Soutenance mémoire
Analyses microbiologiques du « boumkaye »
Les analyses microbiologiques sont une évaluation de la qualité sanitaire d’un produit alimentaire. Elles déterminent l’aptitude ou non, à la consommation d’un aliment suivant un seuil de contamination par mise en évidence et quantification de germes (bactéries) ou de virus. Elles vérifient également l’efficacité des procédés de stabilisation (traitement thermique, ajout de conservateur). La technique classique consiste à cultiver les germes présents dans l’échantillon analysé sur un substrat nutritif (milieu de culture), dans les conditions optimales (température d’incubation) pour qu’ils se reproduisent. Après 24 à 72 heures, les colonies de germes sont suffisamment importantes pour être identifiées et dénombrées visuellement. Il existe plusieurs milieux nutritifs spécifiques à un germe particulier, on parle de milieu sélectif. Ainsi, lors de l’incubation, se développent exclusivement les colonies de germes spécifiques au milieu utilisé. Il suffit ensuite de dénombrer ces colonies pour donner le résultat, qui est exprimé le plus souvent en nombre de germes par la quantité de produit utilisée, c’est le résultat d’une analyse quantitative. Certaines techniques, que l’on qualifie de qualitative, permettent de mettre en évidence la présence, ou l’absence, d’un germe défini sans pour autant en donner le nombre. Le résultat est exprimé par la mention « Présence » ou « Absence ».
Etude de l’activité antibactérienne
Le terme « agent antimicrobien » désigne toute substance utilisée pour détruire les microorganismes ou empêcher leur croissance, y compris, agents antibactériens. Les agents antimicrobiens sont utilisés depuis des décennies pour traiter les maladies transmissibles et prévenir les infections (CCE, 2001). Le mode d’action de ces agents sur les bactéries, peut être : Bactériostatique, lorsque la substance inhibe la multiplication des bactéries ou bactéricide : lorsque la substance détruit totalement les bactéries.
Préparation de la dilution de l’extrait végétal Afin d’évaluer l’activité antibactérienne, les différents extraits préparés (Aqueux, Infusion, Ethanolique, Méthanolique, Chloroformique, d’Acétate d’Ethyle) ainsi que le « boumkaye» proprement dit sont testés par la méthode de diffusion en milieu gélosé. 50 mg des différents extraits secs sont dissouts dans 1ml de Diméthyle Sulphoxide (DMSO). La solution ainsi obtenue est utilisée pour réaliserles tests.
Méthode de diffusion en milieu gélosé L’activité antibactérienne des différents extraits végétaux a été évaluée par la méthode de diffusion en milieu gélosé telle que décrite par Niass et al. (2016). A partir de colonies jeunes de 18 à 24 h, une suspension bactérienne a été réalisée dans l’eau distillée stérile pour chaque souche. La turbidité de cette suspension est ajustée à 0,5 Mc Farland à l’aide d’un densitomètre. On obtient alors un inoculum estimé à 106 unités formant colonie par millilitre (ufc/ml). Les boites de Pétri contenant la gélose Mueller-Hinton sont ensemencées par écouvillonnage à la surface des quelles des cylindres sont déposés. Ensuite 80 µL de chaque solution d’extrait à tester sont délicatement déposés dans les cylindres. (cf. Figure 17) Les boites de Pétri sont d’abord laissées pendant 15 minutes à la température ambiante pour une pré-diffusion des substances, avant d’être incubées à 37°C à l’étuve pendant 24 h Les cylindres sont retirés et l’activité antibactérienne est déterminée en mesurant le diamètre de la zone d’inhibition autour de chaque cylindre.
Détermination de concentration minimale inhibitrice Le bouillon Muller Hinton (MHB) est largement utilisé comme milieu standard pour la micro dilution en plaque. II permet une meilleure croissance de la plupart des bactéries pathogènes non exigeantes, en plus de son faible effet antagoniste vis-à-vis des antibiotiques (EUCAST, 2003). La microplaque à 96 puits permet de déterminer la CMI des différents extraits végétaux. Dans les puits des colonnes 1 à 12, nous avons introduit à l’aide d’une micropipette 100µL de bouillon Muller Hinton (MHB). Ensuite, 100µL de l’extrait végétal est ajouté dans le 2ème puits (qui servira de témoin négatif) et 100µL dans le 3ème puits. A partir de ce dernier, nous avons procédé à des dilutions de 100µL de puits à puits en mélangeant à l’aide d’une micropipette. Ce qui réduit les concentrations de moitié : 25 ; 12,5 ; 6,25 mg/ml etc. Chaque puits contient 100µl de bouillon et le produit testé en dilution. Ensuite, nous avons additionné 10µL de l’inoculum ajusté à 0,5 Mc Farland dans les 96 puits sauf ceux de la colonne 2 (témoin négatif). Le puits 1 sert de témoin positif (100µL du bouillon et 10µL de l’inoculum). La microplaque est couverte et incubée à 37°C de 18 à 24 heures. La lecture se fait à l’œil nu sachant que la CMI est la plus faible concentration de la substance testée à laquelle aucun trouble visuel n’est observé. (Figure 18)
Tests de sensibilité des bactéries aux différents extraits
L’activité des extraits étudiés d’Abrus fruticulosus a été évaluée par la présence ou l’absence d’inhibition de la croissance bactérienne. La présence de l’activité antibactérienne est traduite par l’apparition des zones claires autour des cylindres remplis des extraits de la liane, l’absence de l’inhibition se traduit par l’absence de zones d’inhibition autour des cylindres. Le diamètre des zones d’inhibition varie en fonction de la souche testée et la nature de la substance active présente dans les extraits. (Orhan et al., 2012). Les extraits sont testés sur quatre souches de références (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona saeruginosa, Enterococcus faecalis et une souche de shigella flexneri).
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Les plantes restent toujours la source fiable de principes actifs connus par leurs propriétés thérapeutiques. Les différentes investigations menées moment de l’enquête ont permis de comprendre que les populations rurales de la Casamance en grande majorité utilisent les lianes d’A. fruticulosus que pour la fabrication de boisson fermentée à base de mil. Caractérisation photochimique montre que A. fruticulosus est très riches en composés polyphénoliques, et stérols triterpénes. Ces composés sont des métabolites secondaires qui sont responsables de l’activité antibacterienne des extraits de cette espèce. L’évaluation in vitro des propriétés antibactériennes d’A. friticulosus a révélé une optimisation dans la boisson de boumkaye sur Escherichia coli et Shigella flexneri. A la suite de ces résultats, il serait donc intéressant d’étendre l’éventail des tests antimicrobiens sur la flore fongique ainsi que l’isolement et la caractérisation des composés actifs dans les différents extraits en vue d’identifier les différentes molécules responsables des différentes activités biologiques de cette espèce. L’action antiparasitaire signalée lors de l’enquête nécessite une investigation complémentaire dans la perspective de bien connaître les avantages que présente cette boisson.
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Table des matières
INTRODUCTION
I GENERALITES
I.1 Présentation de la région de Ziguinchor
I.2 Généralités sur Abrus sp
I.2.1 Description et caractéristiques
I.2.2 Classification botanique
I.2.3 Usage traditionnel
I.2.4 Activités pharmacologiques
I.3 Généralités sur quelques composés phénoliques
I.3.1 Les polyphénols totaux
I.3.2 Les flavonoïdes
I.3.3 Les tanins
I.3.4 Les hétérosides Anthracéniques
I.3.5 Les Stérols et Triterpènes
I.3.6 Propriétés biologiques des polyphénols
II CADRE D’ETUDE
II.1 Enquête ethnobotanique
II.2 Description et choix des localités de l’enquête
III MATERIEL ET METHODES
III.1 MATERIEL
III.1.1 Les souches bactériennes
III.1.2 Le matériel végétal
III.2 METHODES
III.2.1 Méthodologie de l’enquête ethnobotanique
III.2.2 Préparation de l’extrait d’Abrus fructiculosus
III.2.3 Procédé de fabrication du « boumkaye »
III.2.4 Fabrication du « Boumkaye »
III.2.5 Analyses phytochimiques
III.2.6 Analyses microbiologiques du « boumkaye »
III.2.7 Etude de l’activité antibactérienne
IV RESULTATS ET DISCUSSION
IV.1 RESULTATS
IV.1.1 Résultats de l’enquête ethnobotanique
IV.1.2 Résultats des Analyses phytochimiques
IV.1.3 Résultats microbiologiques du boumkaye
IV.1.4 Résultats de l’Activité antibactérienne
IV.1.5 Détermination de la concentration minimale inhibitrice
IV.2 DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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