Etudes moléculaires de Bacillus anthracis 

Cycle biologique

Le cycle de vie de B. anthracisnécessite l‟infection d‟hôtes mammifères. Schématiquement, les herbivores ingèrent des spores présentes dans le sol. (Lindeque et Turnbull, 1994).
Les spores entrent en phase de germination au sein de l‟hôte pour donner naissance à la forme végétative de la bactérie. Les bacilles prolifèrent et produisent les principaux facteurs de virulence que sont la capsule et les toxines, ce qui va conduire à la mort de l‟hôte. Après la mort de l‟animal, le sang charbonneux noir et incoagulable, caractéristique de la maladie, s‟écoule par les orifices naturels. Les bacilles se retrouvent au contact de l‟air et entament le processus de sporulation (Lindeque et Turnbull, 1994). Les spores persistent dans le sol jusqu‟à un nouveau cycle d‟infection. Chez les animaux, l‟infection se fait essentiellement par voie digestive : ingestion de viande crue ou insuffisamment cuite d’animaux morts ou malades (viande d’une origine non contrôlée). Aucun cas documenté n‟a été observé après la consommation exclusive de lait, même s’il est possible qu’un risque puisse exister (fourrages pollués, …).
L‟homme peut être infecté par contact avec des animaux ou des peaux contaminés ou par ingestion de viande contaminée. Chez l‟homme l‟infection se réalise le plus souvent par voie cutanée (maladie professionnelle) : Le plus souvent, par contact de la peau préalablement lésée ou subissant une effraction (blessure, piqûre…). L’infection peut aussi se réaliser par inhalation despores : en cas de bioterrorisme, mais le risque est nul à négligeable lors d’un contact avec un animal charbonneux, en dehors de quelques situations très particulières générant un aérosol.
Durant la période de contagiosité, il n‟y‟a pas de transmission interhumaine.
Une contamination accidentelle peut se produire par consommation de viande provenant d‟animaux abattus pendant l‟incubation ou l‟évolution du charbon.
On peut signaler des activités exposantes à savoir :
Le travail au contact d‟animaux vivants (Eleveurs, Vétérinaires…) ou morts (employés des abattoirs, les bouchers) Les professionnels qui travaillent avec la laine, les soies, les poils ou les cuirs d‟animaux possiblement infectés. Les professions en contact avec les sols contaminés (« Champs maudits ») : travaux publics etc… Les personnels de laboratoire vétérinaire : cas particulier du bioterrorisme : personnes en charge du courrier dans les entreprises ou les services postaux, mais peut prendre bien d‟autres formes.
Mode de transmission à l‟homme et facteurs de risque : Dans le contexte de transmission «naturelle », l‟homme est contaminé lors d‟exposition aux animaux malades ou aux produits animaux contaminés, par inhalation d‟un aérosol de spores pénétrant dans les alvéoles pulmonaires et transportées par la voie lymphatique dans les ganglions médiastinaux.
La germination des spores à ce niveau libère des toxines provoquant hémorragie, œdème et nécrose des tissus ; La transmission peut aussi survenir par ingestion de produits contaminés. La germination des spores puis la multiplication des bacilles libère les toxines à différents niveaux du tube digestif dont la bouche, l‟œsophage ou l‟intestin.

Caractères antigéniques

L‟antigène capsulaire : La capsule bactérienne est faite d‟une sorte d‟exsudat qui reste fixée à la bactérie de manière plus ou moins forte (« Slime layer » = couche de limon, nomée par des anglo – saxons).
L‟antigène capsulaire de Bacillus anthracisest composé d‟un polypeptide qui intervient dans la virulence de la bactérie en empêchant la phagocytose par les macrophages. Il neutralise aussi le pouvoir bactéricide du sérum et rend le sang incoagulable. Il provoque l‟élaboration d‟anticorps anticapsulaires qui n‟ont pas de pouvoir protecteur chez la souris (Handby et al.,1946 ; Leon Le Minor et al., 1989).

La capsule est codée par le plasmide PXO2 (Plasmide de virulence) de Bacillus anthracis

Les antigènes somatiques : Ils sont constitués de polysaccharides, mis en évidence par des réactions de précipitation, notamment la réaction d‟Ascoli.
La toxine : Elle entraîne la formation d‟anticorps neutralisants, jouant le rôle principal dans l‟imm unité anti charbonneuse ; L‟existence d‟une toxine charbonneuse était soupçonnée depuis très longtemps ; différentes recherches ont permis d‟en préciser la nature et les propriétés (Fish, D , et. al., 1968 ; Pezard C., et.al, , 1994)
Des communautés antigéniques entre Bacillus anthraciset d‟autres espèces de Bacillus ont été constatées (Poulet, P, 1972). Ainsi par la technique de l‟immunodiffusion en gélose, des chercheurs ont montré l‟existence de communautés antigéniques avec Bacillus cereus, B.subtilus et B. megatorium par la technique de l‟épuisement des sérums anti B.anthracis à l‟aide de suspensions de ces trois bactéries, il est possible d‟obtenir un réactif qui ne reconnaît plus que Bacillus anthracis (Michel et al., 1973).

LES FACTEURS DE VIRULENCE

B. anthracisproduit deux facteurs majeurs de virulence : une capsule et deux toxines, la toxine létale (LT, Lethal Toxin) et la toxine oedémateuse (ET, Oedema Toxin)

La capsule

Caractéristiques

La capsule produite par B. anthracis est formée d‟un polymère constitué d‟acide gamma – D glutamique (PGA) (Hanby et Rydon, 1946). Elle est singulière car les capsules bactériennes sont généralement polyosidiques. Elle a aussi la particularité d‟être composée de polymères linéaires présentant l‟énantiomère D – Glutamate uniquement, ce qui la rendrait peu immunogène (Maurer, 1965 ; Goodman et Nitecki, 1967). De plus, chez B.anthracis, le PGA présente des liaisons gamma entre ces résidus et est ainsi résistant aux protéases qui ne clivent que les liaisons alpha – aminées des protéines (Candela et Fouet, 2006). Une élimination du plasmide portant les gènes de synthèse de la capsule diminue la virulence de la bactérie chez les herbivores et l‟homme (souche Sterne). In vivo, la capsule permet à la bactérie de résister à la phagocytose et donc d‟échapper au système immunitaire (Zwartouw et Smith, 1956 ; Makino et al., 2002).

Synthèse

La synthèse de la capsule est gouvernée par l‟opéron cap BCADEsitué sur le plasmide pXO2. Les enzymes de synthèse du PGA sont codées par les gènes cap(cap B, cap C, cap A et cap E) et par le gène dep (ou cap D) (Candela et Fouet, 2005). Les fonctions des protéines Cap B, Cap C, Cap A et Cap E, ont été étudiées par comparaison avec leurs homologues chez Bacillus subtilis(Pgs B, Pgs C, Pgs A et Pgs E, respectivement) (figure 5) (Ashiuchi et al., 2001). Pgs Best impliqué dans l‟élongation du PGA et présente une activité ligase (Eveland et al.,1997 ; Urushibata et al., 2002). Les fonctions de Pgs C ne sont pas encore bien élucidées, mais un mélange de Pgs B et Pgs C possède une activité ATPase, ainsi Pgs Cparticiperait à la synthèse du PGA (Urushibata et al., 2002). Enfin une comparaison d’alignement de séquence gène dep ou capDcode pour une quatrième protéine, CapD (à l’origine appelée Dep) dont l’analyse des mutants a permis de montrer qu’elle était nécessaire à l‟ancrage covalent du PGA au peptidoglycane (Candela et Fouet, 2005). Elle présente aussi une activité dépolymérase (Makino et al., 2002) et joue donc un rôle dans la régulation de la taille de la capsule. Récemment, un nouveau peptide nécessaire à la synthèse du PGA et codé par le gène capEa été décrit (Candela et al., 2005). Ce petit peptide CapE joue probablement un rôle structural et interagissant avec CapA (voir Figure 5).

Les toxines

Aspects généraux

Les toxines du charbon sont de typeA/B où la sous unité A (activity), représentée par les facteurs oedématogènes ou létal, exerce l’activité enzymatique de la toxine, et la sous unité B (binding), représentée par l’antigène protecteur, se lie aux récepteurs membranaires.
Depuis longtemps, les capacités protectrices de l’antigène protecteur (PA, protective antigen) sont connues : le nom de PA vient de l’immunité protectrice engendrée par une immunisation avec cette protéine (Gladstone, 1946; Wright et al., 1954)
L’existence d’une substance toxique produite par la forme végétative de B. anthracisa été mise en évidence à la suite des observations de Keppie et Smith (Smith et Keppie, 1954; Keppie et al., 1955; Smith et al.,1955). Keppie et al., ont montré que la streptomycine guérit les cobayes d’une infection jusqu’à un certain seuil de concentration de bactéries dans le sang. Quand ce seuil est dépassé, les cobayes ne peuvent plus être guéris même si le nombre de bactéries est considérablement diminué (Keppie et al., 1955).
Smith et al.,ont démontré la présence d’un facteur létal dans le plasma de cobayes morts de la maladie du charbon en injectant ce plasma par voie intra – péritonéale (i.p) chez la souris ou le cobaye et en observant la mort des animaux 12 heures après l’injection (Smith et al.,1955). Ils démontrent ainsi l’existence de substances toxiques sécrétées par les bactéries dans le sang.
Après purification du facteur III, nommé par la suite facteur létal (LF, lethal factor), l’action toxique de la toxine associée (PA + LF) a pu être testée et reconnue sur les modèles animaux (Stanley et Smith, 1961; Beall et al.,1962). Plus récemment, il a été montré que la toxine participe à la virulence puisqu’une souche mutée pour le gène codant pour LFest beaucoup moins virulente chez la souris que la souche parentale Sterne (Pezard et al.,1991). Il a aussi été montré qu’une injection de 100 µg de LFpar voie intraveineuse (i.v.) ou ip chez la souris induit des lésions de type hypoxique et la mort des animaux sans syndrome inflammatoire (Moayeri et al., 2003).
De même, chez le rat, la mort induite par l’injection i;v. de 100µg de LF durant 24 heures ne résulte pas de la sécrétion de cytokines ni d’oxyde nitrique (NO) mais d’une hypertension (cui et al., 2004).
Une injection sous cutanée du facteur oedématogène (EF,edema factor) associée à PAet formant la toxine oedémateuse, induit la formation d’un oedème (Stanley et Smith, 1961), expliquant ainsi l’étymologie du nom « facteur oedématogène ». Une étude a récemment montré que EF s’avère hautement létal à plus faibles doses et plus rapidement que LFdans un modèle murin (Firoved et al.,2005). Ainsi, EFinduit de nombreuses lésions associées à la maladie du charbon. Ces lésions sont différentes de celles induites par LF et comprennent une hémorragie des ganglions lymphatiques et du tractus gastro – intestinal, ainsi qu’une nécrose de nombreux tissus incluant les organes lymphoïdes, la moelle osseuse, le coeur et les reins (Firoved et al.,2005). Une étude aaussi montré que EF peut induire une nécrose tissulaire dans un modèle Zebrafish (Voth et al.,,2005).

Caractéristiques structurales

L’antigène protecteur, PA

La protéine PA (83kDA) est codée par le gène pagA porté par le plasmide pXO1. Elle a été cristallisée en 1997 et présente 4 domaines distincts (Figure 6) (Petosa et al.,1997). Le domaine 1 N-terminal contient le site de clivage protéolytique (au niveau du résidu 167), donnant naissance aux deux sous -unités PA20 et PA63 (Brossier et Mock, 2001). La portion du domaine 1 restante (résidus 168 – 258, associés à PA63), correspond au site de fixation des facteurs létal et oedématogène (Petosa et al., 1997).
Les domaines centraux 2 (résidus 259 – 487) et 3 (résidus 488 – 596) sont respectivement impliqués dans la formation du pore : translocation des facteurs (Sellman et al., 2001) et dans l’heptamérisation de PA63 (Mogridge et al.,2001). En C-terminal, le domaine 4 (résidus 597 – 735) présente peu de contacts avec les autres domaines et est impliqué dans la liaison de PA à ses récepteurs cellulaires (Little et lowe, 1991).

Le facteur oedématogène, EF

La protéine EF (89 kDA) est codée par le gène cyaporté par le plasmide pXO1 (Robertson et al., 1988). En 1982, Leppla et al., démontrent que EF est une adénylate cyclase, induisant une augmentation incontrôlée d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) intracellulaire chez les cellules eucaryotes (Leppla, 1982). La résolution de la structure cristalline de EFa montré qu’elle ne présentait pas d’homologie structurale avec les adénylates cyclases mammifères (Drum et al., 2002).
EFest composé de trois domaines globulaires (CA, CB, et le domaine hélical) et de trois boucles flexibles (Switch A, B et C) (Figure 6a) (Drum et al., 2002).
Le domaine CA, au niveau N-terminal, possède une forte homologie de séquence avec le domaine 1 du facteur létal (Escuyer et al.,1988; Bragg et Robertson, 1989). Cette région intervient dans la fixation à l’heptamère (PA63)7 (Mourez et al., 2002).
Les interfaces des domaines CA et CB forment le site catalytique de la protéine. En C-terminal, le domaine hélical, lié à CA via un linker, correspond au site de fixation de la calmoduline (CaM) (Labruyere et al., 1990. Après fixation de la CaM, des modifications structurales au niveau desdeux domaines CA, CB et des trois boucles flexibles A, B, C permettent la fixation du substratATP (Figure 4B) (Drum et al., 2002; Mourez et al., 2002).

Le facteur létal, LF

LF est une protéine de 90kDa codée par le gène lef porté par le plasmide pXO1 (Bragg et Robertson, 1989). LF est une métalloprotéase contenant un motif HexxH de liaison au Zn2+ en résidu C-terminal (résidus 686 – 690), motif présent sur le site actif de toutes les métalloprotéases (Klimpel et al., 1994).
La structure cristallographique et l’étude de mutants (LF) montrent la présence de quatre domaines (Figure 5) (Pannifer et al., 2001). L’homologie de séquence avec le domaine CA de EF et impliquée dans la liaison de l’heptamère (PA63)7 se situe au niveau N-terminal (résidus 27 – 262) et correspond au domaine 1 de LF (Arora et Leppla, 1993). Le domaine 2 de la protéine (résidus 263 – 297 et 385 – 550) forme une poche dans laquelle vient se fixer le peptide substrat. Ledomaine 3 de LF est situé au sein du domaine 2 (résidus 298 – 384) et participe à la reconnaissance du substrat (Arora et Leppla, 1993; Pannifer et al., 2001). Ce domaine semble correspondre à une duplication imparfaite de séquences du domaine 2 (Mourez et al., 2002).

CARACTERISTIQUES DE L’INFECTION

Epidémiologie

Environ 2 000 cas humains de charbon cutané sont actuellement déclarés dans le monde chaque année. (Piroth.L, et al., 2010) Aux Etats-Unis, 409 cas ont été déclarés de 1951 à 2000, dont 18 par inhalation.
En France, depuis 2002, 4 cas d‟infections humaines de même que 61 foyers de fièvre charbonneuse animale à B. anthracisont été identifiées. En 2003, un cas de charbon cutané a été diagnostiqué chez un patient contaminé ayant manipulé de la laine de mouton en Algérie. En 2008, 3 cas de charbon cutané ont été identifiés chez des hommes adultes ayant dépecé et éviscéré une même vache charbonneuse : ces 3 cas ont évolué de manière favorable sans complications. (Piroth.L, et.al., 2010).
Quelques épidémies limitées ont été décrites en Afrique et en Asie :
Si la maladie du charbon n‟a plus un impact majeur dans les pays développés, quelques foyers sont susceptibles d‟apparaître occasionnellement dans nos pays en développement. Ainsi quatre cas ont été signalés au Sénégal et en Gambie dont deux dans la région des Niayes vache « Holstein» importée, (ferme de Wayembam) et un mouton « touabire» (ferme laitière de Wayembam) de même qu‟une autruche du parc forestier et zoologique de Hann à Dakar. Il est aussi à signaler un cas en République de Gambie chez un bovin de race « Ndama » trypanotolérante (laboratoire Central vétérinaire d‟Abuko) mort à la suite d‟infection. (Résultats du diagnostic courant LMPA, 2008, 2010).
Au Sénégal : de l‟année 2000 à l‟année 2011, une trentaine de cas d‟anthrax ont été diagnostiqués positifs, précisément au LNERV et ont concerné une vingtaine de bovins et une dizaine de petits ruminants (moutons et chèvres) dans trois principales régions à savoir celle des Niayes de Dakar, de Ziguinchor, et de la région de Saint Louis.
Des cas de charbon ont été diagnostiqués positifs par le LNERV, en 2008, 2009, 2010, 2011, 2013, 2014 sur des chevaux de certains Harras basés dans la localité de Rufisque, où des mortalités importantes ont été notées (Rapport Annuel, LNERV – ISRA, 2008, 2009, 2010, 2011, 2013, 2014).
Au Bénin, le charbon a été diagnostiqué positif par le LNERV à partir de prélèvements sanguins réalisés sur bovins de race « Borgou » localisés au niveau « des champs maudits » de certainesrégions du pays en 2009 (Rapport annuel – LNERV – ISRA).
A l‟inverse de cette infection occasionnelle, on a noté qu‟elle a été endémique dans les cheptels des pays de l‟Europe de l‟Est, du pourtour méditerranéen, de l‟Asie du Sud Est, d‟Afrique et de l‟Amérique du Sud. L‟organisation mondiale de la Santé (OMS) estime entre 100 000 et 200 000 cas humains par an (Bulletin OMS, 2012).
Les risques de voir apparaître des cas de charbon chez l‟homme et l‟animal dans les pays en développement sont liés à plusieurs facteurs notamment la méconnaissance de la maladie par les éleveurs, l‟abandon de la vaccination dans certaines zones, des raisons économiques qui mènent à ne pas rechercher de manière systématique les causes de la mort d‟animaux dans un cheptel, le non enlèvement des carcasses lors de la mort non définie et tout particulièrement en raison du coût, le non enlèvement des carcasses des petits ruminants, la reprise des abattages clandestins avec la consommation familiale de la viande, la reprise des enfouissements clandestins dans certaines localités, l‟oubli de l‟emplacement exact des « champs maudits » (emplacement de l‟enfouissement de carcasses d‟animaux contaminés) :
Ces éléments constituent ainsi des causes de résurgence possible de la maladie du charbon dans nos pays en développement.
Tous ces éléments font que la maladie du charbon reste présente dans de nombreux pays et pourrait resurgir sporadiquement au sein des cheptels des pays en voie de développement que des pays développés (Patra et al., 1998).
Depuis fin 2009, 15 cas confirmés de maladie du charbon ont été signalés chez des consommateurs d’héroïne, 14 en Ecosse et 1 en Allemagne, dont 8 mortels.
La dernière en août 2010 au Bangladesh a touché plus de 300 personnes. (Piroth.L, et.al. 2010).
Le charbon par inhalation est un cas exceptionnel. Le charbon en tant qu‟arme bactériologique a été observé en 1979, une épidémie massive de charbon d‟inhalation se déclara à Sverdlosk (exURSS) à quelques kilomètres d‟un centre militaire de recherche.
L‟épidémie liée à la diffusion accidentelle d‟un aérosol de moins d‟un gramme de spores sèches de charbon tua 68 personnes (Piroth.L, et.al., 2010).
En 2001, aux Etats-Unis, des spores du Bacillus anthracisont été intentionnellement distribuées par le système postal, causant 22 cas de charbon dont 5 décès (Piroth.L, et.al., 2010)
En milieu professionnel, des cas de charbon sont reconnus en maladie professionnelle en France au régime agricole : 1 cas en 2001, 3 en 2003, 5 respectivement en 2004 et 2005, alors qu‟aucuncas n‟a été reconnu au régime général depuis 1999.
Les CDC (Center for Diseases Control) relatent entre 1955 et 1999, 236 cas de charbon dont 65% (153) étaient rapportés au travail de la laine ou de peaux d‟animaux. Aux Etats-Unis, 18 cas ont été décrits de 1900 à 1978. La plupart sont survenus chez des professionnels de la laine ; 2 étaient des contaminations de laboratoire. D‟autres cas ont également été décrits au Royaume uni chez des trieurs de laine au début du 20éme siècle.
Enfin, on a noté des cas de charbon dus à l‟utilisation ou à la fabrication d‟instruments à percussion en cuir brut provenant d‟Asie ou d‟Afrique.

Ecologie

Habitat

Chez l’homme, la porte d’entrée la plus fréquente est constituée par de petites blessures cutanées : après 1 à 3 jours d’incubation apparaît une petite vésicule (« pustule maligne ») qui s’entoure d’une zone œdématisée où peuvent apparaître des vésicules secondaires. Il n’y a guère de suppuration, mais les vésicules se transforment en escarres recouvertes d’une croute noirâtre. À ce stade, la maladie est parfaitement curable (mortalité inférieure à 1 % des cas traités) mais si elle n’est pas reconnue, la généralisation par voie lymphatique survient après quelques jours et la septicémie devient rapidement mortelle. La porte d’entrée digestive (consommation de viande d’un animalcharbonneux) n’existe que dans les pays à hygiène déficiente.

Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ET CARACTERISTIQUES DE« BACILLUS ANTHRACIS »
I. HISTORIQUE
II. CARACTERISTIQUES BACTERIOLOGIQUES DE Bacillus anthracis
2.1 Morphologie
2.2 Culture
2.4 Germination
2.5 Cycle biologique
2.6 Caractères antigéniques
2.7 Diversité génétique des souches de Bacillus anthracis
III. LES FACTEURS DE VIRULENCE
3.1 La capsule
3.2 Les toxines
IV. CARACTERISTIQUES DE L’INFECTION
4.1 Epidémiologie
4.2 Ecologie
4.2.1 Habitat
4.2.2. Mode de transmission
4.2.3 Répartition géographique
4.3 Physiopathologie
4.4 Formes cliniques
4.4.1 Forme cutanée
4.4.2 Forme gastro intestinale
4.4.3 Forme pulmonaire
4.4.4. Anthrax injectable
V. DIAGNOSTIC DE LABORATOIRE
5.1 Prélèvements
5.2 Diagnostic bactériologique
5.3 Diagnostic moléculaire
5.4.Analyse génomique
5.5 Diagnostic sérologique
5.6 Pouvoir pathogène expérimental
VI. TRAITEMENT ET PREVENTION
6.1. Base du traitement de l’anthrax
6.2. Prévention de l’anthrax
6.2.l. Principe de la prévention
6.2.2. Les vaccins
VII. MESURES PROPHYLACTIQUES
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL 
Présentation du Travail
I. SITES D’ETUDES
1.1. Zones et périodes d’études
1.2. Cadre de l’étude
II. MATERIEL ET METHODES
2.1. Echantillonnage
2.1.1. Animaux et souches
2.1.2. Autres souches référencées : 6 souches .
2.2. Méthodologie
2.2.l. Etudes bactériologiques
2.2.2. Etudes moléculaires de Bacillus anthracis
2.2.2.l. Extraction en vue d’une PCR
2.2.2.2. PCR A TEMPS REEL
2.2.2.3. Microséquençage
2.2.2.4. Analyse génomique
III. RESULTATS
3.1. Caractéristiques générales des souches bactériennes
3.2. Etudes bactériologiques
3.2.l. Culture de Bacillus anthracis
3.2.2. Etude du pouvoir pathogène expérimental
3.3. Méthode moléculaire
3.3.1. Caractérisation moléculaire des souches (méthode PCR)
3.3.2. Microséquençage des souches
3.3.3. Analyse génomique par l’outil bio informatique
IV. DISCUSSIONS
V. CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
WEBOGRAPHIE
ANNEXE

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