces élevages, le risque lié au voisinage est important (contacts plus nombreux en prairie).
Taille du cheptel Plus la taille d’un cheptel est grande, plus le risque d’interaction avec un animal infecté (réservoir) du cheptel est élevé, quels que soient les pays (développés ou en développement) (Griffin J.M. et al., 1996 ; Goodchild A.V. et Clifton-Hadley R.S., 2001 ; Humblet M.F., Boschiroli M.L. et Saegerman C., 2009 ; Brooks-Pollock E. et Keeling M., 2009). De plus, l’augmentation de la taille de l’élevage requiert souvent un plus grand nombre de parcelles et par conséquent, ceci augmente la possibilité de contamination par le voisinage. De même, le risque de contamination par introduction est accru par la grande taille de l’élevage car les flux entrants sont plus nombreux. Ceci est accentué dans les élevages laitiers (nombreux renouvellements). Enfin, dans les cheptels de grande taille, les interventions humaines (vétérinaires, éleveurs) sont de fait réduites ce qui peut favoriser le risque de non détection d’un animal infecté et donc la persistance à bas bruit de l’infection. La combinaison de ces facteurs de risque liés à la taille du cheptel montre que l’effet de la taille du cheptel est une situation critique à ne pas négliger.

Avantages et inconvénients de l’IDS

   L’IDS est facile à réaliser et moins coûteuse que les autres tests de dépistage. Elle est également inoffensive et non sensibilisante pour l’animal (voire même désensibilisante après plusieurs répétitions, d’après Coad M. et al., 2010). La valeur médiane de la sensibilité individuelle de l’IDS est de 83,9 % sans tenir compte du site d’injection (valeurs variant de 63,2 % à 100 %, De la Rua-Domenech R. et al., (2006a)). En effet, l’IDS réalisée à l’encolure est plus sensible mais moins spécifique que l’IDS pratiquée au pli sous-caudal (Monaghan M.L. et al., 1994 ; De la Rua-Domenech R. et al., 2006a). De plus, comme ce test est utilisé à l’échelle du cheptel, il est très sensible (sensibilité prochede 1) car il suffit qu’un seul animal donne un résultat positif pour que le cheptel infecté soit détecté et considéré infecté (Bénet J.J., 2008). Toutefois, la spécificité de l’IDS se dégrade lorsque l’on passe à l’échelle du cheptel puisque tous les animaux testés du cheptel doivent avoir un résultat négatif pour que celui-ci soit déclaré indemne. En effet, la spécificité individuelle de l’IDS ayant une valeur médiane de 96,8 % sans tenir compte du site d’injection (valeurs variant de 75,5 % à 99,0 %, De la RuaDomenech R. et al., 2006a) est relativement bonne alors que sa spécificité cheptel chute. Il existe de nombreuses causes d’erreur par excès (Monaghan M.L. et al., 1994), c’est-à-dire de réaction allergique à l’IDS chez un animal non tuberculeux (faux positif) : en particulier, la réaction croisée avec d’autres mycobactéries (M. avium, Mycobactéries atypiques), mais aussi une lecture trop précoce ou une interprétation abusive d’une réaction négative (Chenal R., 1994 ; Lauzi S. et al., 2000).sd<<

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Partie I : ETAT DES CONNAISSANCES SUR LA TUBERCULOSE BOVINE
Chapitre 1 : La Tuberculose bovine 
I. Notions générales sur la Tuberculose
I.1. Définition de la Tuberculose
I.2. Historique des connaissances sur la maladie
I.3. Les mycobactéries
I.3.1. Le genre Mycobacterium
I.3.1.1. Définition
I.3.1.2. Caractéristiques bactériologiques essentielles
I.3.2. Différentes classifications des espèces mycobactériennes
I.3.2.1. Classification selon l’importance clinique
I.3.2.2. Classification selon la vitesse de croissance
II. La Tuberculose bovine
II.1. Définition de la Tuberculose bovine (Tb)
II.2. Mycobacterium bovis
II.3. Aspect zoonotique
II.4. Pathogénie et évolution de la Tb
II.4.1. Les conditions de l’infection de l’animal
II.4.1.1. Les conditions qualitatives
II.4.1.1.1. Age
II.4.1.1.2. Espèce, race, sexe
II.4.1.1.3. Etat général
II.4.1.1.4. Statut immunitaire
II.4.1.1.5. Caractéristiques génétiques
II.4.1.1.6. Autocontamination
II.4.1.2. Conditions quantitatives
II.4.2. Les étapes de l’infection
II.5. Epidémiologie de la Tb
II.5.1 Epidémiologie analytique
II.5.1.1. Les sources de contagion
II.5.1.2. Les modalités de contagion
II.5.1.2.1. Modes de transmission
II.5.1.2.2. Voies de pénétration
II.5.2. Mécanismes de diffusion de la Tb dans un élevage
II.5.2.1. Facteurs causaux de survenue de la Tb dans un élevage
II.5.2.1.1. L’introduction d’un animal
II.5.2.1.2. Le voisinage
II.5.2.1.3. La résurgence
II.5.2.2. Facteurs de risque en élevage
II.5.3. Enquêtes épidémiologiques
III. Les méthodes de dépistage et diagnostic de la Tb
III.1. Les méthodes conventionnelles de dépistage et diagnostic de la Tb
III.1.1. Présentation des méthodes ante mortem: les tests tuberculiniques
III.1.1.1. L’IDS
III.1.1.1.1. Principe de l’IDS
III.1.1.1.2. Avantages et inconvénients de l’IDS
III.1.1.2. L’IDC
III.1.1.2.1. Principe de l’IDC
III.1.1.2.2. Avantages et inconvénients de l’IDC
III.1.2. Présentation des méthodes post mortem : Nécropsie, Histologie et Bactériologie
III.1.2.1. L’inspection post mortem
III.1.2.2. L’examen histopathologique
III.1.2.3. L’examen bactériologique
III.1.2.3.1. La Culture
III.1.2.3.1.1. Les traitements des échantillons
III.1.2.3.1.2. Les milieux de culture
III.1.2.3.2. L’identification de l’agent pathogène
III.1.2.4. Le typage moléculaire des isolats de M. bovis
III.2. Les méthodes complémentaires et nouveaux outils de diagnostic de la Tb
III.2.1. Les méthodes in vitro de diagnostic ante mortem
III.2.1.1. Le sérodiagnostic de la Tb : généralités sur les tests sérologiques
III.2.1.2. La technique de dosage d’interféron gamma
III.2.1.2.1. L’interféron gamma
III.2.1.2.2. Historique et principe du test de dosage d’IFNγ
III.2.1.2.3. Le test IFNγ Bovigam®
III.2.1.2.3.1. Principe du test Bovigam®
III.2.1.2.3.2. Méthode Bovigam®
III.2.1.2.3.3. Conditions d’utilisation du test Bovigam®
III.2.1.2.3.4. Interprétation des résultats du test Bovigam®
III.2.1.2.3.5. Avantages du test Bovigam®
III.2.1.2.3.6. Les limites du test Bovigam®
III.2.1.2.4. Applications du test IFNγ
III.2.1.2.4.1. Applications du test IFNγ basé sur les PPD
III.2.1.2.4.2. Les effets de l’IDT sur le test IFNγ
III.2.1.2.4.3. Utilisation d’Ag immunodominants: ESAT6/CFP10
III.2.2. La technique PCR en temps réel pour le diagnostic post mortem
III.2.2.1. La PCR pour la recherche de Tb d’après la littérature
III.2.2.1.1. Différentes cibles génétiques spécifiques du MTBC
III.2.2.1.2. Différentes cibles génétiques spécifiques de M. bovis
III.2.2.2. La méthode PCR IS6110 en temps réel de LSI (étudiée dans ce travail)
III.2.2.2.1. Présentation du test PCR MTBC de LSI (1 ère version, 2007)
III.2.2.2.2. Conditions de réalisation du test
Chapitre 2 : Organisation de la lutte contre la Tb en France 
I. Dispositif national règlementaire de la lutte contre la Tb
I.1. Evolution pertinente de la conception de la lutte contre la Tb
I.1.1. Evolution des mesures offensives
I.1.1.1. Dépistage de l’infection
I.1.1.2. Assainissement
I.1.2. Evolution des mesures défensives
I.1.2.1. Protection des cheptels indemnes
I.1.2.1.1. Maîtrise du risque lié à l’introduction
I.1.2.1.2. Maîtrise du risque de résurgence
I.1.2.1.3. Maîtrise du risque lié au de voisinage
I.1.2.2. Qualification des élevages
I.2. Organisation sanitaire de la lutte collective contre la Tb
I.2.1. Les Eleveurs
I.2.2. Les Groupements de défense sanitaire
I.2.3. Les Vétérinaires sanitaires
I.2.4. Les Directions départementales des services vétérinaires
I.2.5. Les Laboratoires départementaux d’analyses agréés
I.2.6. L’Agence française de sécurité sanitaire des aliments
I.2.7. La Direction générale de l’alimentation
I.3. Procédures nationales règlementaires de dépistage et diagnostic de la Tb (au 1er janvier 2007)
I.3.1. Procédures de dépistage et diagnostic ante mortem de la Tb
I.3.2. Procédure de dépistage et diagnostic post mortem de la Tb
II. Situation épidémiologique de la Tb en France jusqu’en 2007 et Stratégies nouvelles pour renforcer la lutte ?
II.1. La situation au niveau national
II.1.1. 1955-2000 : diminution historique de la Tb pour devenir indemne
II.1.2. 2001-2006 : la situation reste inquiétante
II.2. La situation dans le département de la Dordogne et la stratégie adoptée
II.2.1. La situation en Dordogne
II.2.2. La stratégie adoptée
II.3. Nouveaux outils stratégiques utilisés en Dordogne pour renforcer la lutte
Partie II : TRAVAIL EXPERIMENTAL 
Chapitre 1 : Un test IFNγ Bovigam® modifié pour renforcer la lutte contre la Tb
Introduction : Mise en place stratégique d’un test IFNγ Bovigam® modifié en Dordogne
Matériel et Méthodes 
I. Présentation de l’adaptation du test Bovigam® à un contexte de faible prévalence de Tb
II. Description du test IFNγ modifié : protocole d’analyse et méthode d’interprétation des résultats
II.1. Protocole d’analyse du test IFNγ modifié
II.1.1. Etape 1 : la stimulation cellulaire
II.1.1.1. Macro-méthode
II.1.1.2. Micro-méthode
II.1.2. Etape 2 : le dosage d’IFNγ par la méthode ELISA
II.2. Interprétation des résultats d’une analyse IFNγ modifiée
II.2.1. Critères de validation de l’analyse ELISA par les témoins
II.2.2. Critères de validation de la qualité de chaque échantillon
II.2.3. Méthodes d’interprétation des résultats d’un échantillon analysé avec la technique IFNγ modifiée
II.2.3.1. Interprétation des résultats individuels
II.2.3.1.1. Mode de calcul “initial”
II.2.3.1.2. Mode de calcul “normalisé”
II.2.3.2. Interprétation du résultat final à partir des résultats individuels
III. Intégration à titre expérimental en Dordogne, du test IFNγ modifié en complément des tests actuels employés pour la lutte contre la Tb
III.1. Modification de la séquence diagnostique de la Tb à partir du dépistage en prophylaxie (par IDS)
III.2. Utilisation du test IFNγ en parallèle à l’IDS lors d’enquête épidémiologique
IV. Les différentes études relatives à l’utilisation du test IFNγ modifié en Dordogne
IV.1. Etudes de la spécificité absolue, de la spécificité et la sensibilité relatives du test IFNγ modifié : description des échantillons et processus de sélection
IV.1.1. Etude de la sensibilité relative à la confirmation post-mortem de Tb (Ser) du test IFNγ modifié
IV.1.2. Etude de la spécificité absolue (Sp) du test IFNγ modifié
IV.1.3. Etude de la spécificité relative à l’IDS non-négative (Spr) du test IFNγ modifié
IV.2. Etude comparative entre les deux modes de calcul (“initial” et “normalisé”) et entre deux seuils différents à partir des estimations des Ser , Sp et Spr individuelles et finales du test IFNγ modifié : description de la méthode employée
IV.2.1. Modes de calcul et critères d’interprétation des résultats individuels (des PPD et R) des échantillons de chacune des études
IV.2.1.1. Mode de calcul “initial” et seuils décisionnels étudiés
IV.2.1.2. Mode de calcul “normalisé” et seuils décisionnels étudiés
IV.2.2. Interprétation du résultat final à partir des résultats individuels
IV.2.3. Définitions des Ser , Sp et Spr individuelles et finales du test IFNγ modifié
IV.2.3.1. Calcul des Ser , Sp et Sprindividuelles (R et PPD) du test
IV.2.3.2. Calcul des Ser , Sp et Spr finales du test
IV.3. Evaluation des valeurs de sensibilité & spécificité individuelles optimales permettant de déterminer des seuils décisionnels normalisés et ainsi d’estimer la sensibilité et la spécificité finales du test IFNγ avec les deux méthodes d’interprétation, selon les différentes conditions d’utilisation du test en Dordogne
Résultats et Interprétations 
I. Résultats des études de sensibilité et spécificité (Ser, Sp et Spr) du test IFNγ modifié, pour les comparaisons des deux modes de calcul et des deux types de seuils utilisés
I.1. Résultats de l’étude de la sensibilité relative à la confirmation post mortem de Tb (Ser) du test IFNγ modifié
I.1.1. Contrôle de la qualité des 73 échantillons sélectionnés
I.1.2. Estimation des Ser individuelles et finales du test IFNγ à partir de différents critères d’interprétation des résultats (2 modes de calcul et 2 types de seuil décisionnel)
I.1.2.1. Estimation des Ser individuelles (Ser PPD et Ser R)
I.1.2.2. Estimation de la Ser finale (Ser PPD∩R ou Ser PPDUR)
I.2. Résultats de l’étude de spécificité absolue (Sp) du test IFNγ modifié
I.2.1. Contrôle de la qualité des 496 échantillons analysés
I.2.2. Estimation des Sp individuelles et finales du test IFNγ à partir de différents critères d’interprétation des résultats (2 modes de calcul et 2 types de seuil décisionnel)
I.2.2.1. Estimation des Sp individuelles (Sp PPD et Sp R)
I.2.2.2. Estimation de la Sp finale (Sp PPD∩R ou Sp PPDUR)
I.3. Résultats de l’étude de spécificité opérationnelle ou relative à l’IDS nonnégative (Spr) du test IFNγ modifié
I.3.1. Contrôle de la qualité des 578 échantillons sélectionnés
I.3.2. Estimation des Spr individuelles et finales du test IFNγ à partir de différents critères d’interprétation des résultats (2 modes de calcul et 2 types de seuil décisionnel)
I.3.2.1. Estimation des Spr individuelles (Spr PPD et Spr R)
I.3.2.2. Estimation de la Spr finale (Spr PPD∩R ou Spr PPDUR)
II. Combinaisons des résultats individuels des différentes études pour déterminer les seuils décisionnels, relatifs au mode de calcul “normalisé”, selon les différentes conditions d’utilisation du test en Dordogne et en déduire les valeurs de sensibilité et spécificité finales de ce test
II.1. Evaluation des Ser (sensibilités relatives) et Sp (spécificités absolues) individuelles optimales et, estimation des Ser et Sp finales du test pour des valeurs de seuil donnant des Ser et Sp individuelles optimales
II.1.1. Détermination des seuils permettant des Ser et Sp individuelles optimales
II.1.1.1. Résultats combinés des Ser PPD & Sp PPD
II.1.1.2. Résultats combinés des Ser R & Sp R
II.1.2. Estimation des Ser et Sp finales du test IFNγ aux seuils décisionnels déterminés pour des Ser et Sp individuelles optimales
II.2. Evaluation des Ser (sensibilités relatives) & Spr (spécificités opérationnelles) individuelles optimales et, estimation des Ser & Spr finales du test pour des valeurs de seuils donnant des Ser & Sp individuelles optimales
II.2.1. Détermination des seuils permettant des Ser & Spr individuelles optimales
II.2.1.1. Résultats combinés des Ser PPD & Spr PPD
II.2.1.2. Résultats combinés des Ser R & Spr R
II.2.2. Estimation des Ser & Spr finales du test IFNγ aux seuils décisionnels déterminés pour des Ser et Spr individuelles optimales
Discussion 
I. Validité de l’échantillonnage
I.1. Etude de la spécificité du test IFNγ modifié
I.2. Etude de la sensibilité du test IFNγ modifié
II. Comparaison des sensibilités et spécificités individuelles et finales du test obtenues avec les deux modes de calcul et pour deux seuils différents selon ses différentes conditions d’utilisation
II.1. Application du test IFNγ dans la population générale
II.1.1. Sensibilités relatives et spécificités absolues individuelles
II.1.2. Sensibilité relative et spécificité absolue finales du test
II.1.2.1. Méthode d’interprétation PPD∩R
II.1.2.2. Méthode d’interprétation PPDUR
II.2. Application du test IFNγ sur des animaux avec une IDS non négative
II.2.1. Sensibilités relatives et spécificités opérationnelles individuelles
II.2.2. Sensibilité relative et spécificité opérationnelle finales du test
II.2.2.1. Méthode d’interprétation PPDUR
II.2.2.2. Méthode d’interprétation PPD∩R
II.3. Conclusion de l’étude comparative entre 2 modes de calcul avec 2 seuils différents
III. Evaluation des valeurs de sensibilité & spécificité individuelles optimales permettant de déterminer des seuils décisionnels pour le mode de calcul normalisé et ainsi d’estimer les qualités finales du test IFNγ modifié pour les deux méthodes d’interprétation, selon les conditions d’utilisation du test
III.1. Application du test IFNγ modifié dans la population générale
III.2. Application du test IFNγ sur des animaux avec une IDS non négative
Conclusion
Chapitre 2 : Un test PCR IS6110 en temps réel pour renforcer la lutte contre laTb
Introduction : Mise en place d’un test PCR IS6110 en temps réel en Dordogne
Sous-Chapitre 1 : Etude analytique du test PCR IS6110 en temps réel utilisé en Dordogne
Matériels et Méthodes 
I. Description des échantillons pour les études de sensibilité et spécificité analytiques du test PCR IS6110
I.1. Etude de la sensibilité analytique du test PCR IS6110
I.2. Etude de la spécificité analytique du test PCR IS6110
I.2.1. Mycobactéries n’appartenant pas au MTBC
I.2.2. Bactéries n’appartenant pas au genre Mycobacterium
II. Protocole d’amplification et de détection par PCR IS6110 de la cible génétique et Méthode d’interprétation des résultats
II.1. Protocole d’amplification et de détection par PCR de la cible génétique IS6110
II.2. Méthode d’interprétation des résultats
Résultats et Discussion 
I. Etude de la sensibilité analytique du test PCR IS6110
II. Etude de la spécificité analytique du test PCR IS6110
Conclusion
Sous-Chapitre 2 : Etude de la valeur opérationnelle de cette méthode PCR IS6110 utilisée en Dordogne
Matériels et Méthodes 
I. Description des échantillons et processus de sélection rétrospectif
I.1. Etude de la sensibilité diagnostique de la 1ère version de la PCR (PCR1)
I.2. Deux études comparatives entre les sensibilités diagnostiques de PCR1 et PCR2
I.2.1. Première étude comparative entre PCR1 et PCR2
I.2.2. Deuxième étude comparative entre PCR1 et PCR2b
I.3. Etude de la sensibilité diagnostique de la PCR2b
I.4. Etude de la spécificité diagnostique « opérationnelle » de la PCR
I.5. Etude complémentaire de la spécificité de la PCR2b conditionnelle à l’identification de bactéries n’appartenant pas au MTBC
II. Description des techniques utilisées (Histologie, Bactériologie et Méthode PCR IS6110)
II.1. Histologie réalisée par les laboratoires agréés (LDA22 et ENV/AfssaLyon)
II.2. Bactériologie (culture selon la méthode de référence & identification) et Méthode PCR
II.2.1. Préparation des échantillons : Décontamination & Broyage des échantillons
II.2.2. Analyses des échantillons décontaminés
II.2.2.1. Recherche bactériologique des mycobactéries du MTBC
II.2.2.2. Méthode PCR IS6110 pour la recherche des mycobactéries du MTBC
II.2.2.2.1. Purification du surnageant puis Ribolyse®
II.2.2.2.2. Extraction d’ADN à partir de l’échantillon ribolysé
II.2.2.2.3. Analyse PCR des échantillons d’ADN extraits
II.2.2.2.3.1. Test PCR version 1, PCR1
II.2.2.2.3.2. Test PCR version 2, PCR2
II.3. Méthode d’analyse des différents résultats obtenus par animal dans les études de sensibilité diagnostique des PCR1 et PCR2b et de spécificité diagnostique opérationnelle de la PCR
Résultats et Interprétations 
I. Etudes de la sensibilité diagnostique de la PCR
I.1. Etude de la sensibilité diagnostique de la PCR1
I.2. Etudes comparatives entre les sensibilités diagnostiques de PCR1 et PCR2
I.3. Etude de la sensibilité diagnostique de la PCR2b
II. Etudes de la spécificité diagnostique de la PCR
II.1. Etude de la spécificité diagnostique opérationnelle de la PCR
II.2. Etude de la spécificité de la PCR2b conditionnelle à l’identification de bactéries n’appartenant pas au MTBC
Discussion 
I. La sensibilité diagnostique de la PCR
I.1. Etude de la sensibilité de la PCR1
I.2. Etude comparative entre PCR1 et PCR2
I.3. Etude de la sensibilité de la PCR2b
I.4. Evaluation des études de sensibilités diagnostiques des PCR1 et PCR2b
II. La spécificité diagnostique de la PCR
II.1. Etude de la spécificité opérationnelle de la PCR
II.2. Etude de la spécificité de la PCR2b conditionnelle à l’identification de bactéries n’appartenant pas au MTBC et comparaison avec l’étude de sa spécificité analytique
III. Les avantages diagnostiques de la PCR2b après évaluation de ses performances
Conclusion
Chapitre 3 : Discussion relative au bilan de l’intégration des deux tests dans le dispositif de lutte contre la Tb
I. Bilan de l’intégration des tests IFNγ (Bovigam®) modifié et PCR IS6110 en temps réel (TaqVet® MTBC) dans le dispositif de lutte contre la Tb en Dordogne (2007-2010)
I.1. Evaluation de la situation en Dordogne suite à l’utilisation du test IFNγ après une IDS non-négative (2007-2009)
I.1.1. Amélioration de la prophylaxie et de la détection des foyers
I.1.2. Rôle clé du protocole IFNγ dans le maintien des déclarations des cheptels IDS non-négatifs
I.1.3. Réduction du nombre d’abattages diagnostiques
I.2. Evaluation de l’utilisation du test PCR IS6110 en temps réel en Dordogne (2006-2009)
II. Evolution 2007-2010 de la règlementation relative à la lutte contre Tb en France
III. La situation épidémiologique en France 2007-2009
IV. Test IFNγ : Résultats de nos études et évolutions des modalités d’interprétation
IV.1. Modalités d’interprétation des résultats individuels des PPD et des R
IV.2. Modalités d’interprétation du résultat final du test IFNγ
V. Nouveaux schémas décisionnels appliqués en Dordogne suite aux modifications règlementaires de 2009
V.1. Nouvelles gestions des suspicions de Tb
V.1.1. Lors de prophylaxie
V.1.2. En abattoir
V.2. Contrôles à l’introduction et enquêtes épidémiologiques
V.3. Assainissement par abattage partiel
VI. Bilan et Travaux en perspectives
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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