Soutenance mémoire
Historique du paludisme
Le Paludisme (du latin palus : marais) ou Mal-aria (en italien : mauvais air) est une maladie parasitaire endémo-épidémique provoquée par un protozoaire du genre Plasmodium. Ce parasite est transmis par la piqûre infestante d’un moustique du genre Anopheles, fortement anthropophile, dont la répartition dépasse largement les zones d’endémie palustre. Seule la femelle est hématophage ne piquant que le soir et la nuit. Il existe quatre espèces plasmodiales inféodées à l’homme : P. malariae (Laveran, 1881), P. vivax (Grassi et Feletti, 1890), P. falciparum (Welch, 1897), P. ovale (Stephens, 1922), P. knowlesi (Robert Knowles 1927).Cependant, seul P. falciparum provoque le paludisme grave pouvant entraîner la mort. Les parasites subissent un cycle asexué chez l’homme et un cycle sexué chez le moustique [16–18]. Le paludisme est la fièvre qui domine les observations cliniques à travers la période historique et c’est la quinine qui, à partir de 1663, fera l’unanimité pour la combattre. C’est ainsi que l’histoire du paludisme verra son parcours jalonné de dates, d’hommes, de découvertes, de médicaments et d’entreprises. En Egypte, 1600 avant Jésus Christ, la concordance entre les crues du Nil et l’apparition des fièvres intermittentes, l’association frissons-fièvres et splénomégalie ainsi que les mesures à prendre pour éviter l’entrée dans les maisons de vapeurs provoquant des fièvres étaient décrites dans des papyrus [19,20]. Au IVème siècle, Hippocrate parle de “fièvres atrabilaires” (à la bile noire) et donne une description précise de l’accès fébrile (avec la triade classique : frissons – fièvre – sueur) et de sa périodicité. Les Grecs et les Romains observeront deux siècles plus tard la relation entre les fièvres intermittentes et la proximité des marécages. La liaison “fièvre-marais” donne naissance au terme francophone de paludisme utilisé par Alphonse Laveran en 1893. Les Italiens quant à eux feront la liaison entre les fièvres et les miasmes transportés en l’air : Mal-aria [17,20]. Cette “fièvre des marais” aura un impact néfaste sur l’histoire du développement économique et social de certains peuples et de certaines régions du globe et contribuera au déclin des civilisations grecques et roumaines. En Afrique, en Asie, comme en Amérique, les explorateurs, les voyageurs, les missionnaires ont payé un lourd tribut à la malaria. En Algérie, la plaine de Mitidja a joui d’une triste célébrité comme tombeau de ses colons. Le percement des isthmes de Suez et de Panama, la construction de voies ferrées en Amérique, aux Indes, en Afrique noire ont été endeuillés par le paludisme [16,18,20]. L’histoire du paludisme n’est pas seulement une liste de ses méfaits, mais également le récit du progrès de nos connaissances concernant la nature de la maladie et les moyens de la combattre. Les Jésuites vivant en Equateur ont été les premiers à constater que les mineurs indiens mâchaient l’écorce d’un certain arbre lorsqu’ils sentaient venir les frissons. Ces observations seront transférées au Pérou vers les années 1630 où Francesca de Ribera, comtesse El Cinchon (seconde femme du vice-roi de Pérou) bénéficiera personnellement en 1638 des actions bienfaisantes de la plante lors de son accès fébrile. Le nom de la comtesse sera alors donné au genre botanique – Cinchona – par La Condamine et Linné au XVIIIème siècle [21,22]. En 1820, Pelletier et Caventou isolent la quinine, alcaloïde obtenu à partir de la poudre de l’écorce du quinquina. L’utilisation de la quinine ne sera codifiée (la posologie) qu’en 1834 par Maillot en Algérie [22,23]. En 1865, les semences importées par Charles Ledger en Angleterre vont plus intéresser les Hollandais qui cultivent avec succès Cinchona ledgeriana à Java [18,21,22]. Charles Louis Alphonse Laveran découvre des “animalcules” responsables du paludisme dans du sang humain en 1880 à Constantine en Algérie : le Plasmodium. Cette découverte sera renforcée par l’équipe de Ronald Ross qui a mis en évidence le parasite à l’intérieur de l’estomac de l’anophèle femelle en Inde, en 1897. Une année plus tard Giovanni Battista Grassi et Amico Bignamie établissent le cycle complet du parasite chez l’anophèle femelle en Italie. A la même année, William George MacCallum va non seulement montrer la différence entre les formes asexuées et les formes sexuées de P. falciparum, au stade sanguin de leur développement, mais également examiner la fécondation qui sera à l’origine d’un “ookinète” [24,25]. En 1948, Shortt et Garnham mettront en évidence le développement pré-érythrocytaire du Plasmodium chez l’homme [26].
Cycle biologique du Plasmodium
Le paludisme est une érythrocytopathie fébrile causée par la présence et la multiplication, dans l’organisme humain, d’une des espèces plasmodiales inféodées à l’Homme : Plasmodium falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax et P. knowlesi. La transmission du parasite (sporozoïte) à l’homme se fait par la piqûre d’un moustique femelle hématophage du genre Anopheles (Anopheles gambiae sl., A. funestus). Celui-ci passe dans le sang où il ne dure qu’une trentaine de minutes. Récemment, il a été montré que le sporozoïte traverse plusieurs autres hépatocytes avant d’en choisir un, pour son développement ultérieur [5,27,28]. Dans le cas de P. vivax, et P. ovale, certains parasites évoluent plus lentement, en fonction de l’espèce et devenant ainsi des hypnozoïtes. Ce qui retarde l’invasion du sang par les mérozoïtes. Leur incubation peut aller de 11 jours jusqu’à 4 ans. Leur évolution est bénigne mais on peut observer, comme avec P. vivax, des rechutes tardives (5 ans) [28,29]. Pour le P. falciparum, après une schizogonie hépatique qui dure 9 à16 jours, interviendra alors la formation d’un corps bleu dont sa rupture libèrera des mérozoïtes. Ces parasites vont pénétrer dans les érythrocytes où ils vont subir une schizogonie érythrocytaire pour donner respectivement le trophozoïte et le schizonte. La formation d’un corps en rosace précède à l’éclatement du globule rouge qui libère environ 8-32 mérozoïtes. Ces derniers peuvent réinfecter de nouveaux érythrocytes et poursuivre un cycle schizogonique ou évoluer vers des formes sexuées [28,29]. La durée de maturation au cours du cycle intra-érythrocytaire est caractéristique de chaque espèce dont 24 heures pour P. knowlesi, 48 heures pour P. falciparum, P. vivax et P. ovale et 72 heures pour P. malariae [28,29]. Les gamétocytes mâle et femelle, formes sexuées, dont le développement est bloqué chez l’Homme, apparaissent au bout d’un ou plusieurs cycles sanguins. Le moustique, lors d’un repas sanguin, va absorber les gamétocytes. Une exflagellation du micro-gamétocyte (mâle) permet la production de gamètes mâles dont un va féconder une macrogamète femelle et former un œuf appelé ookinète. Cet œuf va migrer dans l’épithélium digestif et donner, après une sporogonie, un oocyste dont la rupture libère des sporozoïtes. Ces parasites gagnent les glandes salivaires de l’insecte où ils deviennent infestants et prêt à être inoculés lors de la piqûre infectante. Le cycle biologique de Plasmodium peut ainsi recommencer (Figure 1) [28,29].
L’amplification isotherme induite par boucle (LAMP)
L’Alethia malaria (ex Illumigen malaria) : L’amplification isotherme induite par boucle ou Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) amplifie l’ADN et détecte la présence du parasite du paludisme avec une sensibilité de 100%. La technologie est simple, précise et facile à utiliser. C’est la seule technique moléculaire actuellement commercialisée pour le diagnostic biologique du paludisme. Elle nécessite un matériel plus simple et demande moins de temps que la PCR conventionnelle. La technique LAMP peut être utilisée pour la détection qualitative des parasites de Plasmodium (par lecture visuelle ou automatisée) et elle ne nécessite pas de thermocycleurs coûteux. Les kits LAMP actuellement commercialisés permettent seulement d’identifier P. falciparum et P. vivax. Ils ne permettent pas de distinguer les infections à P. falciparum des infections mixtes à P. falciparum. Leur sensibilité serait proche de celle de la PCR par amorces incluses et elle peut être utilisée avec un dispositif fonctionnant en temps réel [35–37].
DISCUSSION
Ce travail est le début d’une série d’évaluations entrant dans le cadre de la démarche qualité en vue de l’accréditation du LPM/HALD à la Norme ISO 15189. Il consistait en l’évaluation de la méthode microscopique de diagnostic du paludisme au LPM/HALD avec comme but d’accompagner le laboratoire dans cette démarche. L’hypothèse de ce travail était que les résultats issus du diagnostic microscopique du paludisme au LPM/HALD sont rendus avec toute la fiabilité requise pour répondre au statut de laboratoire de référence pour le diagnostic microscopique du paludisme au Sénégal. Au cours de cette étude, la valeur de la concordance variait en fonction des lames. Ainsi, sur les vingt (20) lames lues, la meilleure concordance des lecteurs, avec une valeur de 100%, a été obtenue sur huit (8/20) lames qui sont toutes des lames d’identification. De plus, sur les quatorze (14) lames d’identification, les treize (13) avaient obtenu une concordance supérieure à 50%. Ce qui pourrait s’expliquer par l’aptitude des lecteurs à pouvoir identifier facilement Plasmodium falciparum. L’unique lame d’identification qui a fait l’objet de discordance est celle de Plasmodium ovale (Po). Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les lecteurs de lames soient beaucoup moins familiers à l’identification de P. ovale qui représente moins de 2% des espèces plasmodiales qui circulent au Sénégal tel que rapporté par une étude réalisée au Sénégal, en 2018 et ainsi que notifié par le guide national de diagnostic biologique du paludisme publié au Sénégal, en 2015 [3,14]. Par contre, les résultats de cette étude ont montré que quatre (4) sur les six (6) lames d’évaluation de la DP ont obtenu une concordance inférieure à 50%. Ceci pourrait s’expliquer par la difficulté que rencontrent les techniciens à effectuer une DP. En effet, cette difficulté est même reconnue par l’OMS dans son manuel d’assurance qualité où le seuil concernant la DP est plutôt abaissé (0,4 et 0,5 pour les niveaux 2 et 1 respectivement) comparativement au seuil de l’identification (0,8 et 0,9 pour les niveaux 2 et 1 respectivement). Ainsi, l’OMS et le PNLP du Sénégal ont préconisé une nouvelle méthode de quantification des parasites du paludisme, basée sur la prise en compte obligatoire de la présence du noyau, du cytoplasme et/ou de la vacuole du parasite avant de l’identifier et de le compter pour la DP [2,3]. Nos résultats ont aussi, à travers les scores réalisés, vérifié les niveaux de compétence des lecteurs des lames. En effet, les quatre (4) lecteurs ont obtenu, sur l’identification des espèces, un score supérieur ou égal à 0,8 comparativement à la référence et un score allant de 0,2 à 0,4 sur la densité parasitaire. Ceci correspond ainsi au niveau 2 de l’OMS qui a retenu les seuils inférieurs de 0,4 pour le Niveau 2 et de 0,5 pour le Niveau 1. Ce niveau de performance atteint par les lecteurs de lames du LPM/HALD est considéré comme satisfaisant selon le manuel d’assurance qualité de l’OMS [2]. Ces résultats ont aussi vérifié la performance des lecteurs des lames qui ont obtenu une fidélité et une justesse de 100%. Cette performance a été confirmée par l’analyse détaillée de la sensibilité et de la spécificité et des indices de validité prédictive pour lesquels les lecteurs ont obtenu une sensibilité, une spécificité et des valeurs prédictives de 100%. Ce qui signifie que toutes les lames positives de même que les négatives ont été correctement identifiées par les quatre (4) lecteurs indiquant leur performance à détecter la présence ou l’absence du Plasmodium pour toutes les lames qui sont examinées au LPM/HALD. Ces résultats correspondent exactement à ceux attendus par l’OMS et le PNLP-Sénégal [2,3]. Globalement, les caractéristiques de performances mesurées durant ce travail ont montré que le LPM/HALD est en phase pour l’accréditation selon les normes ISO 15189 en relation avec le diagnostic microscopique du paludisme.
CONCLUSION
Ce travail entrant dans le cadre de l’évaluation de la méthode microscopique de diagnostic du paludisme au LPM/HALD avec comme but d’accompagner le laboratoire dans sa démarche qualité pour une accréditation selon la norme ISO 15189 a permis d’évaluer la performance du système analytique du laboratoire en vérifiant la fiabilité et l’exactitude des résultats obtenus. Il a, ainsi, permis de confirmer les difficultés liées à la quantification de la densité parasitaire soulignant la nécessité de renforcer la formation et la mise à niveau des lecteurs des lames. Il a aussi confirmé l’importance de la mise en place d’un SMQ afin d’assurer une amélioration continue du service pour la satisfaction des clients, et, enfin, il a permis de confirmer, davantage, le rôle indispensable d’une banque de lames accessible et de proximité facilitant le contrôle de qualité interne et externe en continue au laboratoire. De cette étude, il ressort que la méthode microscopique de diagnostic du paludisme adoptée par le LPM/HALD garantit des résultats avec toute la fiabilité requise pour répondre au statut de laboratoire de référence pour les lames qui sont examinées au LPM/HALD se conformant ainsi aux exigences de la norme ISO 15189 et du Programme National de Lutte contre le Paludisme au Sénégal.
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Table des matières
Introduction
Première PARTIE : Rappels bibliographiques
I. GENERALITES SUR LE PALUDISME
I.1. Historique du paludisme
I.2. Cycle biologique du Plasmodium
I.3. Classification des agents pathogènes du paludisme
I.4. La Morphologie des espèces du Plasmodium
I.5. Le Diagnostic biologique paludisme
I.5.1. Le Diagnostic parasitologique
I.5.1.1. La goutte épaisse
I.5.1.2. Le frottis mince
I.5.2. Le QBC Malaria (Quantitative Buffy Coat)
I.6. Diagnostic immunologique
I.6.1. La sérologie immuno-enzymatique : L’ELISA
I.6.2. La sérologie immuno-chromatographique : Le TDR
I.7. Diagnostic moléculaire
I.7.1. La PCR
I.7.2. L’amplification isotherme induite par boucle (LAMP) : L’Alethia malaria (ex Illumigen malaria)
II. INDICATEURS A EVALUER ET CRITERES D’EVALUATION D’UNE MÉTHODE QUALITATIVE
II.1. La variabilité inter-opérateurs/Concordance
II.2. La fidélité
II.3. La justesse
II.4. Analyse détaillée de sensibilité et de spécificité ainsi que des indices de valeurs prédictives
II..4.1. La Sensibilité (Se) et la Spécificité (Sp)
Deuxième Partie : ETUDE EXPERIMENTALE
I. CADRE D’ETUDE
II. TYPE ET PERIODE D’ETUDE
III. ECHANTILLON DE L’ETUDE
IV. TAILLE DE L’ÉCHANTILLON
V. DESCRIPTION DES VARIABLES ET COLLECTE DES DONNÉES
VI. NIVEAUX ET CRITERES DE COMPETENCE DE L’OMS
VI. ANALYSE STATISTIQUE
RESULTATS ET DISCUSSION
I. RESULTATS GENERAUX
II. CONCORDANCE DES RESULTATS OBTENUS PAR LES LECTEURS DE LAMES/MICROSCOPISTES
III. NIVEAUX DE COMPETENCE DES LECTEURS DES LAMES : SCORES OBTENUS COMPARATIVEMENT AUX REFERENCES
IV. FIDELITE ET JUSTESSE
V. PERFORMANCE DES LECTEURS
V.1. Analyse détaillée de sensibilité et spécificité et des indices de validité prédictive
V.2. Détermination de la sensibilité, la spécificité et des indices de valeurs prédictives
II. DISCUSSION
Conclusion
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………………………………..34
ANNEXES
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