Etudes préliminaires en phylogéographie de X. cheopis à Madagascar

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Morphologie d’une puce adulte

La puce adulte ou imago est longue de 0,8 à 6,5 mm et possède un corps aplati et 3 paires de pattes lui permettant de faire des sauts (Rodhain et Perez, 1985). Son corps comporte trois parties dont la tête, le thorax et l’abdomen (Figure 2).

Puces vectrices de pathogènes

Par leur repas sanguin ou leurs fèces, certaines espèces de puces sont des vecteurs de maladies plus ou moins graves touchant les animaux et l’homme. C’est le cas de X. cheopis, vecteur de Yersinia pestis (bactérie responsable de la maladie peste), de Rickettsia typhi (bactérie responsable de la maladie typhus murin), et de Ctenocephalides felis, vecteur de Bartonella henselae (bactérie responsable de la maladie des griffes de chat) (Bitam et coll., 2010).
Dans le monde, environ 80 espèces de puces ont été trouvés naturellement infectés par la peste mais seule une petite proportion est considérée comme bons vecteurs (Gage et Kosoy, 2005 ; Eisen et Gage, 2012). A Madagascar, deux espèces sont connues comme vecteur: X. cheopis et Synopsyllus fonquerniei (Andrianaivoarimanana et coll., 2013). Ces puces s’infectent par leur repas sanguin sur un animal infecté (Chanteau, 2006).

La maladie peste

La maladie peste peut être transmise à l’homme soit par la piqûre de puces infectées soit par la transmission inter-humaine via l’inhalation d’aérosol infesté. C’est une maladie ancienne qui a causé trois pandémies majeures dans le monde. La première est appelée peste des Justiniens qui a débuté au VIème siècle et a touché les pays au pourtour de la mer méditéranéenne (Stenseth et coll., 2008). La seconde pandémie nommée peste noire est apparue en Europe au XIVème siècle. Des épidémies récurrentes se sont manifestées durant plus de 300 ans. La troisième pandémie a débuté vers le milieu du XIXème siècle en Chine puis, s’est étendue dans le monde (Stenseth et coll., 2008). C’est seulement lors de cette troisième pandémie que son agent étiologique Yersinia pestis a été découvert ainsi que ses vecteurs (Trubéa et coll., 2007). Depuis, elle est classée parmi les maladies réémergentes par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) suite à l’augmentation du nombre de cas déclarés dans le monde entre 1987 et 2001 (36 876 cas dont 2847 mortels) (Chanteau, 2006).
Actuellement, les foyers pesteux sont localisés dans quelques pays de l’Afrique, d’Asie et d’Amérique (Andrianaivoarimanana et coll., 2013). Entre 2004 et 2009, 12 503 cas de peste humaine on été déclarés dans ces pays et ont causé 843 décès (World Health Organisation, 2010). Grace aux méthodes de lutte mises en place, le nombre de cas a diminué en 2012 et est estimé à 427 dont 81 mortels (World Health Organisation, 2016).
Madagascar est le pays le plus touché par cette maladie. Elle y fut introduite en 1898 par bateau provenant d’Inde et s’est étendue à Antananarivo en 1921 (Chanteau et coll., 1998). Sa répartition dans toute l’île n’est pas homogène ; elle est généralement présente dans les régions ayant une altitude supérieure à 800 mètres (Chanteau et coll., 1998). La période épidémiologique s’étale de Septembre à Avril sur les Hautes Terres, tandis qu’à Mahajanga, elle se situe entre Juillet et Novembre (Chanteau et coll., 1998).
Deux cycles de transmission de cette maladie sont connus : le cycle selvatique et le cycle urbain (Figure 3). Le cycle selvatique implique les rongeurs sauvages qui sont les réservoirs, les puces vectrices et l’agent pathogène. Ce cycle se fait dans les milieux naturels tels que les milieux forestiers. Sa transmission se fait entre les rongeurs sauvages via la piqûre des puces infectées. Les espèces de puces connues étant impliquées dans le cycle selvatique appartiennent aux genres Paractenopsyllus, Synopsyllus et Dinopsyllus (Chanteau, 2006). Ce cycle continue jusqu’à la mort du rongeur sauvage ou quand la puce trouve une nouvelle source alimentaire comme les rats domestiques Rattus rattus (Lotfy, 2015).
Le cycle urbain implique les rats domestiques, les puces et accidentellement l’homme. Ce cycle s’effectue dans les zones d’habitation humaine. Les espèces de puces impliquées sont X. cheopis et Synopsyllus fonquerniei (Andrianaivoarimanana et coll., 2013). Une troisième espèce, Xenopsylla brasiliensis a été trouvée associée à une épidémie de peste à Mandritsara entre septembre 2013 et Janvier 2014 (Miarinjara et coll., 2016). La peste urbaine peut produire des épidémies à la fois chez l’homme et chez les animaux comme les lapins ou les chats (Trubéa et coll., 2007). Chez l’homme, elle peut se présenter sous trois formes cliniques : la peste bubonique, la peste pulmonaire et la peste septicémique et peut être mortelle en absence de traitement.

Généralités sur la phylogéographie

Depuis leur création, les êtres vivants sont soumis à des changements morphologiques et physiologiques, et de ce fait, ils évoluent. La première cause de cette évolution est la mutation des gènes qui produisent à leur tour de nouveaux caractères morphologiques et/ou physiologiques qui seront ensuite hérités par la descendance (Nei et Kumar, 2000). Le changement de séquence de ces gènes entraine le polymorphisme génétique. Ainsi, les êtres vivants sont phénotypiquement et génotypiquement polymorphes. Ces variations de gènes peuvent déterminer l’apparition de nouveaux phénotypes voire même mener au cours de l’évolution à l’apparition de nouvelles espèces (Swynghedauw et Silvestre, 2008).

La phylogéographie

Selon Avise (1998), la phylogéographie est définie comme la science qui étudie les principes et processus qui gouvernent la distribution géographique des lignées généalogiques, et en particulier, ceux mis en évidence au sein d’une espèce ou entre espèces étroitement apparentées. L’analyse et l’interprétation de cette distribution requièrent des données à partir de la génétique moléculaire, la génétique des populations, l’éthologie, la démographie, la phylogénie, la paléontologie, la géologie et la géographie historique (Avise, 2000). Le but de la phylogéographie est de comprendre comment les évenements historiques ont aidé à comprendre la dispersion géographique des gènes, des populations et des espèces. En comparant les relations évolutives entre lignées avec leur localisation géographique, il est possible de comprendre les facteurs influençant la distribution des variations génétiques (Freeland, 2005).
L’approche phylogéographique la plus utilisée est la construction d’arbre phylogénétique à partir des séquences nucléotidiques en utilisant la méthode du plus proche voisin (Neighbour-joining) basée sur la distance, les méthodes de maximum de parcimonie, maximum de vraisemblance et l’inférence bayésienne ( Emerson et Hewitt, 2005).
Etant une contraction de l’expression «génotype haploïde», le terme haplotype se définit comme la constitution génétique d’un chromosome individuel. Il peut se référer à un ensemble de marqueurs (par exemple les polymorphismes d’un seul nucléotide) qui sont statistiquement associés sur un chromosome simple (FAO 2008). Les haplotypes reflètent les variabilités génétiques des individus ou des populations au sein d’une même espèce. Ainsi, les réseaux haplotypiques sont utilisés pour évaluer la variabilité génétique intraspécifique.
La distance génétique ou similarité nucléotidique est la mesure de la divergence génétique entre deux populations ou molécules ou du degré de parenté entre espèces en fonction des différences constatées entre les séquences de gène homologue. Ainsi, elle permet d’évaluer le polymorphisme génétique. La distance génétique est obtenue par comparaison par paires de deux séquences et en comptant le nombre de nucléotides différents entre elles. Elle est estimée suivant la formule : p=nd/n où nd et n représentent respectivement le nombre de nucléotides différents entre les 2 séquences et le nombre total de nucléotides examinés ( Nei et Kumar, 2000). Mais cela ne renseigne pas sur la vraie estimation des mutations en un site donné au cours du temps. Il faut donc apporter des modifications aux valeurs de ces mesures : on parle alors de distance corrigée. La phylogéographie est appliquée dans de nombreux domaines tels que l’entomologie ( Van der Mescht et coll., 2015), la virologie (Cuevas et coll.,2012), la biologie animale (Taberlet et Bouvet, 1994) et l’écologie (Newton et coll., 1999).

Intérêts de la phylogéographie en entomologie médicale

La phylogéographie est une discipline qui peut apporter beaucoup de connaissances en entomologie médicale (discipline étudiant les Arthropodes responsables de pathologies). Elle peut offrir des informations sur la variabilité génétique de l’espèce d’insecte vecteur et sur la distribution spatiale de ses populations. Aussi, elle permet de determiner le mode de dispersion des populations d’insectes et par conséquent, d’inférer les risques épidémiologiques associés. Ces connaissances peuvent aider à développer une méthode de lutte anti-vectorielle plus efficace. En effet, le contrôle des populations de vecteurs est une arme privilégiée dans la lutte contre les maladies vectorielles. Il est évident que des recherches sur la systématique, la génétique, la biogéographie et l’écologie sont fondamentales pour améliorer les stratégies et les méthodes de lutte contre ces insectes (Aymes, 2009).

Les marqueurs moléculaires

L’étude de la phylogéographie necessite l’utilisation de marqueurs moléculaires pouvant révéler le polymorphisme génétique. Ces marqueurs peuvent être d’origine nucléaire (exemple : 28S, 18S, 16S…….) ou mitochondriale (mtCOI, mtCOII…..). Ils servent de repères pour suivre la transmission d’un segment de chromosome d’une génération à une autre (Biochard et coll., 1998). Ils permettent entre autres de quantifier la diversité génétique, de suivre les mouvements des individus, de mesurer la consanguinité, d’identifier les individus à partir des vestiges de specimens, de caractériser les nouvelles espèces et de retracer les modèles historiques de dispersion (Freeland, 2005).
Les marqueurs nucléaires ciblent l’ADN nucléaire portant des gènes hérités des deux parents. Actuellement, différents marqueurs sont disponibles pour détecter le polymorphisme de l’ADN nucléaire. Ce sont les marqueurs pour les ARN ribosomiques et les marqueurs microsatéllites. L’ADN codant pour l’ARN ribosomal est relativement bien conservé au cours de l’évolution. Ce qui en fait un outil tout à fait approprié pour une étude de phylogénie (Délandes, 1997). De plus, cette région conservée offre la possibilité de dessiner des amorces universelles utiles au séquençage d’ADN (Hillis et Dixon, 1991). Les marqueurs microsatellites sont des marqueurs détectant les variations de répétitions de l’ADN. Les régions microsatellites sont constituées par des répétitions en tandem de séquences nucléotidiques très courtes. Le polymorphisme de ces régions réside dans le nombre de ces répétitions.
Les marqueurs mitochondriaux ciblent l’ADN mitochondrial portant des gènes hérités uniquement de la mère (Avise, 1994). L’arrangement de leurs gènes apparaît très stable entre les différentes classes taxonomiques et l’évolution de la sequence de nucléotides est de 1 à 10 fois plus rapide que celle d’un ADN nucléaire (Avise et coll., 1987). Ce qui est un avantage pour les études intraspécifiques ou interspécifiques (Fotini, 2007). Du fait de leurs caractéristiques ainsi que leur abondance, leur structure simple, l’absence d’introns et de recombinaison qui facilite leur isolement, leur amplification et leur séquençage (Avise et coll., 1987), les données obtenues à partir de marqueurs mitochondriaux permettent de construire la phylogénie d’haplotypes pouvant être utilisée pour examiner la distribution géographique des lignées évolutives (Newton et coll., 1999).

Mises au point des marqueurs moléculaires

Les mises au point des marqueurs ont été effectuées par la méthode de la réaction de polymérisation en chaine (Polymerase Chain Reaction, PCR).

Principe de la PCR

La PCR est une technique de la biologie moléculaire décrite par Kary Mullis en 1986 (Mullis et coll., 1986). C’est une technique permettant de générer plusieurs copies d’une région spécifique de la séquence d’ADN dans le but de la détecter et de l’étudier. Le principe est surtout basé sur une variation de température permettant la dénaturation de l’ADN, l’hybridation des amorces et l’amplification proprement dite.
 Cycle de température.
Une réaction est composée par plusieurs cycles comportant chacun 3 étapes (Figure 4) qui peut être répétées n fois ; n étant le nombre de cycles et donnant ainsi à la fin de la réaction 2n séquences.
La dénaturation est la prémière étape durant laquelle l’ADN double brin donne deux ADN simples brins. Ceci est dû à la rupture des liaisons hydrogènes entre les bases à une haute température qui est généralement de 95°C.
L’hybridation correspond à la fixation de l’amorce sur l’extrémité 5’ de l’ADN cible dont elle est complémentaire. La spécificité de la réaction repose sur la qualité de cette étape. La température d’hybridation varie suivant le type d’amorce utilisé et est principalement fonction de la température de fusion ou melting temperature (Tm). Cette Tm peut être calculée suivant la formule (Lazur, 1993): Tm = 2°C × (nombre de base A et T) + 4°C × (nombre de base C et G) A,T, C et G représentent les bases.
La température d’hybridation est généralement inférieure d’environ 5°C à cette Tm calculée. Mais cette température d’hybridation dépend aussi d’autres facteurs tels que le pH ou la longueur des amorces. Ainsi, sa détermination se fait surtout lors des mises au point au laboratoire.
La dernière étape qui est l’élongation ou l’extension consiste à la formation de la séquence complémentaire par polymérisation des dNTPs. Cette étape nécessite la présence d’une enzyme : l’ADN polymérase appelée aussi la Taq polymérase. Elle se déroule généralement à une température égale à 72°C qui est la température optimale pour cette enzyme.
 Le mélange réactionnel ou mix.
Le mélange est composé de plusieurs éléments dont :
– L’ADN matriciel : c’est le fragment d’ADN contenant la région cible et elle sert de matrice pour la formation de copies de cette région.
– Les amorces ou primers : ce sont des séquences composées de 10 à 30 nucléotides et sont complémentaires de la région à amplifier. Ils sont de 2 types les amorces forward et reverse.
– Les dNTPs sont composés du mélange de : dATP, dGTP, dCTP et dTTP qui sont les unités utilisées par la Taq polymérase lors de l’élongation.
– La Taq polymérase est une enzyme catalysant l’addition de dNTPs lors de l’élongation. Elle provient d’une bactérie Thermus aquaticus qui est résistante à une température de plus de 100°C. Elle a une activité 5’ vers 3’ et son activité maximale est atteinte à 72°C.
– La solution tampon permet de maintenir le pH stable. Elle contient plusieurs composants comme le Mg2+ qui est un cofacteur de l’ADN polymérase.

Les réactifs et matériels utilisés

Les réactifs utilisés

 One Taq® 2X Master mix (BioLabs, New England) un kit contenant les différents réactifs necessaires pour la réaction PCR (Annexe 2)
 Eau stérile
 Sérum albumine bovine ou BSA (Sigma-Aldrich) 5%
 Marqueur de taille (Promega) : permet de connaitre la taille des amplicons obtenus
 Bleu de charge (Promega) : permet de suivre la migration durant l’électrophorèse
 Bromure d’ethidium ou BET

Les marqueurs mis au point par PCR

Lors de cette étude, trois marqueurs mitochondriaux (COI, COI-tailed et COII) et un marqueur nucléaire (28S) (Sigma-Aldrich) ont été mis au point (Tableau 1). Le marqueur COI-tailed est composé d’un mélange d’amorces COI à queue M13 permettant d’amplifier une même région au niveau du gène codant pour le cytochrome oxydase 1 (COI). Elles sont utilisées en alternatives aux amorces COI classiques qui sont succeptibles de former des dimères pouvant être incorporées dans la réaction de séquençage. Ces dimères obstruent les 30-40 premières bases cibles de l’extrémité 5’ des séquences (Ivanova et coll., 2007).
Le marqueur COII amplifie une région au niveau du gène codant pour la sous unité II du cytochrome oxydase. C’est un marqueur mitochondrial très utilisé en phylogénie et phylogéographie.
Le marqueur nucléaire 28S amplifie une région très conservée du gène codant l’ARN 28S et il est approprié pour faire une étude en phylogénie/phylogéographie (Hillis at Dixon, 1991, Mallatt et Sullivan, 1998).

Etudes préliminaires en phylogéographie de X. cheopis à Madagascar

Après les mises au point PCR des différents marqueurs, une étude préliminaire en phylogéographie a été effectuée. Ce genre d’étude nécessite l’acquisition des séquences nucléotidiques issues des différentes régions testées qui serviront de jeux de données pour les analyses bioinformatiques. L’étude de la diversité génétique et phylogéographique de X. cheopis a été faite suivant 3 étapes : l’amplification PCR, le séquençage et le traitement de données de séquences.

Principe du séquençage d’ADN

C’est un procédé permettant de déterminer l’agencement des acides nucléiques dans une séquence d’ADN. Deux techniques peuvent être utilisées pour ce séquençage : celle de Sanger (Sanger et coll., 1977) et la technique de Maxam et Gilbert (Maxam & Gilbert, 1977).
La méthode de Maxam et Gilbert découverte en 1977 est une méthode de séquençage chimique (Maxam & Gilbert, 1977). Elle présente des inconvenients du fait que les réactifs utilisés peuvent produire des effets néfastes sur la santé.
Le séquençage par la méthode de Sanger (1977) qui est une technique de séquençage enzymatique a été utilisé lors de cette étude. La methode repose sur l’allongement par l’ADN polymérase d’un brin complémentaire à partir d’une amorce en utilisant un brin d’ADN matriciel. Elle est réalisée en présence de dNTPs et de son analogue qui est le didésoxyribonucléioside triphosphate (ou ddNTP) jouant le rôle de terminateur de la chaîne et empêchant ainsi l’élongation de se poursuivre. Cela donne alors un mélange de fragments de diverses tailles se terminant par des ddNTPs permettant ainsi de déterminer la position de chaque base dans la séquence. Ces fragments sont ensuite visualisés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou sur un séquenceur capillaire (Mauger, 2012 ; Sanger et coll., 1977).

Amplification avec les marqueurs COI-tailed

Parmi les marqueurs mis au point, nous avons choisi d’utiliser ce marqueur COI-tailed pour plusieurs raisons. Premièrement, ce marqueur est un mélange de plusieurs amorces qui ciblent la même région du COI. Son utilisation permet d’anticiper les variations nucléotidiques possibles dans cette région et par conséquent, assure l’obtention d’amplifiats pour le séquençage. Deuxièmement, ce marqueur étant actuellement testé par d’autres collaborateurs internationaux, son utilisation permet d’obtenir des données de séquences qui seront combinables avec celles des autres pays collaborateurs pour des études phylogéographiques plus poussées et à l’échelle mondiale. La composition du mélange réactionnel est présentée dans le tableau 9 suivant.

Table des matières

LISTE DES ANNEXES
I. INTRODUCTION
II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A. Puces
1. Cycle de développement
2. Morphologie d’une puce adulte
3. Puces vectrices de pathogènes
B. La maladie peste
C. Généralités sur la phylogéographie
1. La phylogéographie
2. Intérêts de la phylogéographie en entomologie médicale
D. Les marqueurs moléculaires
III. MATERIELS ET METHODES
A. Les sites d’études
B. Identification morphologique des spécimens
C. Extraction d’ADN
1. Principe
2. Matériels et réactifs utilisés
3. Méthode
D. Mises au point des marqueurs moléculaires
1. Principe de la PCR
2. Les réactifs et matériels utilisés
3. Mise au point par PCR du marqueur COI
4. Mise au point par PCR du marqueur COI-tailed
5. Mise au point par PCR du marqueur COII
6. Mise au point par PCR du marqueur 28S
7. Détection des amplifiats PCR
E. Etudes préliminaires en phylogéographie de X. cheopis à Madagascar
1. Principe du séquençage d’ADN
2. Amplification avec les marqueurs COI-tailed
3. Séquençage
4. Traitement bioinformatique des données
IV. RESULTATS
A. Extraction d’ADN
B. Les conditions optimales pour les différents marqueurs
1. Mise au point par PCR du marqueur COI
2. Mise au point par PCR du marqueur COI-tailed
3. Mise au point par PCR du marqueur COII
4. Mise au point par PCR du marqueur 28S
C. Diversité génétique et phylogéographie de X. cheopis
1. Amplification avec le marqueur COI-tailed
2. Profils des électrophorégrammes après séquençage
3. Traitement bioinformatique des données
V. DISCUSSION
VI. CONCLUSION
VII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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