Evaluation de l’activité broncho relaxant et anti-inflammatoire de l’extrait par des tests in vivo

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Evaluation de l’activité de l’extrait vis-à-vis de la broncho constriction et de l’inflammation par des tests in vivo:

Evaluation de l’activité de l’extrait sur la broncho constriction:

La broncho constriction induite par l’histamine est le modèle courant pour tester un produit agissant sur l’obstruction de voie aérienne induite par un antigène (CHAUHAN N. et coll., 2012). Cette étude a pour objectif d’évaluer l’effet inhibiteur de l’extrait sur des cas de gêne respiratoire induit par l’histamine. Les variations de l’amplitude de la respiration du cobaye au cours des tests ont été enregistrées en utilisant « la capsule de Marey » (MAREY E-J., 1878). Le principe est basé sur la variation de pression créée, par la respiration de l’animal, dans une capsule cylindrique munie d’une membrane en caoutchouc. Cette pression a été ensuite transmise par un levier articulé, à un stylet (figure 1) qui enregistre les variations sur une bande de papier enroulée autour du tambour (MAREY E-J., 1878).

Des cochons d’inde pesant entre 250g et 350g ont été anesthésiés par une injection intramusculaire de kétamine (80mg/kg de poids vif) et immobilisés sous une lampe chauffante de 400watts, pour maintenir sa température stable. Puis, une des veines jugulaires a été cathétérisée pour administrer les produits. Enfin, la trachée a été cathéterisée avec un tuyau en silicone relié à la capsule et au stylet enregistreur du tambour de Marey (figure 1).

Evaluation de l’activité anti inflammatoire de l’extrait:

L’inflammation des bronches est permanente chez l’asthmatique, même dans les formes récentes et légères (MATHIEU M. et MICHEL M., 2009).
Pour évaluer les propriétés de l’extrait sur l’inflammation expérimentale, un œdème a été provoqué par injection d’un agent phlogogène chez la souris (WOLFGANG H. V. et coll., 2002). Dans cette étude, une solution de carragenine a été utilisée (HARRIS J.M. et SPENCER P.S.J., 1962).
L’évolution de l’inflammation a été suivie en mesurant le volume de la patte avec un pléthysmomètre UGO BASILE (CHATTER R. R. et coll., 2011).

La carragénine à 2% (masse/volume) a été préparée dans une solution de NaCl à 0,9% (masse/volume) (SINGH G. D. et coll., 2006 ; SULAIMAN M. R.et coll., 2008).
Des souris de race SWISS pesant entre 25 et 30 g ont été utilisées. Elles ont été réparties en 5 lots de 5 souris et ont été mises à jeun, mais ont eu accès libre à l’eau, 12 heures avant le début du test.
Le premier lot a servi de témoin et a reçu de l’eau distillée. Les animaux du deuxième et du troisième lot ont été respectivement traités avec 100 et 200mg/kg d’extrait dissout dans de l’eau distillée. Les animaux du quatrième lot ont été traités avec 100mg/kg d’acide acétylsalicylique. Tous les produits ont été dissous dans de l’eau distillée et administrés par gavage à raison de 10ml/kg.
Une heure après l’administration de ces produits, 100μl de solution de carragénine ont été injectées dans la voûte plantaire de la patte gauche de chaque souris (figure3). Le volume de la patte a été mesuré à 0, 30, 60minutes puis, à 2 et 3 heures après cette injection (HARRIS J.M. et SPENCER P.S.J., 1962).

Le volume de l’œdème (VT) a été obtenu par la différence entre le volume obtenu au temps t après injection de la carragénine et celui de la patte normale (avant l’injection de la carragénine). La comparaison du VT des lots traités avec l’extrait, à celui du lot témoin ayant reçu de l’eau distillée a permis d’évaluer l’activité anti-inflammatoire de l’extrait (CHATTER R. R. et coll., 2011).

Evaluation de l’activité spasmolytique de l’extrait sur des trachées isolées de cochon d’Inde:

L’objectif de cette manipulation a été d’évaluer l’effet de l’extrait vis-à-vis de deux médiateurs spasmogènes : l’acétylcholine et l’histamine, sur des trachées isolées de cobaye.
Des cochons d’Inde mâle et femelle, pesant entre 250 et 350 g, ont été utilisés dans tous les tests. L’animal a été assommé par un coup sec sur la nuque et exsanguiné en coupant les carotides ensuite, la trachée a été prélevée.
L’organe a été placé dans une boîte de pétri contenant une solution de Tyrode à la température de 37°C et barbotée avec de l’air, la composition de cette solution physiologique a été (mM) de: NaCl : 137, KCl : 2.7, CaCl2 : 2.5, MgCl2 : 1.0, NaHCO3 : 11.9, NaH2PO4 : 0.4 et glucose : 11.1. L’organe a été débarrassé des mésentères et des tissus adipeux puis, découpé en spirale de 3cm de longueur et de 0,5cm de largeur (BRUNELLESCHI S. et coll., 1987 ; HAZEKAMP A. et coll., 2001). La préparation a été ensuite montée dans une cuve à organe de 15ml, contenant du Tyrode (figure 4). Il a été relié à un stylet qui a enregistré sa contraction sur une bande de papier enroulée autour d’un tambour.

Evaluation de l’activité de l’extrait sur la trachée isolée pré-contractée à l’histamine et à l’acétylcholine:

Une fois monté dans la cuve à organe isolé, la trachée a été soumise à un contre poids de 1,5 g (ANITA A. M. et ARCHANA N. P., 2008) et laissé s’équilibrer pendant 90 minutes (fig.5b). Durant cette période, la solution de Tyrode a été changée toutes les 15 minutes.
Après 90 minutes, la viabilité et la sensibilité de l’organe ont été testées en ajoutant 15µl d’Histamine à 10-1M dans le bain pour obtenir une concentration finale de 10-4M. Puis, l’organe a été rincé trois fois et laissé se stabiliser de nouveau. Pendant ce temps, le milieu de survie a été renouvelé toutes les 15 minutes.

Après 90 minutes, lorsque la trachée a retrouvé sa tension initiale, 15µl d’une solution d’histamine à 10- 1M ont été ajoutés dans le bain de façon à obtenir une concentration finale de 10-4M d’histamine pour contracter l’organe. Au plateau de la contraction, 75µl, 150µl ,150µl ,150µl et 150µl d’extrait à 10mg.ml-1 ont été ajoutés cumulativement dans le bain pour atteindre des concentrations finales croissantes et cumulatives allant de 0,05 à 0,45mg/ml. Le volume total des solutions ajoutées dans le bain n’a pas dépassé 5 % du volume total de la cuve (VAN ROSSUM J. M., 1963). Puis, l’organe a été rincé toutes les 5 minutes jusqu’à ce que la tension revienne à l’initiale (VAN ROSSUM J. M., 1963). Soixante-quinze µl d’acétylcholine à 10-1M ont été ensuite ajoutés dans le bain de façon à obtenir une concentration finale de 5×10-4M pour contracter l’organe. Au plateau de la contraction, les mêmes concentrations croissantes et cumulatives allant de 0,05 à 0,45 mg/ml de l’extrait ont été testées.

Evaluation de l’effet de l’extrait vis-à-vis de l’histamine:

Dans cette étude, l’organe a été soumis à un contre poids de 1,5g (ANITA A. M. et ARCHANA N. P., 2008) et laissé s’équilibrer dans la solution de Tyrode pendant 90 minutes. Ce temps d’équilibration a été entrecoupé par des renouvèlements du Tyrode toutes les 15 minutes.
A la fin de cette période, 15µl d’Histamine à 10-1M ont été ajoutés dans le bain pour obtenir une concentration finale de 10-4 M dans le bain afin de tester la viabilité et la sensibilité de l’organe. Puis, l’organe a été rincé toutes les 15 minutes pendant 90 minutes de rééquilibration.
Lorsque la tension initiale de la trachée a été retrouvée, des solutions d’histamine ont été ajoutées cumulativement dans le bain. Les volumes ayant été injectés et les concentrations dans le bain correspondants sont présentés dans le tableau III.

Résultats des tests in vivo :

Activité de l’extrait sur la broncho constriction :

L’injection répétée de l’histamine chez l’animal aboutit à des réponses de voie aérienne pratiquement identiques : l’histamine (8µg/kg) diminue l’amplitude respiratoire des cochons d’Inde. Ces diminutions sont passagères. Elles commencent à environ 3 secondes après l’injection et sont maximales après 15 secondes. L’amplitude de la respiration retourne à ses valeurs initiales après 3 à 5 minutes (Figure5).
Amplitude (mm)

Avant l’injection de l’histamine, l’amplitude normale moyenne de la respiration est de 11,50±1,76mm. Après l’injection de l’histamine, cette amplitude devient 7,25±0,95mm en absence de l’extrait. La différence entre l’amplitude normale et celle obtenue après avoir injecté l’histamine correspond à la diminution de l’amplitude de la respiration considérée comme 100%. La variation des amplitudes respiratoires par rapport à cette référence, en présence de l’extrait ou du tolpropamine, est présentée dans la figure ci-dessous (figure 6). Plus la diminution des amplitudes induite par l’histamine en présence de l’extrait est faible (c’est-à-dire tend vers 0%), plus l’activité inhibitrice de l’extrait vis-à-vis du spasme induit par l’histamine est forte.
En présence de 10 et de 15mg/kg d’extrait et par rapport à la référence 100%, la baisse d’amplitude de la respiration induite par l’histamine tend à se réduire. Cette réduction est significative en présence de 25mg/kg d’extrait (p<0,05). L’injection intraveineuse de 0,20 mg/kg de tolpropamine produit une réduction significative de 73,62±6,05% de cette baisse d’amplitude respiratoire (p<0,05). D’après ces résultats, l’extrait est capable de s’opposer aux contractions des bronches provoquées par l’histamine.

Activité anti inflammatoire de l’extrait :

L’injection de la carragénine provoque une inflammation de la patte se manifestant par une augmention du volume de la patte. L’œdème provoqué par la carragénine s’accroît et devient maximal après 60 minutes, temps à partir duquel, il commence à diminuer (figure 7).
La moyenne du volume normal de la patte est de 240±10µl. Après l’injection de la carragénine, ce volume est égal à 340±20µl ce qui correspond à un œdème (VT) égal à 100µl pour tous les lots. L’évolution du VT des souris traitées ou non avec une dose unique d’extrait est présentée dans la figure ci-dessous (figure 7). Plus le VT est faible par rapport à celle du témoin, plus l’activité anti-inflammatoire est forte.

A la 180 ème minute, le volume de l’œdème respectif atteint des valeurs minimales de 100±10 et 40±20µl chez les souris traitées avec 100 et 200 mg/kg d’extrait, tandis que celui du lot témoin reste à une valeur élevée de 440±40µl (figure 7).

Activité spasmolytique de l’extrait sur la trachée isolée de cochon d’inde

Effet de l’extrait sur la trachée isolée pré-contractée à l’histamine et à l’acétylcholine

En absence des extraits testés, la contraction provoquée par les agents contracturant (histamine et acétylcholine) est considérée comme référence égale à 100%. L’injection de l’extrait réduit l’amplitude de ces contractions suivant la concentration de l’extrait dans le bain (figure 8).
L’injection de l’acétylcholine dans le bain provoque une contraction d’amplitude égale à 5,50±0,76mm. Les variations de cette amplitude ne sont pas significatives en présence de l’extrait à des concentrations croissantes, allant de 0,05 à 0,45mg/ml, dans le bain.

L’injection d’histamine provoque une contraction de la trachée isolée dont l’amplitude est égale à 11,84±0,73mm. L’injection de l’extrait à une concentration de 0,45mg/ml dans le bain diminue cette amplitude qui devient 1,00±0,88mm (p<0,05) ce qui correspond à 91,55±0,60 % du relâchement maximal.
Le relâchement des trachées isolées en fonction de la concentration de l’extrait dans la cuve contenant l’organe isolé est présenté dans la figure 9. D’après cette figure, le relâchement augmente suivant la concentration de l’extrait dans le bain (p<0,05). La concentration efficace de l’extrait donnant 50% du relâchement maximale est égale à 0,2 ± 0,04mg/ml.
L’analyse de ces résultats montre que l’extrait relâche les trachées isolées pré contractées avec de l’histamine.

Effet inhibiteur de l’extrait et de la pyrilamine sur la contraction des muscles lisses bronchiques induite par l’histamine

Ce second modèle de contraction musculaire bronchique permet d’évaluer l’effet d’un prétraitement avec de l’extrait sur la contraction de la trachée induite par une concentration croissante d’histamine. L’histamine contracte la trachée isolée dont l’amplitude maximale, considérée comme 100%, est égale à 15,13±0.47mm (figure 10).
Amax
Le prétraitement de la trachée isolée avec 50 ou 100µg/ml de l’extrait diminue la contraction provoquée par l’histamine. Cette diminution se traduit par un déplacement vers la droite de la courbe contraction en fonction de la concentration d’histamine testée (figure 11). L’effet maximal est atteint, quelque soit la concentration de l’extrait testée dans le bain. Par ailleurs, le prétraitement de la trachée isolée avec du pyrilamine, un antagoniste des récepteurs histaminique, diminue l’amplitude de contraction.

Table des matières

INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
I- Animaux d’expérience :
II- L’extrait à tester :
III-Etude phytochimique :
IV-Evaluation de l’activité broncho relaxant et anti-inflammatoire de l’extrait par des tests in vivo
IVA-Evaluation de l’activité de l’extrait sur la broncho constriction:
IVB-Evaluation de l’activité anti inflammatoire de l’extrait:
V-Evaluation de l’activité spasmolytique de l’extrait sur des trachées isolées de cochon d’inde
VA-Evaluation de l’activité broncho relaxant de l’extrait sur la trachée isolée pré-contractée à l’histamine et à l’acétylcholine:
VB – Evaluation de l’effet de l’extrait vis-à-vis de l’histamine:
VI-TEST DE TOXICITE :
VII-Analyse statistique:
RESULTATS
I- Etude phytochimique
III- Résultats des tests in vivo
IIIA-Activité broncho relaxant de l’extrait
IIIB- Activité anti inflammatoire de l’extrait
IV-Activité spasmolytique de l’extrait sur la trachée isolée de cochon d’inde
IVA-Effet relaxant de l’extrait sur la trachée isolée pré-contractée à l’histamine et à l’acétylcholine
IVB – Effet inhibiteur de l’extrait et de la pyrilamine sur la contraction des muscles lisses bronchiques induite par l’histamine
V- Toxicité aigue par voie orale
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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