ETUDES SOUS HAUTE PRESSION DE SYSTEMES BIOLOGIQUES 

Les spectromètres en temps de vol se basent sur un principe simple de sélec-tion spatio-temporelle d’un flux de neutrons. La vitesse du neutron dépend de son énergie suivant la formule 1.1.21 dérivée de la formule 1.1.2 telle que : λ = 3.956. 1 , (1.1.25) où λ est la longueur d’onde en Angström et v la vitesse du neutron. Cette re-lation simple permet de faire une sélection sur les spectromètres en temps de vol via un système de “choppers” (ou sectionneurs en français). Le temps de vol d’une énergie souhaitée est calculée et correspond à une certaine vitesse. Connaissant celle-ci deux choppers consécutifs peuvent choisir la longueur d’onde souhaitée pour faire une expérience de diffusion. Il sera à noter que toutes les harmoniques d’ordre “n” supérieures en énergie seront aussi “autorisées” à passer via ce sys-tème. Il sera donc ajouté à ce système plusieurs choppers destinés à l’élimination des longueurs d’onde harmoniques pour des considérations d’ordre géométriques. L’analogie optique serait d’obtenir un faisceau quasi-monochrome. La résolution énergétique de ce genre d’instrument dépend du design de l’ensemble de l’ins-trument de même que de sa résolution angulaire. Le temps de vol des neutrons permettra de savoir quels échanges énergétiques ils ont subi en estimant à quel temps “t + Δt” ils arrivent sur le détecteur. Un neutron gagnant de l’énergie ar-rive plus vite qu’un neutron ayant diffusé élastiquement et un neutron arrivant après aura perdu de l’énergie.

Le spectromètre multi-chopper IN5 fut construit en 1973 à l’Institut Laue-Langevin (ILL, Grenoble, France) d’après le concept de R. Scherm et T. Springer [12]. Le fonctionnement suit celui des spectromètres en temps de vol décrit précédemment. L’instrument comporte un certain nombre de caractéristiques, néanmoins nous ne survolerons que celles intéressantes pour le sujet dans le tableau 2.

Les instruments de diffusion aux petits angles et les diffractomètres peuvent être considérés comme différents néanmoins ils se basent sur le même principe de diffusion d’un faisceau quasi-monochromatique sur un objet dont on veut étudier les propriétés structurales.
L’instrument D16 (ILL, Grenoble France) [24] présente la particularité inté-ressante de pouvoir déplacer son détecteur afin d’observer à la fois l’information aux petits angles mais également l’information structurale à plus grands angles afin d’observer des facteurs de structure tels que des pics de Bragg. On pourrait voir des structures partiellement ordonnées observant le rayon de gyration mais aussi l’espace occupé par chaque couche gr‚ce aux distances de répétition dans l’espace du système. Cet instrument dispose d’un détecteur placé sur un rail circulaire (cf. Fig. 1.1.6) permettant de se placer dans l’ensemble des régions en Q accessibles que l’on souhaite explorer (cf. Tableau 1.1.6).

La haute pression reste un sujet récent mais néanmoins moins en vue en bio-logie [28]. L’une des raisons principales est que les systèmes biologiques étudiés dans leur état natif sont rarement amenés à subir ce genre de stress excepté pour les organismes extêmophiles (i.e. les organismes vivants dans des condi-tions de haute pression, haute température, basse température, haute salinité etc…). Néanmoins l’étude systématique d’un certain nombre de systèmes et de leur propriétés sous haute pression est révélateur d’un nombre d’aspects structu-raux et dynamiques non négligeables. La seconde raison provient de la difficulté technique de la haute pression en soi : il faut à la fois développer et adapter un système haute pression à la diffusion neutronique.
Les organismes vivants présents sur Terre ont trouvé les moyens de s’adapter à toutes sorte d’environnements depuis l’apparition de la vie sur terre. Comment ces différents organismes se sont adaptés aux différentes conditions de vie qu’ils affrontaient est une question passionnante. L’état actuel des recherches en haute pression laisse penser qu’un certain nombre de facteurs peuvent intervenir dans cette adaptation [27]. Provient-elle de l’adaptation des membranes cellulaires ? Et si oui en quoi sont elles différentes des membranes d’organismes similaires vivant à pression ambiante ? D’autres pistes pourraient aussi indiquer que des cofacteurs protègent les biomolécules des effets de la pression pour les stabiliser [29]. L’adaptation génétique pour produire des protéines adaptées à la pression est aussi une possibilité clé. Le champ de recherche sur l’adaptation aux condi-tions extrêmes est particulièrement vaste et nécessite une étude au cas par cas de chaque type d’organisme, chaque type d’environnement multipliant le nombre de paramètres au fur et à mesure que le nombre de conditions à tester augmente.
Deux options s’offrent à nous dans la compréhension du phénomène de l’adaptation. Nous pouvons soit tester directement des organismes provenant des fonds marins pour comprendre l’adaptation qu’ils subissent en apportant des caractérisations biochimiques, structurales, dynamiques etc… Soit aborder une approche qui est plus théorique et requiert de caractériser les effets de la pression sur des sytèmes modèles nous permettant de développer des modèles mathématiques et des comportements types en expérimentant de façon systéma-tique la multiplicité des conditions pour observer d’une façon phénomènologique mais aussi quantitative et comparative les effets de la pression. Ces deux ap-proches permettent de couvrir une partie de ce sujet extrêmement vaste tout en étant deux visions complémentaires du même sujet. Dans le cadre de ce tra-vail nous avons choisi d’aborder la partie la plus théorique du spectre de cette étude. En démarrant avec l’étude de systèmes plus simples et déjà bien caracté-risé pour les effets de la température sur ceux-ci nous pouvons nous diriger plus avant avec des systèmes et des conditions de plus en plus complexes.
Le chapitre 1.1 aborde la haute pression en diffusion neutronique pour des biosystèmes et couvre à travers d’un article accepté pour un livre sur la haute pression le cadre du travail, la technique, les corrections et quelques expériences entreprises pour développer une couverture générale sur la haute pression. La publication 2 couvre des études entreprises sur la viabilité d’un modèle ther-modynamique développé en diffusion neutronique pour étudier les transitions dynamiques. Ce papier contient les études menées sur des ensembles lipidiques dans différentes conditions expérimentales. Une étude sur l’acétylcholinestérase est décrite dans le chapitre 4 et recoupe une étude dynamique et structurale sur un des états particuliers des protéines connu sous le nom de molten-globule (globule fondu).

Pression et température standards (1bar et 298K) ne sont que des conditions particulières dans la nature qui nous entoure. En effet, des zones de pressions élevées existent tout autour de nous (fond des océans, sources hydrothermales, intérieurs planétaires,…). Au même titre que l’analyse des effets de la température, l’étude des effets de la pression, bien que peu réalisée jusqu’à présent, est donc importante et tout à fait essentielle pour une complète compréhension des molécules du vivant. Depuis quelques années, l’accélération des progrès technologiques a permis l’amélioration des techniques de mesure des propriétés des systèmes biologiques sous pression (voir, p.ex., Fourme et al., 2012). Ces développements ont suscité un intérêt accru pour ce paramètre dans de nombreux domaines fondamentaux et/ou appliqués (Rivalain et al., 2010). Pour obtenir des informations sur la dynamique moléculaire des systèmes biologiques sous haute pression hydrostatique (HP), la diffusion incohérente de neutrons est une méthode de choix même si la combinaison de la diffusion neutronique et de la HP est techniquement et analytiquement difficile. Dans cet article, nous présenterons brièvement les techniques et méthodes qui ont été mises au point pour ce type d’études. Après avoir décrit la cellule HP développée pour faire des mesures de diffusion incohérente de neutrons (permettant d’atteindre des pressions de 7kbar), des exemples de son utilisation pour l’étude de la dynamique de différents systèmes biologiques seront détaillés.

Structure, dynamique et fonction sont trois notions intimement liées pour la plupart des macromolécules biologiques. En effet, ces systèmes sont animés par une grande variété de mouvements. Ces derniers peuvent s’étaler sur des gammes de temps allant de la femto‐ seconde à la seconde avec des amplitudes pouvant être comprises entre le centième et la centaine d’Ångström. Tandis que les vibrations atomiques locales ont par exemple lieu sur des échelles de la picoseconde, la plupart des réactions enzymatiques ont des temps caractéristiques de l’ordre de la milli‐ ou de la micro‐seconde. La diffusion incohérente de neutrons nous permet de « voir » les mouvements moléculaires qui se produisent avec des amplitudes de l’ordre de l’Ångström, sur des gammes de temps allant de la pico‐ à la nano‐ seconde. Ces temps sont typiquement ceux mis en jeu pour des mouvements moléculaires locaux tels que la rupture de liaison hydrogène ; les transitions entre les excitations discrètes locales de petites sous‐unités moléculaires et les processus plus lents des mouvements collectifs de parties massives de l’ensemble macromoléculaire. Enfin, il a été proposé que ces « mouvements élémentaires locaux » pourraient aussi être à l’origine de changements conformationnels de plus grande amplitude (jusqu’à une centaine d’Ångström) se produisant sur des temps plus longs (jusqu’à la seconde) (Henzler‐Wildman et Kern, 2007). Ainsi, la diffusion de neutrons apparaît comme une technique de choix, non‐destructive, pour étudier les dynamiques des systèmes biologiques (Zaccai, 2000).
Les neutrons thermiques ou froids possèdent une énergie (respectivement 0,025eV et comprise entre 5×10‐5 et 0,025eV) et une longueur d’onde (entre 0.1 et 20Å) correspondantes aux amplitudes et énergies associées aux mouvements atomiques des macromolécules biologiques. Les neutrons ne sont pas chargés, ce qui leur permet de pénétrer profondément dans la matière et d’interagir directement avec les noyaux de celle‐ci. Comme la section efficace de diffusion incohérente des noyaux d’hydrogène domine largement celle des autres atomes et isotopes, la diffusion neutronique représente essentiellement un signal dû à la dynamique moyennée des atomes d’hydrogène. Ceux‐ci sont répartis uniformément au sein des structures biologiques et représentent près de la moitié des atomes présents dans les macromolécules. Les protons permettent donc de retracer les mouvements des groupements chimiques auxquels ils sont liés comme, par exemple, les mouvements des chaines latérales des acides aminés. Par ailleurs, il est possible de renforcer et/ou masquer le signal provenant d’une partie du système en ayant recours à la deutériation spécifique, car le deutérium donne un signal incohérent très faible par rapport à celui de l’hydrogène (de l’ordre de 40 fois moins important). Le remplacement des atomes d’hydrogène par des atomes de deutérium permet donc de masquer le signal des parties deutérées et d’accéder à la dynamique spécifique des parties hydrogénées de systèmes complexes (Wood et al., 2010).
Les interactions neutrons ‐ atomes donnent lieu à deux types de diffusion distincts : La diffusion cohérente reflète la corrélation entre la position de l’atome i au temps 0 et celle de l’atome i’ au temps t. Autrement dit, elle permet de caractériser l’interaction entre paires d’atomes différents et renseigne sur les positions des noyaux à différents temps. Elle donne donc des informations sur les effets collectifs, structuraux ou dynamiques, au sein de l’échantillon. Au contraire, la diffusion incohérente dépend de la corrélation entre la position de l’atome i au temps 0 et celle du même atome au temps t. Elle permet d’étudier les mouvements moléculaires au sein des molécules biologiques. Les interactions peuvent se faire sans ou avec transfert d’énergie, ce qui permet la distinction entre diffusion élastique, quasi‐élastique ou inélastique (Figure 1). Le pic élastique représente le signal des neutrons qui ont interagi avec l’échantillon sans échanger d’énergie avec les atomes. Il renseigne sur des mouvements locaux. Autour de ce pic, se trouve l’élargissement quasi‐élastique qui correspond à de petites quantités d’énergie transférées entre le neutron et l’atome et des mouvements de diffusion ou de rotation. Enfin, la région inélastique est associée à des transferts d’énergie finis et donne lieu à des pics clairement séparés du pic élastique qui sont associés à des excitations collectives comme des phonons.

La diffusion de neutrons fait appel à l’utilisation de grands instruments. A Grenoble, nous disposons du réacteur à haut flux de l’Institut Laue‐Langevin (ILL) (Figure 2‐A). Une trentaine d’instruments (diffractomètres, spectromètres et autres) y est accessible pour des utilisateurs internes et externes (pour plus de détails concernant les instruments et leurs caractéristiques, se reporter à www.ill.eu). Le temps de faisceau y est attribué sur demande et la sélection se fait deux fois par an.
Le spectromètre à rétrodiffusion IN13 (Figure 2‐B) est un instrument CRG (« Collaborative Research Group ») particulièrement dédié aux études biologiques1. Il est financé et géré grâce à une collaboration entre le CNR (Italie), le CEA, le CNRS et l’Université Joseph Fourier (France). Depuis 2007, de nombreux efforts ont été faits par l’équipe IN13 et les techniciens de l’ILL pour développer un équipement HP bien adapté à la diffusion neutronique. Les contraintes concernent surtout les matériaux qui peuvent être utilisés, car il faut faire un compromis entre une faible absorption de neutrons et une bonne résistance mécanique du porte‐échantillon à la pression. L’équipement, décrit dans cet article et plus en détail dans (Peters et al., 2012), est aussi à disposition pour des utilisations sur d’autres instruments de l’ILL.

L’équipement HP est piloté par un contrôleur de pression (la Figure 3 en montre une photo et une vue schématique) dont les composantes proviennent de NovaSwiss, Zurich, Suisse. La baie consiste en un multiplicateur électrique qui génère une pression ensuite transmise de façon hydrostatique à l’échantillon grâce au FluorinertTM (Sidorov et Sadykov, 2005). Deux vannes permettent de charger le multiplicateur avec le liquide. La précision de pression atteinte est de 30bar.

La cellule cylindrique (Figure 4B et C) contenant l’échantillon en solution est montée sur la canne HP (Figure 4A). Cette dernière inclut un capillaire rempli de FluorinertTM qui transmet la pression. Pour éviter que ce liquide ne gèle dans le cryostat, le capillaire est isolé thermiquement et chauffé.
La conception de la cellule reprend un design du groupe de M.C. Bellissent‐Funel (Figure 4‐ B+C) du Laboratoire Léon Brillouin (LLB) à Paris (Appavou et al., 2005). Nous avons cependant utilisé un alliage d’aluminium hautement résistant (7049‐T6) au lieu d’un alliage en cuivre‐béryllium. L’aluminium est un matériau quasi‐transparent pour les neutrons et permet donc de minimiser l’absorption des neutrons. Deux cellules ont été réalisées avec le même diamètre interne de 6mm : l’une avec un diamètre externe de 15mm permettant d’atteindre une pression de 7kbar, l’autre avec un diamètre externe de 10mm pouvant aller jusqu’à 1.5kbar. Après usinage, elles ont été autofrettées, c. à d. soumises à une haute pression qui génère une déformation plastique de la paroi interne pour augmenter la tenue en fatigue, puis anodisées pour renforcer leur résistance à l’usure.
Pour réduire le volume d’échantillon et donc diminuer les effets d’absorption et de diffusion multiple rendant le traitement de données fastidieux, un insert cylindrique en aluminium de 4mm de diamètre et de 30mm de hauteur est introduit dans la cellule. Comme la hauteur totale de la chambre intérieure de la cellule est de 60mm, le piston qui transmet la pression ne touche et n’endommage pas l’insert. Ainsi l’épaisseur de l’échantillon ne dépasse pas 1‐2mm dans toute la largeur du faisceau. La grande symétrie de la forme cylindrique simplifie le chargement de l’échantillon, le nettoyage de la cellule et le calcul des corrections dues à l’absorption et à la diffusion multiple. L’échantillon doit être en solution pour permettre une transmission homogène de la pression. Le volume nécessaire est d’environ 1ml.

L’une des difficultés expérimentales de la diffusion de neutrons découle de la faiblesse de l’interaction entre le neutron et l’atome. Sur IN13, le flux de neutrons est relativement faible (environ 2.104 neutrons/cm2/s) et la section du faisceau couramment utilisée (3 x 4 cm2) doit être réduite à cause de la forme de la cellule HP. Ainsi pour avoir des statistiques de mesure correctes, plus d’une centaine de mg d’échantillon (qui ne doit pas être cristallin ou monodisperse) est utilisée et des mesures de 5 à 10 heures par point de pression sont réalisées. De plus, pour corriger et normaliser correctement les résultats, des mesures de la cellule vide, d’une barre de vanadium et du tampon doivent être faites. Enfin, pour traiter les données, nous utilisons le logiciel DAVE.

L’un des intérêts de la haute pression est de pouvoir fournir des modèles ther-modynamiques complets des systèmes étudiés. D’un point de vue théorique un modèle a été proposé pour étudier les effets de la température sur la dynamique étudiée par diffusion neutronique afin de lier celle-ci à des paramètres de thermo-dynamiques. Néanmoins de tels modèles soulèvent d’importantes questions et méritent d’être testés sur des systèmes modèles pour vérifier leur compatibilité avec une réalité expérimentale.
Le modèle Bicout-Zaccai à été proposé [32] afin de répondre à la probléma-tique des transitions thermodynamiques à basse température de systèmes de polymères. Le modèle est basé sur la transition entre deux états thermodyna-miques non équivalents avec une transition d’ordre supérieur à un. La transition dynamique est un phénomène à l’échelle atomique où la température aux alen-tours de 200K permet un passage de mouvements très localisés et faibles à une bien plus grande liberté de mouvement passé ces températures. Le sujet de la transition dynamique a été au fil des années grandement discuté et digressé et il reste encore à ce jour au même titre que les transitions vitreuses un domaine d’intérêt. Le modèle en lui même mets en lien la différence en énergie libre de Gibbs pour passer la barrière entre deux potentiels différents pour deux popula-tions dynamiques non-équivalentes. Le modèle assume une transition entre des états purement vibratoires à des états dynamiques non-harmoniques. Ces états anharmoniques soulèvent plusieurs questions : quelle est l’énergie requise pour effectuer la transition, quelle est la vitesse à laquelle celles-ci interviennent. Ces points restent néanmoins à clarifier.
En vue de tester le modèle nous avons utilisé un lipide de référence qui a été étudié de façon exhaustive : le DMPC 14 :0 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). Ceci nous permettant d’adresser ces points en partie. L’étude est la suite d’expériences entreprises peu avant dans le groupe de recherche [31].

La protéine acétylcholinestérase est une protéine dégradant l’acétylcholine dans les synapses du cerveau permettant de faire l’interface chimique à la jonc-tion synaptique. Cette protéine est intéressante pour la recherche sur la dégra-dation des fonctions cérébrales ainsi que pour les composés organophosphorés bloquant son activité dans le cadre d’usage militaire. Cette protéine possède une très grande activité de plusieurs milliers de réactions enzymatiques par seconde, néanmoins il semble que les études structurales permettent de penser que le site actif de l’enzyme présente un état conformationnel ne permettant pas le passage de l’acétylcholine dans celle-ci. Des études en dynamique ont ensuite étés me-nées en réponse pour comprendre ce qui permet d’expliquer son fonctionnement [51, 52].
Dans le cadre de ce travail nous avons poursuivi une étude sous haute pres-sion de la dynamique de la protéine pour reproduire l’état dit de molten-globule [53] se produisant vers 1750Bar d’après des études sur l’activité menées pré-cédemment [54]. L’étude fut poursuivie avec deux techniques différentes, d’une part SANS sur l ’instrument de l’ILL D11 et d’autre part EINS sur l’instrument ILL IN13. L’investigation par diffusion aux petits angles a été menée de 1bar à 2100bar. Le rayon de gyration à 1 bar fut confirmé pour être correspondant aux bonnes proportions de monomères, dimères, tétramères pour l’ acétylcholinesté-rase humaine. Celui-ci correspondant à celui des études menées sur les cristaux d’acétylcholinestérase mesurés en diffraction. L’ expérience révèle une compres-sion globale jusqu’à 11% à 900bar suivi d’une décompression de ce point jusqu’à 2100bar. Cette décompression est synonyme d’un dépliement de la structure ter-tiaire qui est associée à cet état de molten-globule (MG). Pour compléter cette observation l’étude fut menée sur le rétrospectromètre IN13 de 1bar à 6000bar afin d’observer les différents états traversés par la protéine au cours de l’ex-périence. L’état natif (N) suivi d’un état molten-globule à 1750bar pour plus tard atteindre un état dénaturé de la protéine (U pour “unfolded”). L’ensemble suggère un passage par 4 états différents qui sont discutés dans l’article [55].