Evaluation de nouveaux catalyseurs organiques de type bipyridinium pour la ROP del’ε-caprolactone

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Fonctionnalisation du copolymère par une fonction acrylate

La synthèse de copolymères acrylate (2a) été envisagée par réaction entre le copolymère-OH et le chlorure d’acryloyle en présence de triéthylamine (NEt3) et DMAP (Figure 50). Différentes conditions expérimentales ont été mises en œuvre. Dans le DCM à température ambiante avec 20 équivalents de chlorure d’acryloyle et de NEt3, le copolymère acrylate a été obtenu de façon reproductible sur une échelle de 600 mg avec un rendement supérieur à 90 %. L’analyse SEC montre qu’il n’y a pas de dégradation du copolymère dans ces conditions. En RMN 1H, les signaux oléfiniques sont observés à 5,84, 6,08 et 6,48 ppm, et le ratio acrylate – méthoxy du mPEG à 3,36 ppm permet de conclure à une fonctionnalisation totale du copolymère. Néanmoins, nous pouvons remarquer une coloration jaune du copolymère. Cette coloration persiste même après plusieurs lavages (MeOH, Et2O, pentane).

Réaction de thiol-ène addition entre le Cabazitaxel fonctionnalisé –SH et le copolymère acrylate

Le Cabazitaxel fonctionnalisé –SH (1a) et le copolymère acrylate (2a) ayant tous deux été synthétisés, la thiol-ène addition peut être envisagée (Figure 51).
Plusieurs essais ont été réalisés dans différents solvants, comme le DCM, le THF, l’acétone, le DMSO ou encore l’acétonitrile, qui sont compatibles avec la nature amphiphile du copolymère PEG-PLA. L’utilisation d’une large gamme de solvants a permis de tester la réaction à plusieurs températures allant de 20 à 160°C. Du point de vue du catalyseur, un récent rapport de Li et al. montre que les amines primaires et tertiaires sont des catalyseurs efficaces, même si des temps de réaction de plusieurs heures sont nécessaires pour atteindre des conversions élevées (97 %).[45] Avec les phosphines, comme Me2PPh, la réaction est totale en quelques minutes dans des conditions optimisées. En revanche, la concentration de Me2PPh doit être maintenue à des niveaux catalytiques pour éviter la formation de sous-produits, provenant de l’addition de la Me2PPh sur la fonction vinyle. Ces résultats ont été démontrés grâce à des études détaillées en spectrométrie de masse (ESI-MS).[45] La Me2PPh et l’hexylamine ont donc été testés sur notre système. Lorsque la Me2PPh est utilisée en quantité catalytique (0.1 mol %) il n’y a pas de réaction (les signaux des acrylates sont toujours présents en RMN 1H), mais lorsque celle-ci est utilisée en excès il y a bien consommation des acrylates par la phosphine formant un phosphonium-ester qui est inerte, ne conduisant donc pas au produit désiré. En conclusion, malgré les différents tests effectués, le produit de thiol-ène addition (3) n’a pas pu être obtenu. Comme le font remarquer Li et al., il devrait également être noté que l’effet du solvant, le type de thiol ainsi que la basicité du milieu ont un grand rôle sur cette réaction et doivent être choisis avec soin.[45]
La thiol-ène addition par voie radicalaire avec AIBN n’a pas été envisagée car des produits de polymérisation de la fonction acrylate peuvent être obtenus.
En conclusion, le copolymère fonctionnalisé –SH (1b) n’a pas pu être obtenu, la réaction de thiol-ène addition n’a donc pas été testée et la thiol-ène addition avec le Cabazitaxel fonctionnalisé –SH (1a) n’a pas conduit à la formation du produit (3) désiré. Au vu de ces résultats, une autre voie de synthèse a été envisagée, faisant appel aux méthodes classiques de fonctionnalisation d’acides qui ont été auparavant employées pour la synthèse des conjugués mPEG-PLA-diglycolyl-Cabazitaxel. La seconde voie mise en œuvre consistait à mono fonctionnaliser l’acide thiodipropionique par le Cabazitaxel, pour ensuite réaliser le couplage avec le copolymère de structure Y et linéaire (Figure 52). L’utilisation du Cabazitaxel avant celle du copolymère est un choix délibéré, car cela permet de rester à l’échelle moléculaire et donc d’envisager une purification par chromatographique colonne, ce qui ne serait pas le cas si le copolymère avait été couplé en premier.
La mono fonctionnalisation de l’acide thiodipropionique par le Cabazitaxel a été réalisée dans des conditions classiques de couplage (DMAP, DIPC dans DCM) (Figure 53). Un excès d’acide (5éq) a été utilisé afin de minimiser le produit de double addition. Néanmoins, les analyses UPLC-MS confirment la présence de ce produit à 36 %. Le composé 4 a ensuite été isolé avec un rendement de 55 % après purification par chromatographique colonne sur gel de silice.
En utilisant les conditions de couplage classiques, comme dans la première étape, les résultats obtenus avec le copolymère linéaire et Y ont donné un couplage avec une efficacité d’environ 30 %. La synthèse de l’anhydride (4’) a donc été réalisée, dans le but d’avoir un couplage total (Figure 54). L’emploi d’un demi équivalent de DCC n’a pas permis la conversion complète de l’acide (4) en anhydride (4’) (suivi UPLC-MS), pour ce faire la quantité a été doublée. L’anhydride n’est pas isolé, le milieu réactionnel est uniquement filtré afin d’éliminer l’urée formée puis engagé directement avec le copolymère. Le couplage obtenu est de 100 %.
La quantification du couplage est déterminée par RMN 1H, grâce à l’intégration des signaux méthoxy présent sur le Cabazitaxel et celui du mPEG. Etant en présence d’une molécule de polymère, l’intégration de tels groupements nécessite une RMN de haute résolution, les analyses sont donc réalisées sur un spectromètre 500 MHz.
La RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) montre que le couplage est total car il y a bien une molécule de Cabazitaxel pour une molécule de copolymère mPEG-PLA-Y-OH. En effet, les signaux à 3,30, 3,38 et 3,44 ppm correspondant respectivement aux OCH3 (7), OCH3 (PEG) et OCH3 (10), intègrent chacun pour 3 protons. De plus, entre 2,75 et 3,10 ppm les signaux du lien bis β-thiopropionate intègrent pour 8 protons (Figure 55). De plus, le profil en SEC est monomodal à 14 405 g/mol, avec un indice de polydispersité de 1,12, ce qui montre qu’il y a une seule population.

Etude de libération du Cabazitaxel in vitro à différents pH

Méthodologie d’analyses des échantillons par UPLC

Le Cabazitaxel a une limite de solubilité de 8 µg/mL, à 25°C en milieu aqueux. Les études de  libération étant menées en milieu tampon, c’est-à-dire en milieu aqueux, les échantillons ne doivent pas dépasser cette valeur pour une libération maximale de 100 %. Les tampons utilisés sont le phosphate buffer salin (PBS) pH 7,4 et l’acétate pH 5,5.
La solution de nanoparticules à 5 mg/mL (en conjugué) est diluée en milieu tampon pH 7,4 et 5,5, pour obtenir une concentration finale en Cabazitaxel de 7 µg/mL. Les échantillons sont incubés à 37°C, température du corps humain. Ils sont ensuite analysés par UPLC couplé à un détecteur UV, après quelques heures en milieu tampon, puis tous les jours et ce sur 7 jours. Afin de pouvoir quantifier le Cabazitaxel libéré au cours des études, une courbe de calibration a été réalisée. Pour chaque série d’analyses, un témoin de concentration connue a été injecté afin de confirmer l’exactitude des résultats obtenus. Avant chaque analyse UPLC, les échantillons sont centrifugés pour séparer le surnageant des NPs. Afin de vérifier que la centrifugation n’entraine pas le Cabazitaxel avec le polymère, des nanoparticules de mPEG-PLA-Y-OH ont été réalisées, puis du Cabazitaxel a été ajouté. La quantité de Cabazitaxel ajoutée est retrouvée que ce soit directement et même après centrifugation. La centrifugation n’entraine donc pas le Cabazitaxel avec les NPs. De plus, une analyse par spectrométrie de masse a aussi été réalisée sur une solution de Cabazitaxel à pH 5,5 (à 37°C pendant plusieurs jours) et il n’y a pas de dégradation du Cabazitaxel dans ces conditions.

Comportement des conjugués pH sensible

L’analyse UPLC du conjugué linéaire, représenté Figure 57, montre qu’il n’y a pas de libération de Cabazitaxel à pH 7,4 et pH 5,5 après 7 jours. Une analyse du filtrat par spectrométrie de masse a, quant à elle, montré la présence de Cabazitaxel (1,55 min). Cette analyse étant plus sensible que la détection UV, la quantité de Cabazitaxel observée doit être inférieure à la limite de détection de l’analyse UPLC.
Concernant le conjugué Y, l’analyse UPLC montre que 3 % de Cabazitaxel a été libéré à pH 7,4 au bout de 7 jours. En revanche à pH 5,5, aucune libération n’est observée. Une analyse du filtrat par spectrométrie de masse a montré la présence de Cabazitaxel (1,55 min). La comparaison entre le pic d’ionisation à pH 7,4 et pH 5,5, montre bien qu’il y a plus de Cabazitaxel libéré à pH 7,4 qu’à pH 5,5.
A pH 7,4, le conjugué Y libère une quantité supérieure de Cabazitaxel, bien que très faible, en comparaison du conjugué L. Cette observation suggère qu’il y a un impact de la structure sur la libération, puisque le Cabazitaxel et le lien β-thiopropionate sont situés à l’interface hydrophile-hydrophobe et par conséquent plus susceptibles d’être hydrolysés, que dans le cas du linéaire. Malheureusement et contrairement à ce qui était attendu, il n’y a pas de libération à pH 5,5.
Les études menées sur les conjugués avec un lien acétal indirect (Figure 58) ont, quant à elles, montré une libération de 80 et 65 % à pH 7,4 et pH 5 respectivement, qui n’est pas attribuée au caractère pH sensible du lien mais à la présence de la fonction carbonate qui est instable.

Etat de l’art sur la déstructuration de (co)polymère via un lien pH sensible

Il existe différents degrés de déstructuration. En effet, le motif pH sensible peut être (i) réparti tout au long de la chaine de polymère ou (ii) entre les deux blocs. Les différents liens utilisés entre le copolymère et le principe actif, rencontrés dans la partie A, peuvent être utilisés pour la déstructuration de copolymères.

Liens pH sensibles distribués le long de la chaine de polymère

Dans la littérature, un certain nombre de polymères linéaires ont été publiés dans lesquels le monomère est lié par des unités cétal, acétal, et cis-aconityl.[46,50–53] L’avantage est qu’en conditions acides, le polymère est totalement dégradé, ce qui permet au principe actif de se dissocier plus facilement de l’ossature du polymère, augmentant ainsi sa libération.[46] Zhu et al. ont synthétisé un copolymère tribloc amphiphile de type PEG-PCL-PEG avec des liens oximes dispersés tout au long de la chaine de PCL (PEG-OPCL-PEG).[54] Le bloc OPCL est obtenu à partir de la polycaprolactone diol, suite à la fonctionnalisation des deux fonctions hydroxyles par le 4-carboxybenzaldéhyde, suivi par une réaction de polycondensation entre les fonctions aldéhydes terminales et l’O,O′-1,3-propanediyl-bis-hydroxylamine (Figure 65). Un signal vers 10 ppm en RMN 1H indique l’introduction des fonctions aldéhydes. Ce signal disparait après la formation des liens oximes, confirmant ainsi l’obtention du bloc OPCL. Les fonctions bis-oxyamines terminales sont ensuite couplées au PEG portant une fonction benzaldéhyde (PEG-CHO) pour donner le copolymère final PEG-OPCL-PEG.
Une étude de libération a permis de montrer que la DOX (encapsulée physiquement) était libérée plus rapidement à pH 5,0 qu’à 7,4 (après 100 h, 80 % et 20 % respectivement).
Le lien β-thiopropionate (cf partie A) a aussi été incorporé au sein de la chaine de copolymères pour induire la déstructuration totale du copolymère à pH acide.[38–40] Ghosh a notamment décrit la synthèse en une seule étape, d’un copolymère tribloc ABA amphiphile avec des motifs β-thiopropionates entre les deux blocs mais aussi de façon périodique au sein du polymère hydrophobe (Figure 66).[39] Une réaction de type thiol-ène entre un thiol hydrophobe et un dérivé acrylate hydrophile permet de générer des liens β-thiopropionates, donnant naissance à un polymère hydrophobe contenant les liens pH sensibles. Les fonctions thiols terminales sont ensuite fonctionnalisées par du PEG-acrylate via la même réaction.
Grâce à des tests à différents pH, la libération du pyrène encapsulé lors de la micellisation a permis de montrer le caractère pH sensible des liens β-thiopropionates. La dégradation du copolymère se traduit par la déstructuration de la micelle et donc une libération importante de l’agent encapsulé. Après 70 h, la libération du pyrène est de 80 % à pH acide (5,3) et nulle à pH 7,0. En GPC, l’apparition de molécules de faible poids moléculaire a permis de conclure à la désintégration du copolymère. En revanche, celle-ci est beaucoup plus lente que la libération du pyrène. Cette différence peut s’expliquer par le détachement en faible nombre du PEG, qui génère ainsi des canaux dans lesquels le pyrène peut être libéré par diffusion engendrant une libération plus rapide de celui-ci en comparaison de la quantité de PEG détaché.

Lien pH sensible incorporé entre deux blocs de copolymère

Le lien pH sensible peut aussi être situé entre les deux blocs d’un copolymère amphiphile, en particulier entre un polymère hydrophile de type PEG et un polymère hydrophobe de type polyester. La déstructuration des copolymères entraine une déPEGylation et donc une agrégation des micelles.

DéPEGylation

Comme il a été discuté dans l’introduction générale, décorer les NPs par du PEG offre de nombreux avantages. En effet, le PEG est biocompatible. De plus, il offre aux NPs une meilleure stabilité en milieu biologique et prolonge leurs temps de circulation dans le sang. Néanmoins, des travaux récents indiquent que l’introduction de chaînes de PEG à la surface des NPs diminue l’endocytose et gène leur incorporation au sein des cellules. Dans plusieurs publications, il est observé que le détachement du PEG facilite l’absorption cellulaire.[47–49] Il est donc important de trouver un bon équilibre entre PEGylation et déPEGylation.
Nous avons pris à titre d’exemple, une étude menée sur un copolymère de type PEG-PCL lié par un lien peptidique, dont la rupture est observée en présence de gélatinase. L’impact de la déPEGylation sur la taille et la stabilité des NPs et sur leur biodistribution au sein des cellules a été démontré.[55]
Plusieurs techniques analytiques permettent de mettre en avant la rupture du bloc PEG. L’une des caractéristiques principales de la déPEGylation est la formation d’agrégats, qui peut être mesurée par une analyse DLS ou SEM (scanning electron microscopy). En effet, lorsque les NPs sont dans la zone tumorale, la liaison entre les deux blocs est coupée sous l’action d’un stimuli. En absence de PEG, les parties hydrophobes s’agglomèrent formant ainsi des agrégats, ce qui conduit à une meilleure endocytose (Figure 67). Lorsque le Docétaxel (DOC) est encapsulé de façon physique au cœur de la NP, sa libération est plus importante lorsqu’il y a eu détachement du PEG (80 % vs 60 % après 100 h). Des mesures par fluorescence lors d’une étude in vivo sur des souris ont prouvé que la biodistribution des NPs au sein des tumeurs était plus importante après déPEGylation, entrainant ainsi une diminution de la taille de la tumeur de 55 % après 21 jours (vs 40 % sans lien stimuli dépendant).

Exemples

Dans les exemples décrits ci-dessous, des études de libération sont menées sur des micelles dans lesquelles le principe actif est encapsulé de façon physique au cœur de celles-ci via des interactions hydrophobes.
Wang et al. ont développé un copolymère amphiphile tribloc de type ABA constitué de PEG et de PCL lié via des liens acétals pH sensibles (PCL-a-PEG-a-PCL) (Figure 68).[56] La synthèse de ce copolymère se décompose en trois étapes. Les polymères sont synthétisés séparément puis assemblés par une réaction de click entre les fonctions azotures et propargyliques. Dans un premier temps, le PEG(OH)2 est fonctionnalisé à ces deux extrémités par des groupements azotures contenant un lien acétal, pour cela les fonctions hydroxyles du polymère sont dérivés avec le 2-chloroéthyl éther vinylique (CEVE), conduisant à la formation de la fonction acétal puis substitution du chlore par l’azoture de sodium pour donner le N3-acétal-PEG-acétal-N3. Des analyses RMN 1H, 13C et FT-IR ont permis de caractériser l’introduction de la fonction acétal et la présence du groupement azoture. Dans un deuxième temps, la ROP de l’ε-caprolactone amorcée par l’alcool propargylique et catalysée par l’octanoate d’étain a permis d’obtenir le bloc PCL-propargylique. La réaction de click entre ces deux polymères est suivie par GPC. Après dialyse, la présence unique d’un produit de plus haute masse confirme la formation du tribloc. Une caractérisation RMN 1H a aussi été réalisée.
La dégradation du copolymère tribloc via l’hydrolyse des fonctions acétals situées entre les blocs hydrophile-hydrophobe a été évaluée en condition acide (20 mg de copolymère dans 10 mL d’une solution d’HCl à 0,1 M) et suivie par GPC. La partie soluble correspond au poids moléculaire du PEG, ce qui montre que l’hydrolyse des liens acétals est plus rapide que la dégradation du polyester. Une analyse DLS à pH 5,0 a montré une augmentation de la taille des NPs, allant de 96 nm à 700 nm après 96 h. Cela peut s’expliquer par l’agrégation des parties hydrophobes (PCL) due à la rupture des fonctions acétals et la perte des chaines de PEG. Le caractère pH dépendant des liens acétals a aussi été démontré grâce à la libération de la DOX, qui est de 80 % à pH 5,0 et seulement de 20 % à pH 7,4 après 60h.
F. Zhu et al. ont décrit la synthèse d’un copolymère amphiphile de type PEG-PLA avec un lien tétrahydropyrane (THP) et tétrahydrofurane (THF) entre les deux blocs (Figure 69).[57] En synthèse organique, ces deux liens sont souvent utilisés comme groupements protecteurs, mais rarement employés dans la synthèse de copolymères comme liens pH sensibles.[18,58] Les deux copolymères PEG-THP-PLA et PEG-THF-PLA ont été synthétisés avec succès et caractérisés par RMN 1H et GPC.
La libération de la DOX a été suivie par fluorescence à pH 7,4 et 5,0. A pH acide, 62 % est libéré pour les micelles PEG-THP-PLA et 69 % pour les micelles PEG-THF-PLA après 100 h, alors qu’à pH neutre la libération n’est que de 16 et 20 % respectivement. La liaison THF est donc un peu plus sensible que la liaison THP. Sans lien pH sensible, la libération est inférieure à 7 % quel que soit le pH. Des mesures DLS ont été réalisées à pH 6,8 et une augmentation du diamètre des micelles a été observée (62 nm à 258 nm après 10 h). Ce changement est attribué à la coupure du lien THF, qui entraine le détachement du PEG (hydrophile) et conduit à l’agrégation des cœurs PLA (hydrophobe). En comparaison, après 35 jours dans des conditions neutres, aucune variation significative n’est observée.
Très récemment, Wang et al. ont décrit la synthèse d’un copolymère PEG-PLA lié par une liaison amide dégradable en milieu acide (Figure 70).[59] Dans un premier temps, le PEG réagit avec l’anhydride 2-propionique-3-méthylmaléique pour conduire au PEG-CDM. Sa structure a été confirmée par RMN 1H et 13C. L’anhydride réagit ensuite avec le 6-amine-1-hexanol pour donner le PEG-Dlinkm-OH. L’intégration des CH2 du Dlinkm et du 6-amine-1-hexanol confirme que la réaction est totale. Le copolymère PEG-Dlinkm-PDLLA est enfin obtenu par polymérisation du D,L-lactide par amorçage de la fonction alcool du PEG-Dlinkm-OH, dont la structure et la pureté ont été confirmées par GPC et RMN.
Différents tests ont été réalisés afin de vérifier le caractère pH dépendant de la fonction amide. A pH 6.5, le profil SEC devient bimodal ce qui indique le détachement de la partie PEG. Cela a aussi été prouvé par une analyse RMN 1H qui montre l’apparition d’un nouveau signal à 2.63 ppm caractéristique d’un CH2-NH2. Après 24h, la rupture du PEG est de 15 % à pH 7,4, 60 % à pH 6,5 et 70 % à pH 5,5. Des analyses DLS et TEM ont montré qu’il n’y avait pas d’augmentation de taille et donc pas de formation d’agrégats. En revanche, le potentiel zéta change en fonction du pH. A pH 7,4, il est de -12 mV et ne varie pas, alors qu’à pH 6,5, il augmente à cause de la formation de groupements amino cationiques générés lors du détachement de la partie PEG. Le fait qu’il n’y ait pas de formation d’agrégats est sûrement dû à des répulsions électrostatiques entre les fonctions ammoniums présentes à la surface des NPs. Un test cellulaire a permis de montrer qu’il y avait une internalisation cellulaire plus efficace après déPEGylation.

Nanoparticules avec des sites de reconnaissance : Ciblage actif des zones cancéreuses

Etat de l’art sur le ciblage

Comme discuté précédemment dans l’introduction générale, les propriétés de surface des NPs peuvent être modifiées par une couronne de PEG, rendant ainsi les NPs « furtives » afin d’éviter la capture des NPs par les MPS (Figure 90). Cette modification permet principalement de prolonger leur temps de circulation dans le sang. Grâce à l’effet EPR, les NPs vont s’accumuler préférentiellement dans certains sites biologiques, comme les tumeurs et les inflammations. Ce phénomène est appelé ciblage passif. Néanmoins, ce type de ciblage est limité à ces zones biologiques.[1,2]
D’autres stratégies ont été développées pour diriger précisément les NPs vers les tissus tumoraux. Ce mode de ciblage, appelé ciblage actif, est réalisé grâce à la présence de récepteurs surexprimés à la surface de certains types de cellules, comme par exemple les cellules cancéreuses (Figure 91). Les NPs sont alors équipées de ligands capables de reconnaître spécifiquement ces récepteurs, ainsi le ligand va jouer le rôle de « tête chercheuse ». De nombreux outils et techniques sont actuellement disponibles pour équiper les NPs de ligands et permettre un ciblage actif. Il est intéressant de noter que ce mode de ciblage n’est pas uniquement limité au cancer, mais peut être applicable à diverses maladies associées à la surexpression de récepteurs.[1]
La fonctionnalisation des NPs par un ligand peut être réalisée par deux méthodes (Figure 92). La première consiste à coupler le ligand au copolymère avant d’effectuer la nanoformulation (pré-fonctionnalisation). La seconde consiste à coupler le ligand à la surface de la NP déjà nanoformulée (post-assemblage). Comme l’ont démontré Diou et al. [3] via des analyses IRM 19F de NPs de PEG-PLA contenant du bromure de perfluorooctyle (PFOB), ces deux méthodes n’impactent pas la distribution des NPs. Néanmoins, dans certains cas et selon la nature du ligand, la post-fonctionnalisation permet une capture cellulaire plus efficace, en raison d’une meilleure disponibilité du ligand.[4]
La fonctionnalisation des NPs peut avoir un effet négatif au niveau de la « furtivité » des NPs. En effet, l’introduction de ligands à la surface peut perturber le rôle de la couronne de PEG et induire des phénomènes d’opsonisation. La couronne de PEG peut aussi gêner la reconnaissance ligand-récepteur, à cause de l’encombrement stérique.[4] De plus, augmenter le nombre de ligands à la surface des NPs ne permet pas toujours d’améliorer le ciblage (Figure 93). Ce problème n’est pas directement lié à la quantité de ligands à la surface des NPs, mais à la distance entre les récepteurs présents à la surface des cellules qui peut, dû à des contraintes stériques, empêcher la formation des intéractions ligand-récepteur de manières multiples et simultanées.[5] Il est donc important de trouver un juste milieu, afin d’avoir une quantité suffisante de ligands pour permettre un ciblage actif efficace, sans une utilisation excessive qui pourrait engendrer des effets néfastes, comme une perte de la furtivité.
De nombreux ligands existent pour réaliser un ciblage actif. Ces ligands peuvent être de diverses natures, comme par exemple des anticorps monoclonaux (mAb), des peptides, des aptamères, des oligosaccharides ainsi que certaines petites molécules.[2]
Les NPs constituées de PEG-PLA ont largement été fonctionnalisées avec différents ligands, comme des aptamères[6,7], des peptides[3,8,9], des oligosaccharides[10]…, pour permettre de cibler spécifiquement certaines tumeurs. Dans la catégorie des petites molécules, les ligands les plus utilisés sont l’acide folique et la biotine (Figure 94). L’acide folique (FA) est un ligand très utilisé. Les récepteurs foliques sont surexprimés à la surface des cellules cancéreuses dans une grande variété de cancer, comme le cancer de la peau, du sein, des ovaires, du cerveau, des reins… Cette surexpression est la réponse d’une demande plus élevée en folate pour la synthèse de l’ADN. La biotine permet, quant à elle, de cibler les récepteurs avidines et strepavidines surexprimés dans le cancer du cerveau, du sein, colorectal et dans le cas de lymphome.
Les NPs de PEG-PLA fonctionnalisées par l’acide folique peuvent ainsi s’accumuler au niveau des tumeurs cancéreuses augmentant la concentration en principe actif. C’est ce qu’ont, par exemple, démontré Hsiue et al. en synthétisant un copolymère PEG-PLA fonctionnalisé par un ligand folate (Figure 95).[11] Dans un premier temps, le copolymère PEG-PLA est synthétisé par ROP du lactide amorcée par un PEG-NHBoc. La fonction amine est ensuite déprotégée en présence de palladium (Pd) pour donner le copolymère PLA-PEG-NH2. La fonction amine du copolymère est utilisée pour introduire le ligand folate, préalablement dérivé par une fonction N-hydroxysuccinimide (Folate-NHS) permettant un couplage efficace des deux partenaires. Le conjugué d’environ 5 000 g/mol a pu être caractérisé par RMN 1H et SEC.
L’efficacité du ciblage par le ligand folate a pu être mise en évidence via différentes analyses. En effet, l’accumulation des NPs au sein des tumeurs inoculées chez des souris a été suivie par imagerie grâce à la présence de ligand fluorescent Cy5.5 à la surface des NPs. Cette méthode permet de conclure à une accumulation deux fois plus élevée des NPs fonctionnalisées par l’acide folique par rapport aux NPs sans ligand. De plus, l’effet du ciblage a pu être étudié sur la taille de la tumeur. En effet, une diminution du volume de la tumeur d’environ 80 % a été observée après 25 jours pour les NPs folate, contre 60 % sans ligand.
L’acide folique et la biotine ont été utilisés récemment par Couvreur et al. pour décorer des NPs de PEG-PLA via une méthode simple de chimie click (Figure 96).[12] Le copolymère PEG-PLA portant une fonction azoture à l’extrémité du bloc PEG est obtenu par ROP du lactide amorcée par un hydroxy-PEG-azoture (N3-PEG-OH). Les ligands fonctionnalisés par des fonctions alcynes sont couplés au PLA-PEG-N3 par une réaction de chimie click. L’efficacité du couplage pour les deux ligands a été estimée à 76 % par RMN 1H. Pour ces études, des NPs contenant différents ratios de PEG-PLA-fonctionnalisés avec FA (de 0 à 31 mol %) et avec la biotine (de 0 à 76 mol %) ont été préparées pour estimer l’efficacité du ciblage de ces NPs et déterminer le taux de fonctionnalisation optimal pour assurer la meilleure reconnaissance. Pour ce faire, des tests de reconnaissance ont été entrepris par spectroscopie SPR (surface plasmon resonance) permettant de mesurer l’affinité d’interaction ligand-récepteur (cf III.2). Les résultats indiquent que l’efficacité de la reconnaissance est optimale pour les NPs contenant 14 mol % de PEG-PLA-FA et 20 mol % de PEG-PLA-biotine. Au-delà de ce pourcentage, une diminution est observée. Cela peut s’expliquer par un trop grand nombre de ligands à la surface des NPs qui engendre l’interaction d’une NP à plusieurs récepteurs. L’ajout de sondes fluorescentes a permis de suivre le ciblage des NPs contenant 17 mol % de FA. La quantité de NPs au sein de la tumeur est cinq fois plus importante, en comparaison des NPs sans ligand. Ces résultats montrent bien l’impact d’un ciblage actif vs ciblage passif. Un ciblage actif permet d‘augmenter la concentration en NPs dans la tumeur, ce qui permettrait d’accroître la concentration en principe actif et ainsi d’améliorer l’efficacité du traitement.
L’efficacité des différents ligands introduits à la surface des NPs a été démontrée grâce à des études en imagerie. Certains exemples seront discutés dans la partie B de ce chapitre.

Préparation des nanoparticules biotinylées et étude de reconnaissance

Préparation et caractérisation des nanoparticules biotinylées

Le copolymère mPEG-PLA-biotine a été synthétisé selon le protocole décrit par Shakeshell (Figure 97).[13] Dans un premier temps, la biotine-NHS (commerciale) est couplée à la fonction amine du HO-PEG-NH2. La fonction hydroxyle est ensuite engagée en tant qu’amorceur pour la ROP du lactide catalysée par le système TU/spartéine. Le copolymère biotine-PEG-PLA d’une masse d’environ 12 000 g/mol a été caractérisé par RMN 1H et SEC.[13]
Différentes quantités de copolymère biotine-PEG-PLA sont mélangées au copolymère mPEG-PLA-diglycolyl-cabazitaxel [14] de structure Y et L de masse équivalente (12 000 g/mol), dont la synthèse est détaillée dans l’introduction générale, avec différents ratios (100/0, 95/5, 80/20 et 60/40) (Figure 98). Après nanoprécipitation, des NPs contenant à la fois du principe actif et différentes quantités de ligands sont obtenues.
Une analyse DLS est ensuite réalisée afin de déterminer le diamètre moyen des NPs. Les NPs issues des différents mélanges biotine-PEG-PLA avec les conjugués Y et L ont un diamètre moyen compris entre 65 et 90 nm. Ces résultats indiquent que la présence du Cabazitaxel et de la biotine ne perturbe pas la nanoformulation. De plus, le diamètre des NPs avec et sans biotine est similaire, comme le montre l’analyse des conjugués Y avec 0 et 5 % de biotine-PEG-PLA (Figure 99).

Etude de reconnaissance : BIAcore

Les NPs contenant différents ratios de biotine ont ensuite été analysées par BIAcore, qui est le nom commercial de l’appareil permettant de mesurer les interactions ligand/récepteur. Cette technique repose sur le principe de la SPR (Surface Plasmon Resonnance). Le but de ces études est de mesurer l’affinité ligand-récepteur et de déterminer la quantité de biotine nécessaire pour avoir le ciblage le plus efficace.
Les récepteurs sont immobilisés à la surface d’une couche de dextran déposée sur une surface métallique (or, argent, etc.) (Figure 100). La solution à analyser est ensuite injectée sous flux continu, traversant le BIAcore. Un faisceau de lumière polarisée monochromatique est dirigé sur la surface du BIAcore. La variation de l’indice de réfraction, mesuré en continu, permet de déterminer et de suivre en temps réel la fixation du ligand aux récepteurs fixés à la surface métallique, à l’aide d’un détecteur. Le résultat est alors exprimé en unité de résonance (RU) en fonction du temps. Au début de l’injection, lorsque le ligand se lie au récepteur, la valeur de l’indice de réfraction augmente. A la fin de l’injection, un plateau est alors obtenu. La variation de l’indice de réfraction est proportionnelle à la quantité de ligands fixés aux récepteurs. Dans nos études, nous avons mesuré l’affinité des ligands biotines à l’aide de cette technique. La surface est constituée d’une matrice de dextran carboxyméthylé, pré immobilisé avec une molécule d’ADN simple brin conjugué à la streptavidine.
Les NPs à 5 mg/mL contenant différents ratios de PEG-PLA-diglycolyl-Cabazitaxel (structure Y et L) / biotine-PEG-PLA (100/0, 95/5, 80/20 et 60/40) ont été analysées par spectroscopie SPR, par une équipe de Sanofi à Strasbourg. Les résultats obtenus avec les ratios PEG-PLA-diglycolyl-Cabazitaxel (structure Y) / biotine-PEG-PLA (100/0, 95/5, 80/20 et 60/40) sont représentés dans le graphique suivant (Figure 101).
Figure 101 : Graphique représentant les résultats obtenus par spectroscopie SPR en fonction du ratio de biotine-PEG-PLA
Lorsqu’il n’y a pas de ligand biotine (ratio 100/0), l’analyse SPR donne une valeur quasi nulle, ce qui indique que sans biotine il n’y a pas d’affinité avec les récepteurs stepavidines. Les NPs contenant 5, 20 et 40 % de biotine-PEG-PLA montrent que la quantité optimale de biotine nécessaire pour avoir le meilleur ciblage est de 5 %. Au-delà, le signal diminue ce qui suggère que l’affinité de liaison est moins importante. Comme discuté précédemment (cf I), cette observation n’est pas surprenante et peut être expliquée par l’effet de distance qui existe entre les récepteurs (Figure 102). Une très faible quantité de copolymère biotinylé permet d’obtenir un bon ciblage.
Les résultats obtenus avec la structure L (Figure 101) indiquent qu’une quantité de 0 et 5 % en copolymère biotinylé ne permet pas d’obtenir une réponse en SPR, ce qui montre que 5 % n’est pas suffisant pour obtenir un ciblage efficace. Dans le cas du linéaire, 20 % de biotine-PEG-PLA semble conduire à un meilleur ciblage puisqu’au-delà l’affinité diminue.
Pour avoir une affinité équivalente, dans le cas de la structure Y et L, la quantité de copolymère biotinylé n’est pas la même. Dans le cas de la structure Y, seuls 5 % de biotine-PEG-PLA sont nécessaires contre 20 % avec le linéaire. Cette différence peut s’expliquer par la densité de PEG, qui peut être impactée par la position du principe actif à l’interface ou au cœur de la NP (Figure 103). En effet, lorsque le Cabazitaxel est situé à l’interface, la densité de surface de PEG est plus faible que lorsque celui-ci est positionné au cœur de la NP, ce qui peut entraîner une meilleure disponibilité de la biotine. Ainsi, la présence du principe actif à l’interface hydrophile / hydrophobe ne perturbe pas le ciblage et permet de diminuer la quantité de biotine requise pour un ciblage actif efficace.

Introduction générale

L’imagerie médicale est un outil indispensable pour le diagnostic de diverses maladies. Cela consiste à mettre en image (en deux ou trois dimensions) différentes régions ou organes du corps humain. L’imagerie médicale regroupe un ensemble de techniques (Figure 104), comme la radiologie, qui utilise les rayons X pour visualiser généralement les os ; l’échographie, qui se sert des ultrasons pour observer par exemple le fœtus ; l’imagerie par résonance magnétique (IRM) basée sur la différence de vitesse de relaxation des protons des molécules d’eau, qui permet d’obtenir un contraste entre deux tissus à teneur en eau différente ; l’imagerie nucléaire basée sur l’utilisation de radioéléments, comprenant la Tomographie d’Emission de Positons (TEP) et la Tomographie par Emission Monophotonique (TEMP) ; et l’imagerie optique basée sur la fluorescence. Certaines de ces techniques utilisent ou ont recours à des sondes ou des agents de contraste, comme la fluorescence, l’imagerie nucléaire ou encore l’IRM.
Les NPs sont utilisées dans plusieurs types d’imagerie pour le dépistage, la détection précoce, le diagnostic et le traitement des diverses maladies, comme le cancer.[1] Cette large utilisation est due à deux principales caractéristiques : leur taille et leur capacité à transporter une grande variété de molécules. De plus, il est possible d’utiliser simultanément plusieurs sondes d’imagerie dans la même nanoparticule, permettant de fournir des informations complémentaires pour le diagnostic précis d’une maladie, ce que l’on nomme imagerie multimodale.

Etat de l’art : PEG-PLA pour l’imagerie médicale

Il existe dans la littérature plusieurs exemples de copolymères PEG-PLA utilisant des sondes pour l’imagerie. Les agents d’imagerie peuvent être encapsulés physiquement au cœur de la NP ou lié de façon covalente au copolymère.

Sondes d’imagerie encapsulées physiquement

Plusieurs publications décrivent l’utilisation de sondes encapsulées au cœur des NPs de copolymères PEG-PLA, lors du processus de nanofomulation. La plupart d’entre eux concerne des agents d’imagerie pour des applications en fluorescence.
Zhu et al. ont synthétisé un fluorophore proche infra-rouge (en anglais NIR (Near Infra-Red) fluorophore) le dicyanométhylène-4H-pyrane (DCM-NH2) lié à un principe actif de type Camptothécine (CPT) par un pont disulfure (DCM-S-CPT) (Figure 105), pour suivre par fluorescence la libération in vivo de la CPT.[15] L’utilisation simultanée d’un principe actif et d’un agent d’imagerie se nomme communément théranostic. Cette technique est attrayante car elle permet de surveiller l’administration et le processus de libération du principe actif, puisque les signaux de fluorescence peuvent être activés en même temps que la libération de celui-ci.[16–19] A ce jour, la majorité des fluorophores employés ne peuvent pas être détectés in vivo à cause de leur courte longueur d’onde d’émission. L’utilisation de fluorophore NIR est préférable, car les photons NIR peuvent pénétrer en profondeur la peau et les tissus sans les endommager, mais ils restent encore quelques points à améliorer, comme la photostabilité, avant d’avoir un réel suivi in vivo.[15]
La coupure du pont disulfure de DCM-S-CPT par le glutathion (GSH), suivie par une cyclisation intramoléculaire, conduit à la libération de DCM-NH2 et CPT (Figure 106). Cette rupture a été confirmée par spectrométrie de masse à haute résolution. Le DCM-S-CPT (non fluorescent) est alors transformé en DCM-NH2 (fluorescent), cette caractéristique a été démontrée par une mesure de la fluorescence.
Des résultats prometteurs ayant été obtenus in vitro, les auteurs ont entrepris des études in vivo dans lesquelles les NPs PEG-PLA/DCM-S-CPT ont été comparées aux NPs PEG-PLA/DCM-C-CPT (sans pont disulfure) sur des souris porteuses de tumeurs. Sur une coupe de 10 µm d’épaisseur de la tumeur, la fluorescence avec PEG-PLA/DCM-S-CPT s’est avérée forte et homogène, en comparaison des résultats obtenus avec PEG-PLA/DCM-C-CPT où la fluorescence est faible et inégale. Cette étude prouve que les NPs PEG-PLA/DCM-S-CPT peuvent pénétrer profondément dans la tumeur et libérer le DCM-S-CPT après l’endocytose des NPs dans les cellules cancéreuses, puisqu’il y a bien rupture de la liaison disulfure pour libérer le DCM-NH2 et la CPT.
Pour le même type d’imagerie, l’utilisation d’iodure de 1,10-dioctadécyle tétraméthyle indotricarbocyanine (DiR) (Figure 107) avec des copolymères PEG-PLA a fait l’objet de plusieurs publications.[9,20,21]
Chen et al. ont, par exemple, décrit l’utilisation de DiR pour évaluer l’efficacité du ciblage d’une tumeur chez la souris, grâce à l’utilisation de NPs décorées en surface par un ligand de nature peptidique (CooP). [9] L’intensité de la fluorescence observée au niveau des tumeurs pour les CooP-NP-DiR, en comparaison des NP-DiR, confirme que le ciblage a un impact sur la distribution des NPs dans l’organisme. Ce même type d’approche a permis à Mader et al. d’étudier l’influence de la taille des NPs sur leur accumulation au sein des tissus cancéreux, en combinant des études in vivo et ex vivo.[21] Grâce aux mesures de fluorescence, il a été démontré que les NPs de 111 et 141 nm de diamètre étaient efficacement accumulées dans les tumeurs, alors qu’avec un diamètre de 166 nm, elles étaient rapidement éliminées par le foie. D’autres agents fluorescents tels que le Pyrène[22] ou encore la Rhodamine[23] peuvent être utilisés pour des applications en fluorescence.
Pour des applications en IRM du 19Fluor, le bromure de perfluorooctyle (PFOB) est l’une des sondes les plus utilisées.[3,24] L’IRM 19F a de nombreux avantages, en comparaison avec l’IRM 1H. De part un spin ½ et un rapport gyromagnétique très proche, ces deux techniques peuvent être réalisées sur un seul et même appareil. De plus, le 19F ne se trouve qu’à l’état de traces dans les tissus biologiques, ce qui permet d’avoir un signal unique et spécifique limitant ainsi le bruit de fond. Diou et al. ont synthétisé des NPs de PEG-PLA contenant du PFOB, avec à leur surface un ligand peptidique de type acide arginine-glycine-acide aspartique, noté RGD.[3] Cette exemple, comme décrit dans la partie ciblage (cf A. I), a permis grâce à des analyses IRM 19F réalisées sur des souris porteuses de tumeurs de conclure que l’introduction de ligands à la surface des NPs par pré ou post fonctionnalisation n’impactaient pas sur la distribution des NPs.

Sondes d’imagerie covalentes

Il existe dans la littérature plusieurs exemples d’agents d’imagerie liés chimiquement à des NPs de copolymère PEG-PLA. Certains peuvent être liés à la surface des NPs en bout de chaine de PEG ou bien à l’extrémité du bloc hydrophobe.
Couvreur et al. ont décrit une méthode simple de décoration de NPs, par des ligands de ciblage et des agents fluorescents de type FP547 et FP682, grâce à l’utilisation de la chimie click (Figure 108).[12] Le copolymère PEG-PLA portant une fonction azoture à l’extrémité du bloc PEG est obtenu par ROP du lactide amorcée par un PEG-azoture (N3-PEG-OH). Les sondes FP547 et FP682, fonctionnalisées par des fonctions alcynes, sont couplées au PLA-PEG-N3 par une réaction de chimie click. Les copolymères PLA-b-PEG-FP547 et PLA-b-PEG-FP682 ont été caractérisés par RMN 1H et SEC. L’efficacité du couplage n’a pas été déterminée pour ces deux sondes, néanmoins il est bon de noter que la réaction de chimie click avec l’acide folique est efficace à 76 % – 90 % avec l’anisamide. La nanoformulation de mélanges de plusieurs copolymères (PEG-PLA, PLA-PEG-ligand et PLA-PEG-sonde fluorescente) a été réalisée. L’utilisation d’une faible quantité (~2-3 mol %) de PLA-PEG-b-FP547 est nécessaire pour suivre les nanoparticules par fluorescence. L’utilisation simultanée des ligands et de sondes fluorescentes a permis de suivre le ciblage des cellules cancéreuses par fluorescence.

Table des matières

Chapitre I Synthèse et évaluation de conjugués PEG-PLA pH sensibles 
A. Préparation de conjugués PEG-PLA/Cabazitaxel avec un lien pH sensible pour la libération contrôlée de Principe Actif
I. Introduction
II. Etat de l’art sur les systèmes stimuli dépendants
1. Système pH sensible : Définition
2. Liens pH sensible
a. Lien Acétal
b. Lien Hydrazone
c. Lien β-thiopropionate
III. Objectif
IV. Synthèse des conjugués pH sensibles
1. Synthèse de conjugués PEG-PLA / Cabazitaxel avec un lien acétal et hydrazone (Sanofi Genzyme)
a. Lien Hydrazone
b. Lien acétal
i. Acétal direct
ii. Acétal indirect
2. Synthèse de conjugués PEG-PLA / Cabazitaxel avec un lien β-thiopropionate
a. Voie A : Synthèse des conjugués par thiol-ène addition
i. Fonctionnalisation –SH
i.1. Fonctionnalisation du Cabazitaxel
i.2. Fonctionnalisation du copolymère
ii. Fonctionnalisation du copolymère par une fonction acrylate
iii. Réaction de thiol-ène addition entre le Cabazitaxel fonctionnalisé –SH et le copolymère acrylate
b. Voie B : Fonctionnalisation d’acide
V. Etudes de libération
1. Préparation des nanoparticules avec les conjugués Y et Linéaire
2. Etude de libération du Cabazitaxel in vitro à différents pH
a. Méthodologie d’analyses des échantillons par UPLC
b. Comportement des conjugués pH sensible
c. Influence de la nature de la macromolécule et du principe actif sur la stabilité du lien pH sensible
i. Influence de la macromolécule
ii. Influence du Cabazitaxel
d. Influence de la structure du lien : mono β-thiopropionate Cabazitaxel et 1-Pyrèneméthanol
VI. Conclusion
B. Déstructuration du Copolymère
I. Introduction
II. Etat de l’art sur la déstructuration de (co)polymère via un lien pH sensibl
1. Liens pH sensibles distribués le long de la chaine de polymère
2. Lien pH sensible incorporé entre deux blocs de copolymère
a. DéPEGylation
b. Exemple
III. Objectifs
IV. Etat de l’art sur les esters boroniques
V. Synthèse et étude de liaison ester boronique
1. Motif 1,3-diol
2. Motif catéchol
a. Echelle moléculaire-polymère
b. Echelle polymère-polymère
c. Large excès de PEG-catéchol
VI. Conclusion
Références
Partie Expérimentale
Chapitre II Nanoparticules PEG-PLA fonctionnalisées pour des applications en Ciblage et en Imagerie
A. Nanoparticules avec des sites de reconnaissance : Ciblage actif des zones cancéreuses
I. Etat de l’art sur le ciblage
II. Objectifs
III. Préparation des nanoparticules biotinylées et étude de reconnaissance
1. Préparation et caractérisation des nanoparticules biotinylées
2. Etude de reconnaissance : BIAcore
IV. Conclusion
B. Nanoparticules incorporant une sonde d’Imagerie
I. Introduction générale
II. Etat de l’art : PEG-PLA pour l’imagerie médicale
1. Sondes d’imagerie encapsulées physiquement
2. Sondes d’imagerie covalentes
III. Objectif général
IV. Synthèse de conjugués mPEG-PLA avec un ligand Desferroxiamine 89Zr pour des applications en Tomographie par Emission de Positons (TEP)
1. Introduction
2. Présentation de la technique TEP, le choix de la sonde ainsi que son utilisation
a. Présentation de la technique TEP
b. Choix de la sonde
c. DFO-89Zr 
3. Objectif
4. Synthèse de conjugués PEG-PLA desferrioxamine pour marquage au 89Zr
a. Voie A : Réaction classique utilisée pour fonctionnaliser des anticorps avec la DFO
i. Etape 1 : Synthèse du N-succinyl-DFO
ii. Etapes 2 et 3 : Complexation/Estérification
iii. Etape 4 : Couplage avec copolymère-OH
b. Voie B : Chimie Click
i. Chimie click : définition
ii. Synthèse des conjugués DFO par réaction de chimie click
ii.1. Fonctionnalisation de la Desferrioxamine
ii.2. Fonctionnalisation du copolymère
ii.3. Réaction de chimie click entre un copolymère alcyne et un [Fe]DFO-azoture
5. Nanoformulation
6. Conclusion
V. Synthèse et étude de conjugués mPEG-PLA-pyrène pour des applications en Fluorescence
1. Principe de la fluorescence et ses applications
2. Synthèse des conjugués mPEG-PLA-pyrène (Y et L) et étude de fluorescence
3. Conclusions
VI. Conclusions et Perspectives .
Références
Partie Expérimentale
Chapitre III Evaluation de nouveaux catalyseurs organiques de type bipyridinium pour la ROP del’ε-caprolactone 
I. Introduction Polymère biodégradable (polyester : PLA et PCL)
II. Préparation de polymères biodégradables
1. Polycondensation et ROP
2. Catalyseurs pour la ROP de monomères cycliques 
a. ROP par catalyse organo-métallique
b. ROP par catalyse organique
i. Activation Catonique / Acide
ii. Activation Nucléophile / Basique
iii. Activation bifonctionnelle
III. Etude du phénomène de coopérativité avec un catalyseur donneur de liaison hydrogène ionique pour la ROP de l’ε-caprolactone
1. Etat de l’art sur l’activation par liaison hydrogène
2. Objectif
3. Synthèse des sels de (bi)pyridinium
a. Synthèse des sels de pyridiniums
b. Synthèse des différents sels de bipyridinium
i. Bipyridiniums di-protonés/di-cationiques
ii. Bipyridiniums mono-protonés / mono-cationiques
iii. Bipyridinium mono-protoné / di-cationique
4. Application des sels de (bi)pyridinium en ROP
a. Etude de la coopérativité de deux liaisons NH+X–
b. Etude de la ROP de l’ ε-caprolactone catalysée par 2,2’-bipyridinium camphorsulfonate IV
c. Influence des substituants et du contre-ion sur l’activité en ROP
IV. Conclusion générale.
Références 

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