Evaluation de l’activité antibactérienne des désinfectants sur les souches isolées

Technique de prélèvement

Les particules viables en suspension dans l’air sont aspirées, sous un volume connu et selon un débit connu, et sont soit recueillies dans un liquide, soit impactées directement sur un milieu de prélèvement ou filtrées à l’aide d’une membrane filtrante spécifique qui seront ensuite analysés au laboratoire par un dénombrement et une identification des colonies microbiennes développées sur le milieu de culture. Les résultats s’expriment en unités formant colonies par mètre-cube d’air prélevé.

Pour les dispositifs de prélèvement par impact sur gélose, on distingue les impacteurs à cribles, à un ou plusieurs étages, les impacteurs à fentes ou les impacteurs par centrifugation. Le choix d’un dispositif d’échantillonnage de l’air dépend du type de particules viables à mesurer, de la sensibilité des micro-organismes, du niveau de contamination attendu, de la capacité de détecter d’éventuels faibles niveaux de contamination, des conditions d’environnement, de la précision et de l’efficacité du prélèvement. D’autres facteurs seront pris en compte : absence de perturbation d’un flux d’air unidirectionnel, facilité de nettoyage et de désinfection, absence de contamination supplémentaire (CCLIN ; Sud-ouest, 1998).

Les différents principes de fonctionnement des appareils ne permettent pas de comparer les résultats d’un appareil à l’autre. II convient donc d’effectuer les prélèvements avec toujours le même appareil qui a été validé par l’utilisateur. Les résultats obtenus ne permettent pas de donner la contamination microbiologique exacte de l’air. Ils ne donnent que des éléments d’appréciation qualitatifs et/ou quantitatifs sur les microorganismes les plus résistants dans le milieu extérieur, qui sont en suspension dans l’air au moment du prélèvement, et qui sont viables, « non stressés » et revivifiable sur les milieux de culture choisis (MASSICOTTE, 2009).

Facteurs favorisant l’activité d’un désinfectant

En matière de désinfection, l’élément le plus important est le nettoyage préalable. L’activité de certains désinfectants dépend également des micro-organismes visés, de leurs conditions de multiplication et de leur résistance au milieu environnant et aux produits chimiques. Il faut également prendre en considération d’autres facteurs, tels que la concentration du désinfectant, le temps de contact avec les surfaces traitées, la température ambiante, etc. Le paramètre déterminant pour l’issue d’une opération de désinfection reste cependant la présence de matières organiques, car celles-ci diluent et neutralisent rapidement les produits chimiques biocides. Il faut donc procéder à un décapage vigoureux et à un curage à grande eau avant toute application de désinfectants. Ni d’importantes quantités de produits ni une application à haute pression ne sauraient remplacer un nettoyage préalable minutieux et dans les règles (KAHRS, 1995).

Résistance microbienne aux désinfectants

L’élément majeur de la résistance est la paroi de la cellule bactérienne. En effet, la majorité des désinfectants exercent leur action essentiellement au niveau de la membrane cytoplasmique et doivent donc traverser la paroi. Chez les souches devenues résistantes, ces mécanismes de passage sont altérés. Ainsi, les mycobactéries, dont la membrane externe est très épaisse, sont plus résistantes que les bactéries à Gram négatif, elles-mêmes plus résistantes que les bactéries à Gram positif. Il est important de signaler que le phénomène inverse intervient pour les virus enveloppés. Ainsi, les virus enveloppés (cas du VIH par exemple) sont plus sensibles que les virus nus (ex : Poliovirus) car leur enveloppe externe, riche en lipides, est facilement désorganisée par les antiseptiques et désinfectants, ce qui provoque leur inactivation (figure 2). La résistance microbienne aux désinfectants peut être naturelle ou acquise (BILLAST et al, 2000).

Technique en microméthode

La technique en microméthode repose sur l’utilisation de microplaques stériles de 96 puits à fond plat. La croissance bactérienne est détectée grâce à un lecteur de microplaque et un spectrophotomètre (Molecular Devices® Spectromax). Le logiciel (Molecular Devices® Soft Max Pro) permet l’exploitation des données. DRS Chaque puits de la microplaque stérile de 96 puits à fond plat (Costar®) est inoculé par une quantité déterminée (X) de la suspension bactérienne de travail et d’une même quantité (Y) d’une des dilutions du désinfectant à tester.

Les puits témoins sont inoculés par la quantité X de la suspension bactérienne de travail pour le test de fertilité ou de bouillon BHI stérile pour le test de stérilité, et de Y d’eau distillée stérile. Pour chaque souche étudiée, trois puits tests et un puits témoin de fertilité sont utilisés. Une microplaque permet de tester 23 souches en une seule analyse. La microplaque est recouverte d’un film étirable plastique puis disposée dans le lecteur programmé. Le schéma de plaque est établi et la lecture de l’absorbance à490 nm est programmée pour chaque puits toutes les cinq minutes pendant 18 heures, après agitation de la plaque thermostatée à 37 °C. Le lecteur restitue une représentation graphique de l’absorbance en fonction du temps : toute augmentation progressive des valeurs au cours du temps et pour un même puits est interprété comme une croissance bactérienne. À l’inverse, une densité optique stable et nulle sera considérée comme une absence de croissance bactérienne due à l’effet au moins bactériostatique du détergent ((ROUILLON et al,2006) ; (SCHMITT et al, 2009)).

Discussion

Assurer la sécurité de ses activités et prévenir le risque infectieux sont parmi les objectifs de la démarche qualité instaurée au LRDEHM. Cette maitrise ne peut être obtenue que par le renforcement et l’application de bonnes pratiques d’hygiène et de désinfection efficace. En tenant compte de la résistance des bactéries vis-à-vis de produits biocides, qui ne cesse de croitre au fil du temps, nous avons réalisé cette étude durant laquelle nous avons d’abord contrôlé la contamination de l’environnement de l’unité d’hygiène alimentaire, identifié les germes isolés, puis nous avons évalué la sensibilité des souches bactériennes identifiées vis-à-vis de différents désinfectants. 28 points ont fait l’objet d’un contrôle avant désinfection de l’environnement. Ces prélèvements ont été effectués au niveau des paillasses, des étuves et des réfrigérateurs de l’unité. La moitié des contrôles a été consacrée pour évaluer la qualité de la surface et l’autre moitié pour la surveillance de l’air. La contamination a été notée dans 26 points, soit un pourcentage de contamination globale de 92.86%. L’absence de souillure a été constatée uniquement dans deux étuves. Le pourcentage de contamination était identique pour les deux types de contrôle (92,86%). La répartition des bactéries en fonction de la coloration de Gram a montré une prédominance des bactéries à Gram positif avec un pourcentage de 94%. SCHMITT et al (2009) notent que les bactéries à Gram+, très largement dispersées dans l’environnement par l’activité humaine, sont plus résistantes à la dessiccation que celles à Gram-, et surtout si les surfaces ne subissent qu’un bionettoyage quotidien sans effet désinfectant du produit. Ils ont aussi signalé que l’environnement constitue un réservoir aux bactéries Gram positif. L’identification morphologique des bactéries isolées a révélé que les surfaces étaient plus contaminées par les bacilles notamment ceux à Gram positif (82,15%), alors que l’air était plus chargé par les cocci Gram+ (72,72%). Ces résultats ne concordent pas avec ceux mentionnés par BOTTEREL et al (2004) qui avaient trouvé une prédominance des bacilles (62%) contre un faible pourcentage de Cocci (35%). Parmi les bacilles retrouvés au niveau des surfaces, les Bacillus sp ont été les plus fréquents (57,14%), suivis par Lactobacillus (25%) et les S.non aureus (10,71%), puis S.aureus et BGNOP non pseudomonas avec un faible pourcentage (3,57%). Un résultat semblable a été obtenu par SERGE et al durant la période entre 2004 et 2005. Ils avaient trouvé un pourcentage élevé de Bacillus sp. La présence de S.aureus en faible pourcentage (3,57%) a été aussi notée par BRUN-BUISSON (1996) lors de l’identification des germes responsable des infections nosocomiales..

Table des matières

Introduction générale
Partie bibliographique
I.Contamination de la surface et adhésion microbienne
1.Mécanisme de contamination de la surface
2.Mesurage de la contamination de surface
II.Contamination de l’air
1.Sources de contamination
2.Mesurage de la contamination de l’air
III. La désinfection
1.Généralités
2.Classes, avantages et inconvénients des désinfectants
3.Mode d’action des désinfectants
4.Spectre d’activité des désinfectants
5.Facteurs favorisant l’activité d’un désinfectant
6.Résistance microbienne aux désinfectants
7.Evaluation de l’action antimicrobienne des détergents
8.Désinfection des locaux et des surfaces
9.Désinfection de l’air
Matériel et méthodes
1.Type d’étude
2.Lieu d’étude
3.Points de prélèvements
4.Prélèvements de surface et de l’air
A- Prélèvement de surface
B- Prélèvement de l’air
5.Analyse bactériologique et identification
A- Culture DRS
B- Purification et identification des cultures obtenues sur gélose MCT et sur milieu PCA
6.Evaluation de l’activité antibactérienne des désinfectants sur les souches isolées
6.1. désinfectants
6.2. Méthodes
7.Outil d’analyse
Résultats
A- Contrôle de l’environnement
1.Contrôle de surface
2.Contrôle de l’air
B- Evaluation de l’activité antibactérienne des désinfectants sur les souches isolées
1.Evaluation de l’efficacité des désinfectants sur les souches isolées des surfaces contrôlées
2.Détermination de la dilution cible
3.Détermination du temps minimal d’inhibition (TMI)
4.Evaluation de l’action antimicrobienne des désinfectants sur les souches isolées des prélèvements d’air
Discussion
Conclusions, recommandations et perspectives
Références bibliographiques

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